Summary

Optimize Sentetik Yüzeyler Hepatosellüler Fenotip kullanma Stabilize

Published: September 26, 2014
doi:

Summary

Bu makalede, uzun vadede polimer kaplı yüzeylere geliştirilmesi üzerinde durulacak, kök hücre istikrarlı kültür, insan hepatositleri türetilmiş.

Abstract

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing and maintaining primary and pluripotent stem cell derived hepatocytes. While biological matrices are useful, they permit short term culture of hepatocytes, limiting their widespread application. We have attempted to overcome the limitations using a synthetic polymer coating. Polymers represent one of the broadest classes of biomaterials and possess a wide range of mechanical, physical and chemical properties, which can be fine-tuned for purpose. Importantly, such materials can be scaled to quality assured standards and display batch-to-batch consistency. This is essential if cells are to be expanded for high through-put screening in the pharmaceutical testing industry or for cellular based therapy. Polyurethanes (PUs) are one group of materials that have shown promise in cell culture. Our recent progress in optimizing a polyurethane coated surface, for long-term culture of human hepatocytes displaying stable phenotype, is presented and discussed.

Introduction

Biyolojik maddeler, yaygın olarak, pluripotent kök hücreleri 1 bakım ve farklılaşması kullanılmıştır. Sağlarken, bu biyolojik substratların tanımlanmamış bileşenlerin sayısız içerir. Matrigel kök hücre kültürü ve farklılaşması için yaygın olarak kullanılan bir alt-tabakadır. Ne yazık ki, değişken bileşim hücre fonksiyonu fenotipi etkiler. Alternatif, daha tanımlı biyolojik matris çeşitli 2-7 kullanılıyor olsa, onların hayvansal kökenli veya kötü ölçeklenebilirlik onlara endüstriyel üretimi için uygun bir aday haline getiriyor. Bu nedenle, kök hücre araştırmalarında önemli hedefler tanımlanır kompozisyon ve güvenilir performansı ile sentetik alternatifleri, kimlik vardır.

Tanımsız hücre kültürü yüzeylerin sınırlamaları aşmak için bir girişim, kimya ve biyoloji arasında disiplinler arası işbirliği hücre fenotipi desteklemek için kapasite ile sentetik malzemeler tespit ettik. Synthetik yüzeyler, etkili ölçeklenebilir maliyet ve in vivo ortamda taklit, karmaşık 3D yapılarına imal edilebilir. Bu özelliklere bağlı olarak, sentetik alt-tabakalar, çoğu hücre tipinde yaygın olarak 8-10 farklılaşmasını desteklemek ve sürmek için kullanılmıştır.

Gelişmiş ve yüksek kapasiteli testler büyük kütüphanelerinden, sentetik malzemelerin hızlı tarama kolaylaştırdı ve biyomedikal araştırma ve geliştirme 11-13 geniş uygulamaları ile esnek özelliklere sahip yeni malzemeler teslim ettik. Yüksek verim, polimer mikro-dizi tarama teknolojisini kullanarak, hızla insan kök hücresi elde edilen hepatositlerin bakımı için uygun olan basit bir poliüretan (PU134), tespit. Bu polimer, hepatosit farklılaşımı ve fonksiyon 14-16 ile ilgili olarak, hayvan kaynaklı alt tabakalara üstün olduğu bulunmuştur. Biz sonradan etkilerini erişmek için kaplama koşulları, topografya ve sterilizasyon işlemini optimizehepatosit fonksiyonları ve ömrünü stabilize polimer performansı. Bu hücre tabanlı modelleme ve rejeneratif tıp uygulamalarında hepatosit biyolojinin temel anlayış açısından önemli etkileri vardır.

Burada anlatılan teknoloji sentetik bir polimerin yüzey hücre fenotipi korumak için optimize edilebilir nasıl bir örneğini temsil eder. Verimli bir serumsuz hepatosit farklılaşma protokol ile bu teknolojinin kombinasyonu in vitro olarak modelleme ve rejeneratif tıpta kullanım için hepatosit ölçeklenebilir üretim sağlamak için bir potansiyele sahip olduğuna inanıyoruz.

Protocol

PHNGAD (poli [1,6-hexanodiol / neopentil glikol / di (etilen glikol) -Alt-adipik asit] dio) 1. sentezi Şema 1: PHNAGD sentezi PHNAGD sentezinin şematik gösterimi.. PHNAGD 1,6-Hexanodiol reaksiyonu, dietilen glikol, neoppentyl glikol ve adipik asit ile hazırlandı. PHNAGD, poli [1,6-hexanodiol / neopentil glikol / di (etilen glikol) -Alt-adipik asit] dio. H…

Representative Results

Polimer çözücü polimer kaplanmış bir yüzey topografisi etkiler Poliüretan 134 tek başına ya da toluen ya da tetrahidrofuran ya da diklorometan ve cam slaytlar farklı formülasyonlar ile kaplı dönüşü ile kombinasyon halinde, kloroform içinde çözüldü. Tarama elektron mikroskopi (SEM) ve atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) (Şekil 1) polimer kaplamaların fiziksel özelliklerini karakterize etmek için kullanıldı. Toluen veya kloroform kulla…

Discussion

Kök hücrelerden hepatositleri üretmek için kullanılan mevcut yöntemlerin çoğu hayvan menşeli tanımlanmamış matrisler dayanır. Bu alt-tabakalar uygulama için önemli bir engel temsil eden hücre fonksiyonu ve stabilitesini etkileyen, pahalı ve son derece değişken olabilir. Bu nedenle, kök hücre elde edilen hepatositlerin kültürünü destekleyen sentetik malzemeler için bir ekran ısırttı. Biz belirledik, sağlam bir hepatosit farklılaşma yaklaşımı ile kombinasyon halinde PHNGAD, MDI ve bir ge…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

YSS, MB ve FK Fonuna ilişkin EPSRC Takip tarafından desteklenmiştir. BL-V ve DS her MRC Doktora Studentships tarafından desteklenmiştir. KC İngiltere Rejeneratif Tıp Platformu fon tarafından desteklenmiştir.

Materials

Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips
Shaker Edmun Bühler KS-15
Irradiator CIS Biointernational IBL 637 
Spin coater Specialty Coating System  P-6708
Scanning Electron Microscope  Philips XL30CPSEM
Atomic Force Microscope DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4 Promega V8902
UV bulb ESCO
NanoScope analysis software VEECO version 1.20
Fluorescence microscope Olympus TH45200 Use Volocity 4 Software
Tissue culture plates Corning, UK  3527
glass slides Scientific Laboratory Supplies MIC3308
Diethylene glycol Sigma–Aldrich 93171
 1,6-hexanediol Sigma–Aldrich 240117
Neopentyl glycol Sigma–Aldrich 408255
Adipic acid Sigma–Aldrich 9582
anhydrous N,N-Dimethylformamide Sigma–Aldrich 227056
Diethyl ether Sigma–Aldrich 676845
titanium (IV) butoxide  Sigma–Aldrich 244112
1,4-butanediol  Sigma–Aldrich 493732
Vacuum oven Thermoscientific
4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) Sigma–Aldrich 101688
Tetrahydrofurane Sigma–Aldrich 401757
Sputter coater Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) Gibco 10010031  Store at room temperature
PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20    Scientific Laboratory Supplies Ltd EC607 
Methanol   Scientific Laboratory Supplies Ltd CHE5010
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich, UK A7906
MOWIOL 488 DAPI Calbiochem 475904 Made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions
Cell culture and Functional assay
CYP3A activity pGLO kit Promega V8902
Hepatozyme Gibco 17705021
TryLE express Life Technologies 12604013

References

  1. Zhou, W., et al. SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function. J Cell Sci. 125 (15), 3630-3635 (2012).
  2. Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
  3. Shanbhag, M. S., et al. Neural Progenitor Cells Grown on Hydrogel Surfaces Respond to the Product of the Transgene of Encapsulated Genetically Engineered Fibroblasts. Biomacromolecules. 11 (11), 2936-2943 (2010).
  4. Battista, S., et al. The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation. Biomaterials. 26 (31), 6194-6207 (2005).
  5. Tian, W. M., et al. Hyaluronic acid hydrogel as Nogo-66 receptor antibody delivery system for the repairing of injured rat brain: in vitro. Journal of Controlled Release. 102 (1), 13-22 (2005).
  6. Keshaw, H., Forbes, A., Day, R. M. Release of angiogenic growth factors from cells encapsulated in alginate beads with bioactive glass. Biomaterials. 26 (19), 4171-4179 (2005).
  7. Baharvand, H., Hashemi, S. M., Kazemi Ashtiani, S., Farrokhi, A. Differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 50 (7), 645-652 (2006).
  8. Cameron, K., Travers, P., Chander, C., Buckland, T., Campion, C., Noble, B. Directed osteogenic differentiation of human mesenchymal stem/precursor cells on silicate substituted calcium phosphate. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (1), 13-22 (2013).
  9. Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays. Biomedical Materials. 3 (3), 034112 (2008).
  10. Li, Z., Guo, X., Matsushita, S., Guan, J. Differentiation of cardiosphere-derived cells into a mature cardiac lineage using biodegradable poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. Biomaterials. 32 (12), 3220-3232 (2011).
  11. Tare, R. S., Khan, F., Tourniaire, G., Morgan, S. M., Bradley, M., Oreffo, R. O. C. A microarray approach to the identification of polyurethanes for the isolation of human skeletal progenitor cells and augmentation of skeletal cell growth. Biomaterials. 30 (6), 1045-1055 (2009).
  12. Khan, F., Tare, R. S., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C., Bradley, M. Strategies for cell manipulation and skeletal tissue engineering using high-throughput polymer blend formulation and microarray techniques. Biomaterials. 31 (8), 2216-2228 (2010).
  13. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nature Communications. 4 (1335), (2013).
  14. Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (7), 505-509 (2013).
  15. Hay, D. C., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).
  16. Lucendo-Villarin, B., Khan, F., Pernagallo, S., Bradley, M., Iredale, J. P., Hay, D. C. Maintaining hepatic stem cell gene expression on biological and synthetic substrata. BioResearch Open Access. 1 (1), 50-53 (2012).
  17. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (34), 12301-12306 (2008).
  18. Szkolnicka, D., Zhou, W., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell–Derived Hepatocytes: Potential and Challenges in Pharmacology. Annu Rev Pharmecol Toxicol. 53, 147-149 (2013).
  19. Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Translational Medicine. 3 (2), 141-148 (2014).
  20. Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  21. Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Culture of organized cell communities. Advanced Drug Delivery Reviews. 33 (1-2), 15-30 (1998).
  22. Braam, S. R., et al. Recombinant Vitronectin Is a Functionally Defined Substrate That Supports Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal via αVβ5 Integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
  23. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5 (3195), (2014).
  24. Thaburet, J. -. F. O., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromolecular Rapid Communication. 25 (1), 336-370 (2003).
  25. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell Sensing and Response to Micro- and Nanostructured Surfaces Produced by Chemical and Topographic Patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  26. Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116 (10), 1881-1892 (2003).
  27. Biggs, M. J. P., Richards, R. G., Wilkinson, C. D. W., Dalby, M. J. Focal adhesion interactions with topographical structures: a novel method for immuno-SEM labelling of focal adhesions in S-phase cells. Journal of Microscopy. 231 (1), 28-37 (2008).
  28. Karuri, N. W., Porri, T. J., Albrecht, R. M., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Nano- and microscale holes modulate cell-substrate adhesion, cytoskeletal organization, and -beta1 integrin localization in SV40 human corneal epithelial cells. IEEE Transactions on Nanobioscience. 5 (4), 273-280 (2006).
  29. Hamilton, D. W., Brunette, D. M. The effect of substratum topography on osteoblast adhesion mediated signal transduction and phosphorylation. Biomaterials. 28 (1), 1806-1819 (2007).
  30. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  31. Dang, J. M., Leong, K. W. Myogenic Induction of Aligned Mesenchymal Stem Cell Sheets by Culture on Thermally Responsive Electrospun Nanofibers. Advanced Materials. 19 (19), 2775-2779 (2007).
  32. Azevedo, E. C., Nascimento, E. M., Chierice, G. O. UV and gamma irradiation effects on surface properties of polyurethane derivate from castor oil. Polímeros. 23 (3), 305-311 (2013).
  33. Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A. Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169 (2), 177-185 (2005).
  34. Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests. Polymer Degradation and Stability. 77 (1), 103-109 (2002).

Play Video

Cite This Article
Lucendo-Villarin, B., Cameron, K., Szkolnicka, D., Travers, P., Khan, F., Walton, J. G., Iredale, J., Bradley, M., Hay, D. C. Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces. J. Vis. Exp. (91), e51723, doi:10.3791/51723 (2014).

View Video