Summary
Questo articolo si concentrerà sullo sviluppo di superfici polimeriche rivestite a lungo termine, coltura stabile di cellule staminali derivate epatociti umani.
Introduction
I materiali biologici sono stati ampiamente utilizzati per la manutenzione e la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti 1. Mentre permettendo, questi substrati biologici spesso contengono una miriade di componenti non definiti. Matrigel è un substrato comunemente usato per la cultura e la differenziazione delle cellule staminali. Purtroppo, la sua composizione variabile influenza la funzione delle cellule e fenotipo. Anche se una serie di matrici biologiche alternative, più definite sono state utilizzate 2-7, la loro origine animale o scarsa scalabilità li rende i candidati non idonei per la produzione industriale. Pertanto, l'individuazione di alternative sintetiche, a composizione definita e prestazioni affidabili, sono obiettivi chiave nella ricerca sulle cellule staminali.
Nel tentativo di superare i limiti dei indefiniti substrati di coltura cellulare, collaborazioni interdisciplinari tra chimica e biologia hanno identificato materiali sintetici con la capacità di supportare fenotipo cellulare. Synthsubstrati ETIC sono scalabili, economiche, e possono essere realizzati in strutture 3D complesse, mimando l'ambiente in vivo. Grazie a queste proprietà substrati sintetici sono stati ampiamente utilizzati per sostenere e guidare la differenziazione di molti tipi di cellule 8-10.
Test di throughput avanzate e alte hanno facilitato la rapida proiezione di materiali sintetici, dai grandi librerie, e consegnati nuovi materiali con proprietà flessibili con ampie applicazioni nella ricerca e nello sviluppo 11-13 biomedico. Utilizzando un elevato throughput, polimero tecnologia di screening micro-array, abbiamo rapidamente identificato un semplice poliuretano (PU134), adatto per la manutenzione di cellule staminali derivate epatociti umani. Questo polimero è risultato essere superiore a substrati derivati di origine animale per quanto riguarda la differenziazione e la funzione 14-16 epatociti. Abbiamo quindi ottimizzato il processo di rivestimento in condizioni, la topografia e la sterilizzazione per accedere effettisulle prestazioni del polimero nella stabilizzazione funzione degli epatociti e la durata della vita. Ciò ha implicazioni significative per quanto riguarda la comprensione fondamenti della biologia degli epatociti per la modellazione basata su cellule e applicazioni di medicina rigenerativa.
La tecnologia qui descritta costituisce un esempio di come la superficie di un polimero sintetico può essere ottimizzato per preservare fenotipo cellulare. Crediamo che la combinazione di questa tecnologia con un protocollo di differenziazione degli epatociti privo di siero efficace ha il potenziale per fornire una produzione scalabile di epatociti per l'utilizzo nella modellazione in vitro e della medicina rigenerativa.
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Protocol
1. Sintesi di PHNGAD (Poly [1,6-hexanodiol / neopentilglicole / di (glicole etilenico) Acido -ALt-adipico] diol)
Schema 1: Sintesi di PHNAGD Rappresentazione schematica della sintesi di PHNAGD.. PHNAGD è stato preparato dalla reazione di 1,6-Hexanodiol, dietilenglicole, neoppentyl glicole e acido adipico. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / neopentilglicole / di (glicole etilenico) Acido -ALt-adipico] diolo.
- Applicare trattamento termico ai monomeri 1,6-esandiolo, di (etilenglicole) e neopentilglicole a 40 ° C per 48 ore in stufa sotto vuoto per rimuovere l'acqua residua. Lasciare al freddo fino a RT sotto vuoto.
- Aggiungere 22 mmol di ciascun monomero e acido adipico (55 mmol) in un pallone a fondo tondo a due colli munito di una barra di agitazione e connesso ad un apparecchio di Dean-Stark.
- Mettere tutta l'assemblea sotto vuoto e scaldare delicatamente il glassware a 40 ° C per 6 ore, in modo da evitare l'assorbimento di umidità durante l'aggiunta della sostanza chimica nel pallone.
- Aggiungi tramite siringa, goccia a goccia, 0,0055 moli di titanio catalizzatore (IV) butossido.
- Mescolare la miscela di reazione a 180 ° C, in atmosfera N 2 per 24 ore, e raccogliere l'acqua residua nella trappola di Dean-Stark. Lasciare raffreddare il prodotto a temperatura ambiente.
2 Sintesi di PU134
Schema 2: Sintesi di PU134 Rappresentazione schematica della sintesi del poliuretano 134 PU134 è stato preparato per reazione di 1,0 equiv di un PHNGAD con 2,0 equiv di un Metilenebis 4,4-(fenil isocianato), seguita dall'aggiunta di 1,0. equiv di una catena extender 1,4-butandiolo.
- Mescolare un equivalente della PHNGAD poliolo (Mn ~ 1.800 Da, 3.2 mmol) con due equivalenti di 4'4-Metilenebis (fenil isocianato) (6,4 mmol) in anidra N, N -Dimethylformamide (12 ml).
- Mescolare la miscela di reazione a 70 ° C, in atmosfera di N 2.
- Aggiungi tramite siringa, goccia a goccia il titanio catalizzatore (IV) butossido (0,8% in peso).
- Dopo 1 ora, aggiungere uno equivalente della catena extender 1,4-butandiolo (3,2 mmol). Aumentare la temperatura a 90 ° C e agitare per 24 h in atmosfera di N 2.
- Dopo la reazione, raccogliere il poliuretano per precipitazione con l'aggiunta di etere etilico (esano o acqua potrebbe essere utilizzato anche) gocciolamento nella soluzione di reazione fino a quando si verifica la precipitazione.
- Centrifugare la soluzione a 5.300 xg per 5 min.
- Decantare il surnatante e asciugare a 40 ° C in un forno a vuoto fino a quando il solvente evapora.
Nota: Al fine di garantire che il prodotto finale della reazione possedere i corretti parametri relativi alla distribuzione dei pesi molecolari, il Grou funzionaleps del polimero, e le temperature di fusione e di transizione vetrosa, può essere utilizzato varie tecniche e metodi analitici, quali la cromatografia a permeazione di gel o spettroscopia FITR.
3 Preparazione di PU134 Solutions
- Pesare 200 mg di PU134 in una bottiglia di vetro.
- Diluire PU134 ad una concentrazione finale del 2% in diversi solventi: cloroformio, una combinazione di cloroformio e toluene in rapporto 1: 1, tetraidrofurano, e la combinazione di tetraidrofurano e diclorometano nel rapporto 1: 1.
Nota: L'elezione del solvente destra varia a seconda del polimero da utilizzare. Solventi diversi possiedono diversi punti di ebollizione che possono influenzare la solubilizzazione del polimero. - La soluzione viene agitata per 20 minuti a temperatura ambiente usando un agitatore ad una velocità di 200 mot / min, fino a quando la soluzione diventa omogenea e nessun precipitato viene osservata.
4 Rivestimento di diapositive di vetro con PU134
- Posizionare un rouDN 15 mm 2 coprioggetto sulla verniciatura giro.
- Applicare 50 ml di soluzione di PU134 per ciascuno utilizzando una pipetta. Regolare il volume della soluzione PU134 conseguenza per il formato coprioggetto desiderato mantenendo il volume di superficie rapporto proporzionale.
- Spin ogni coprioggetto per 7 secondi a 23 x g.
- Aria coprioggetto asciutto a temperatura ambiente per almeno 24 ore prima della sterilizzazione.
5. irradiazione di Coprioggetti
- Gamma-irradiare coprioggetto rivestito di polimero, applicando una dose di 10 Grays utilizzando un irradiatore laboratorio per 12 min.
- UV irradiare polimero rivestito coprioggetto utilizzando un 30 W, lampadina UV per 16 min ogni lato.
- Posizionare il coprioggetto polimero rivestito in una piastra di coltura tissutale idonea a seconda della dimensione di diapositiva.
6. Microscopia Elettronica a Scansione
- Oro cappotto polimero coprioggetto per sputtering per 200 sec in un clima di 5 x 10 -1 millibar di pressione.
- Cattura la micrographs del coprioggetto polimero rivestito utilizzando un microscopio elettronico a scansione ad una tensione di accelerazione di 20 kV in modalità di imaging elettroni secondari.
7. Osservazioni Microscopia a Forza Atomica
- Scansione un'area di 20 x 20 micron della superficie del polimero.
- Impostare una frequenza di scansione da 1,32 Hz a 1,60 Hz.
- Impostare una risoluzione di 512 x 512 pixel nella regione scansionata.
- Calcolare il Root Mean Square (RMS o Rq) del rivestimento, utilizzando la media delle deviazioni di altezza tratti dal piano dati dell'immagine media, espressa come:
Dove Zi è il valore corrente Z, e N è il numero di punti all'interno dell'area dato. - 7.5 Calcolare la deviazione o media rugosità superficiale (Ra) dell'immagine utilizzando,
Dove Z (x) è la funzione che descrive tegli superficie profilo analizzato in termini di altezza (Z) e la posizione (x) del campione sulla lunghezza valutazione "L". Ra rappresenta il valore medio della superficie rispetto al piano di mezzeria.
8 coltura cellulare e la differenziazione
- Cultura e differenziare l'umano linea di cellule staminali embrionali (hESC) H9 come descritto in Hay 17.
- Staccare cellule utilizzando un reagente dissociazione e replate su vetrini rivestiti PU134 al giorno 9 del processo di differenziazione, in presenza di un mezzo privo di siero come descritto in Szkolnicka 18,19.
Nota: L'uso di una cella di dissociazione enzimatica è preferito al distacco delle cellule fisica.
9. citocromo P450 saggio funzionale
- Misurare l'attività del CYP3A seguendo le istruzioni del produttore.
- Incubare hESC epatociti derivati al giorno 13 o il giorno 19, e dei media, senza cellule - come controllo negativo, con il substr appropriatomangiato per 5 ore a 37 ° C.
- Raccogliere surnatanti di cellule e dei media, eseguire il test secondo le istruzioni del produttore.
- Misurare il livello di attività CYP e relativa normalizzata alla superficie (cm 2).
10 Immunostaining
- Lavare hESC derivato epatociti con PBS, per 1 min, ripetere due volte.
- Aggiungere il ghiaccio freddo 100% di metanolo per riparare le cellule, posto in -20 ° C per 10 min.
- Lavare le cellule con PBS per 5 minuti e ripetere due volte.
- Incubare le cellule con PBS / T (0,1% Tween) / 10% BSA per 1 ora a RT.
- Aspirare la soluzione PBST e aggiungere l'anticorpo primario appropriato diluito in PBS / T (0,1% di Tween) / 1% BSA, incubare a 4 ° C con agitazione O / N.
- Lavare le cellule con PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA per 5 min e ripetuto tre volte.
- Diluire l'anticorpo appropriato in PBS / T (0,1% di Tween) / 1% BSA, aggiungere alle cellule e incubare al buio a temperatura ambiente per 1 ora con agitazione.
- Lavare le cellule con PBS per 5 minuti e ripetere per tre volte.
- Aggiungi Mowiol 488 (contenente DAPI 1: 1.000) per ciascun bene, aggiungere un coprioggetto delicatamente per ridurre il numero di bolle d'aria. Conservare le cellule fissato a 4 ° C al buio. Osservare colorazione utilizzando un microscopio con appositi filtri e lampada fluorescente. Gli anticorpi primari e secondari ottimizzati sono elencati nella Tabella 1.
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Representative Results
Solvente del polimero influenza la topografia della superficie del polimero rivestito
Poliuretano 134 è stato solubilizzato in cloroformio, da solo o in combinazione con toluene o tetraidrofurano o diclorometano ei vetrini spin-rivestiti con le diverse formulazioni. Microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia a forza atomica (AFM) sono stati usati per caratterizzare le proprietà fisiche dei rivestimenti polimerici (Figura 1). Il rivestimento ottenuto usando toluene o cloroformio non era omogenea, dimostrando un rivestimento irregolare con PU134 precipitazioni (Figura 1A). Al contrario, tetraidrofurano era un solvente adatto permettendo di spin coating di una più uniforme superficie (Figura 1A). Topografia superficiale è stata misurata mediante AFM usando la radice quadrata media (RMS) e la rugosità media (Ra). PU134 tetraidrofurano disciolto mostrato una riduzione del 40% della rugosità in confronto a thE altri solventi (Figura 1B e 1C). Questi dati dimostrano che l'uso di tetraidrofurano come solvente fornisce un rivestimento più uniforme PU134 per applicazioni biologiche.
Topografia polimero ha un impatto significativo sulla funzione degli epatociti
hESC può essere efficacemente differenziata per endoderma epatica in vitro, che possiede molte delle funzioni presenti nel fegato adulto 17-20. Differenziazione endoderma epatica è stata indotta e in occasione della Giornata 9 celle hepatoblast-simili erano evidenti, con la maggior parte delle cellule che esprimono citocheratina 19 (99% ± 1.2), α-fetoproteina (99% ± 0.6), ed epatica fattore nucleare 4α (97% ± 2.6); e bassi livelli di albumina (20% ± 1.7) (Figura 2). A questo punto le cellule sono state staccate con TrypLE esprimere e ripiastrate sulle diverse superfici polimeriche rivestite. Come misura di funzione metabolica, citocromo P450 funzione è stata valutata 4 giorni dopo la replating. Abbiamo osservato un aumento di 2 volte in attività metabolica nelle cellule ripiastrate il tetraidrofurano / PU134 superfici rivestite (Figura 3). Questi risultati dimostrano che cellule staminali embrionali umane derivate attività metabolica degli epatociti è migliorata con un rivestimento più uniforme di PU134, questo è coerente con la precedente si avvicina 21.
Impatti sterilizzazione di superficie sulle proprietà bioattive del polimero
È stato anche studiato l'effetto della sterilizzazione sulle prestazioni PU134. Polymer vetrini rivestiti sono stati esposti a raggi gamma o raggi UV. Fase di imaging contrasto di vetrini rivestiti PU134 non ha mostrato differenze lordi inviare raggi gamma (Figura 4A) o UV. Queste osservazioni sono state ulteriormente confermate da analisi SEM (Figura 4B). Le prestazioni biologica di PU134 è stata esaminata usando epatociti cellule staminali embrionali umane derivate a 10 giorni dopo replating. hESC derivatiepatociti ripiastrate su vetrini rivestiti PU134 γ-irradiate visualizzato un aumento di 3 volte nel corso dell'attività del CYP3A cellule ripiastrate su vetrini rivestiti PU134-UV irradiata (Figura 4C). Queste osservazioni hanno dimostrato che gamma-irradiazione era la tecnica di sterilizzazione ottimale per i nostri scopi.
Figura 1 Ottimizzazione della superficie rivestita di poliuretano 134. Vetrini (A) di vetro sono stati rivestiti con una soluzione al 2% di PU134 disciolto in solventi diversi. Scanning Electron Microscopy (SEM) immagini dei vari vetrini rivestiti mostrano la presenza di una superficie rivestita omogenea e l'assenza di polimero precipitati quando tetraidrofurano è stato usato in confronto con toluene, cloroformio o miscele di solventi (nero e frecce bianche). Le immagini sono state scattate a x1664 ingrandimenti e scale bar ar e illustrato di seguito le immagini. (BC) microscopia a forza atomica (AFM) è stato impiegato per analizzare la rugosità delle superfici rivestite PU134 riguardanti i solventi selezionati. Analisi dei parametri di rugosità RMS (radice quadratica media) (B) e Ra (la rugosità media) (C) delle diverse superfici rivestite PU134 dimostrare che il rivestimento ottenuto usando tetraidrofurano come solvente ha la superficie più regolare rispetto al resto delle condizioni (n = 7). I dati sono espressi come media ± deviazione standard, p <0,05 è denotato *, p <0.01 è indicata con **, e p <0,001 è denotato ***, misurata da studenti t-test rispetto ai vetrini rivestiti con PU134 solubilizzati in tetraidrofurano. Le barre di errore rappresentano 1 deviazione standard. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2 Caratterizzazione dei hepatoblasts hESC derivati. Immunocitochimica mostrando espressione di marcatori epatici AFP, CK19, HNF4α e albumina nel hESC (H9) derivato endoderma epatica. I controlli negativi sono stati eseguiti con corrispondente immunoglobulina G (IgG) e immagini rappresentative sono mostrate. La percentuale di cellule positive e deviazione standard sono stati stimati da almeno cinque campi aleatori di vista contenenti almeno 300 cellule per view. Le immagini sono state scattate a 20X di ingrandimento. I dati sono espressi come media ± sd errore barre rappresentano 1 deviazione standard. HNF4α, epatociti fattore nucleare 4α; AFP, α-fetoproteina; ALB, Albumina; CK19, citocheratina 19, IgG di capra, Immunoglobulina G anti-capra, IgG di topo, Immunoglobulina G anti-topo. Clicca qui per visualizzare un più ampio versisu di questa figura.
Figura 3. implicazioni funzionali della topografia della superficie rivestita PU134 sulla funzione degli epatociti hESC derivati. Misura dell'attività del citocromo P450 3A su epatociti hESC-derivato mantenuto per 96 ore su vetrini rivestiti con PU134 disciolto in solventi diversi. Un miglioramento nella dell'attività citocromo su cellule mantenute in PU134 vetrini rivestiti solubilizzati con tetraidrofurano (n = 6). I dati sono espressi come media ± deviazione standard, p <0,05 è denotato *, p <0.01 è denotato **, e p <0,001 è denotato ***, misurata da studenti t-test rispetto agli epatociti hESC derivate mantenuti su vetrini rivestiti con PU134 solubilizzato in tetraidrofurano. Le barre di errore rappresentano 1 deviazione standard.
Immagini Figura 4 Ottimizzare la sterilizzazione delle superfici rivestite. Contrasto di fase (A) o immagini SEM (B) non mostrano differenze lorde in superficie rivestita PU134 tra γ-radiazioni o alle radiazioni UV (UV) trattamenti. Immagini a contrasto di fase sono state prese a 40X di ingrandimento e SEM immagini a 1,664X ingrandimento. (C) Analisi dell'attività del citocromo P450 3A su hESC epatociti derivati mantenuto per 10 giorni su vetrini rivestiti PU134. Un aumento dell'attività del citocromo P450 3A in cellule ripiastrate su vetrini rivestiti PU134 γ-irradiate rispetto alle cellule ripiastrate UV irradiata su vetrini rivestiti PU134. Unità di attività sono espressi come unità di luce relativa (RLU) ml -1 cm -2 di superficie cultura (n = 3). I dati sono espressi come media ± deviazione standard, p <0.001 is indicato *** misurata dagli studenti t-test rispetto agli epatociti hESC derivate mantenuti su vetrini rivestiti PU134 sterilizzati da γ-radiazioni. Le barre di errore rappresentano 1 deviazione standard. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Anticorpi primari | |||
| Antigene | Tipo | Azienda | Diluizione |
| HNF4α | Policlonale di coniglio | Di Santa Cruz | 1/100 |
| Albumina | Monoclonale murino | Sigma | 1/500 |
| AFP | Monoclonale murino | Abcam | 1/500 |
| La citocheratina 19 | Monoclonale murino | Dako | 1/50 |
| IgG | Monoclonale murino | Dako | 1/500 |
| Anticorpi secondari | |||
| Anti-rabbit 568 Alexa Farina | Capricorno | Invitrogen | 1/400 |
| Anti-topo 488 Alexa Farina | Coniglio | Invitrogen | 1/500 |
Tabella 1 Elenco dei ottimizzati anticorpi e concentrazioni primari e secondari utilizzati in questo studio. HNF4α, epatociti fattore nucleare 4α; AFP, α-fetoproteina; IgG, immunoglobuline G.
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Discussion
Molti dei metodi attualmente utilizzati per generare epatociti da cellule staminali si basano su matrici indefinite di origine animale. Questi supporti possono essere costosi e molto variabile, che colpisce la funzione delle cellule e la stabilità, che rappresentano una barriera significativa applicazione. Pertanto, abbiamo effettuato una schermata per materiali sintetici che supportano la cultura di cellule staminali epatociti derivati. Abbiamo identificato, un semplice poliuretano (PU134), formata da polimerizzazione PHNGAD, MDI e un extender, che in combinazione con un approccio robusto differenziazione degli epatociti, stabilizza il fenotipo epatociti e migliora la funzione delle cellule quando confrontato con matrigel 15.
Manipolazione di cellule staminali matrici biologiche, comunemente utilizzati in coltura esistenti e di differenziazione, quali vitronectina 22, laminina 521 23 o matrigel, è efficace per la manutenzione a breve termine. Al contrario, le superfici rivestite PU134 forniscono un substrato superiore per hepatocycultura te. Inoltre, l'ottimizzazione della topografia di superficie e la sterilizzazione del polimero hanno portato a ulteriori miglioramenti nelle prestazioni delle cellule, un fattore chiave nella realizzazione di modelli di fegato umano in scala con prestazioni affidabili.
La natura del estensore di catena e fenil isocianato rappresenta una delle fasi critiche del processo; l'eliminazione o la sostituzione di uno dei componenti potrebbe compromettere in modo significativo la superficie del polimero e l'attaccamento quindi il cellulare e l'attività funzionale di cellule staminali epatociti derivati. La composizione del polimero influisce parametri fisici quali elasticità e bagnabilità 24, che ha un impatto la capacità del polimero di assorbire proteine della matrice extracellulare chiave coinvolti nella funzione degli epatociti. Inoltre, variazioni nel catalizzatore, tempo di reazione e la temperatura influenzano la distribuzione del peso molecolare del polimero.
La scelta del solvente per solubilizzare il polimero ripresenta un punto critico nell'ottenimento di una superficie del polimero rivestito ottimizzata. Abbiamo osservato che la natura del solvente influenza la topografia della superficie rivestita, che ha implicazioni dirette nella funzione delle cellule 25-31. Inoltre, il tempo e la velocità di filatura sono anche cruciali per ottenere questo rivestimento uniforme ed omogenea. Un altro passo a prendere in considerazione è la procedura di sterilizzazione applicato sulla superficie del polimero rivestito, come l'attività delle cellule può essere influenzata dal trattamento di sterilizzazione utilizzato. Ciò può essere dovuto alla presenza di area sensibile (s) all'interno della struttura del polimero di diverse procedure di sterilizzazione 32-34.
I modelli attuali di cellule staminali pluripotenti basate sulle cellule possiedono fenotipiche e limitazioni funzionali. Noi crediamo che questo polimero ottimizzato superficie rivestita rappresenta un progresso nel campo, aggirando alcune delle limitazioni associate con l'uso di subst biologicotassi. Inoltre, la possibilità di utilizzare il polimero all'interno 3D matrici per sostenere il fissaggio di diversi tipi cellulari presenti nel tessuto di interesse, può migliorare ulteriormente la fedeltà cella.
In conclusione, l'uso di materiali sintetici sta diventando sempre più importante nella consegna del soma umano da cellule staminali pluripotenti. Abbiamo sviluppato una procedura di superfici e rivestimento ottimizzato che è robusto e garantisce in modo affidabile epatociti umani funzionali con implicazioni significative per la modellazione basata su cellule e medicina rigenerativa.
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Disclosures
DCH è CSO, direttore, fondatore e azionista di FibromEd Products Ltd. MB e JPI sono soci fondatori in FibromEd Products Ltd.
Acknowledgments
DCH, MB e FK sono stati sostenuti da un EPSRC Segui su Fund. BL-V e DS sono stati supportati da ogni MRC borse di dottorato di ricerca. KC è stato sostenuto da un finanziamento della piattaforma di Medicina Rigenerativa Regno Unito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips | |||
| Shaker | Edmun Bühler | KS-15 | |
| Irradiator | CIS Biointernational | IBL 637 | |
| Spin coater | Specialty Coating System | P-6708 | |
| Scanning Electron Microscope | Philips | XL30CPSEM | |
| Atomic Force Microscope | DimensionV Nanoscope, VEECO | ||
| p4-GLO CYP3A4 | Promega | V8902 | |
| UV bulb | ESCO | ||
| NanoScope analysis software | VEECO | version 1.20 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | TH45200 | Use Volocity 4 Software |
| Tissue culture plates | Corning, UK | 3527 | |
| glass slides | Scientific Laboratory Supplies | MIC3308 | |
| Diethylene glycol | Sigma–Aldrich | 93171 | |
| 1,6-hexanediol | Sigma–Aldrich | 240117 | |
| Neopentyl glycol | Sigma–Aldrich | 408255 | |
| Adipic acid | Sigma–Aldrich | 9582 | |
| anhydrous N,N-Dimethylformamide | Sigma–Aldrich | 227056 | |
| Diethyl ether | Sigma–Aldrich | 676845 | |
| titanium (IV) butoxide | Sigma–Aldrich | 244112 | |
| 1,4-butanediol | Sigma–Aldrich | 493732 | |
| Vacuum oven | Thermoscientific | ||
| 4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) | Sigma–Aldrich | 101688 | |
| Tetrahydrofurane | Sigma–Aldrich | 401757 | |
| Sputter coater | Bal-Tec SCD 050 | ||
| Inmunostaining | |||
| Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) | Gibco | 10010031 | Store at room temperature |
| PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 | Scientific Laboratory Supplies Ltd | EC607 | |
| Methanol | Scientific Laboratory Supplies Ltd | CHE5010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, UK | A7906 | |
| MOWIOL 488 DAPI | Calbiochem | 475904 | Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions |
| Cell culture and Functional assay | |||
| CYP3A activity pGLO kit | Promega | V8902 | |
| Hepatozyme | Gibco | 17705021 | |
| TryLE express | Life Technologies | 12604013 | |
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