Summary
Este artículo se centrará en el desarrollo de superficies de polímero recubierto de largo plazo, la cultura estable de células madre derivadas de hepatocitos humanos.
Introduction
Los materiales biológicos han sido ampliamente utilizados en el mantenimiento y diferenciación de células madre pluripotentes 1. Al tiempo que permite, estos sustratos biológicos a menudo contienen una gran cantidad de componentes no definidos. Matrigel es un sustrato comúnmente utilizado para el cultivo de células madre y la diferenciación. Desafortunadamente, su composición variable influye en la función celular y el fenotipo. Aunque una variedad de matrices biológicas alternativas, más definidos se han utilizado 2-7, su origen animal o pobre escalabilidad les hace candidatos inadecuados para la fabricación industrial. Por lo tanto, la identificación de alternativas sintéticas, con composición definida y un rendimiento fiable, son objetivos clave en la investigación de células madre.
En un intento de superar las limitaciones de los sustratos de cultivo de células definidos, colaboraciones interdisciplinarios entre la química y la biología han identificado materiales sintéticos con la capacidad de soportar el fenotipo celular. Synthsustratos etic son escalables, rentables, y se pueden fabricar en complejas estructuras 3D, imitando el entorno en vivo. Debido a estas propiedades sustratos sintéticos han sido ampliamente utilizados para apoyar y conducir la diferenciación de muchos tipos de células 8-10.
Ensayos avanzados y de alto rendimiento han facilitado la rápida detección de los materiales sintéticos, de grandes bibliotecas, y entregado nuevos materiales con propiedades flexibles con amplias aplicaciones en la investigación y el desarrollo 11-13 biomédica. La utilización de un alto rendimiento, tecnología de tramado polímero micro-array, identificamos rápidamente en un sencillo de poliuretano (PU134), adecuado para el mantenimiento de los hepatocitos derivados de células madre humanas. Este polímero se encontró que era superior a sustratos derivados de animales con respecto a la diferenciación y la función de los hepatocitos 14-16. Hemos optimizado posteriormente el proceso de condiciones de recubrimiento, la topografía y la esterilización para acceder a efectosen el rendimiento del polímero en la estabilización de función de los hepatocitos y la vida útil. Esto tiene implicaciones significativas en cuanto a la comprensión de los fundamentos de la biología de los hepatocitos para el modelado basado en células y aplicaciones de medicina regenerativa.
La tecnología aquí descrita representa un ejemplo de cómo la superficie de un polímero sintético puede ser optimizado para preservar el fenotipo celular. Creemos que la combinación de esta tecnología con un protocolo de diferenciación de hepatocitos sin suero eficiente tiene el potencial de proporcionar una producción escalable de hepatocitos para su uso en modelado in vitro y la medicina regenerativa.
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Protocol
1 Síntesis de PHNGAD (Poli [1,6-hexanodiol / neopentil glicol / di (etilenglicol)-ácido adípico -alt] diol)
Esquema 1: Síntesis de PHNAGD Representación esquemática de la síntesis de PHNAGD.. PHNAGD se preparó por la reacción de 1,6-Hexanodiol, dietilenglicol, neoppentyl y ácido adípico. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / neopentil glicol / di (etilenglicol)-ácido adípico -alt] diol.
- Aplicar un tratamiento térmico a los monómeros de 1,6-hexanodiol, di (etilenglicol) y neopentilglicol a 40 ° C durante 48 horas en un horno de vacío para eliminar el agua residual. Permitir al frío a temperatura ambiente bajo vacío.
- Añadir 22 mmol de cada monómero y ácido adípico (55 mmol) a un matraz de fondo redondo de dos bocas, equipado con una barra de agitación y conectado a un aparato de Dean-Stark.
- Coloque todo el conjunto bajo un vacío y calentar suavemente el glassware a 40 ° C durante 6 horas, con el fin de evitar cualquier absorción de humedad durante la adición de la sustancia química en el matraz.
- Añadir medio de una jeringa, gota a gota, 0,0055 mol del catalizador de titanio (IV) butóxido de potasio.
- Se agita la mezcla de reacción a 180 ° C, bajo una atmósfera de N2 durante 24 horas, y recoger el agua residual en la trampa Dean-Stark. Deje que el producto se enfríe a temperatura ambiente.
2 Síntesis de PU134
Esquema 2: Síntesis de PU134 Representación esquemática de la síntesis de poliuretano 134. PU134 se preparó por la reacción de 1,0 equivalentes de un PHNGAD con 2,0 equiv de un 4,4 '-metilenbis (isocianato de fenilo), seguido por la adición de 1,0. equiv de un extensor de cadena de 1,4-butanodiol.
- Mezclar un equivalente de la PHNGAD poliol (Mn ~ 1800 Da, 3,2 mmol) con dos equivalentes de 4'4-metilenbis (isocianato de fenilo) (6,4 mmol) en N, N-dimetilformamida (12 ml).
- Se agita la mezcla de reacción a 70 ° C, bajo una atmósfera de N2.
- Añadir medio de una jeringa, gota a gota el catalizador de titanio (IV) butóxido de potasio (0,8% en peso).
- Después de 1 hora, añadir un equivalente del prolongador de cadena de 1,4-butanodiol (3,2 mmol). Aumentar la temperatura a 90 ° C y se agita durante 24 h bajo una atmósfera de N2.
- Después de la reacción, recoger el poliuretano por precipitación por adición de éter dietílico (hexano o el agua también podría ser utilizado) gota a gota a la solución de reacción hasta que se produce la precipitación.
- Centrifugar la solución a 5.300 xg durante 5 min.
- Decantar el sobrenadante y secar a 40 ° C en un horno de vacío hasta que el disolvente se evapora.
Nota: Con el fin de garantizar que el producto final de la reacción poseen los parámetros correctos con respecto a la distribución de peso molecular, los principales grupos funcionalesps del polímero, y las temperaturas de fusión y de transición vítrea, diversas técnicas y métodos de análisis se puede utilizar, tal como cromatografía de permeación en gel o espectroscopia FITR.
3 Preparación de Soluciones PU134
- Pesar 200 mg de PU134 en una botella de vidrio.
- Diluir PU134 a una concentración final de 2% en una serie de disolventes: cloroformo, una combinación de cloroformo y tolueno en proporción 1: 1, tetrahidrofurano, y la combinación de tetrahidrofurano y diclorometano en proporción 1: 1.
Nota: La elección del disolvente adecuado varía dependiendo del polímero de usar. Diferentes disolventes poseen diferentes puntos de ebullición que pueden afectar a la solubilización del polímero. - Agitar la solución vigorosamente durante 20 min a temperatura ambiente usando un agitador a una velocidad de 200 mot / min, hasta que la solución se vuelve homogénea y se observó ningún precipitado.
4. revestimiento de cristal diapositivas con PU134
- Coloque un round 15 mm 2 cubreobjetos en la recubridora de rotación.
- Aplique 50 l de la solución PU134 a cada uno usando una pipeta. Ajustar el volumen de la solución PU134 en consecuencia para el tamaño requerido cubreobjetos manteniendo el volumen a la superficie relación proporcional.
- Haga girar cada cubreobjetos de 7 segundos a 23 x g.
- Aire cubreobjetos seco a temperatura ambiente durante al menos 24 horas antes de la esterilización.
5. irradiación de Cubreobjetos
- Gamma-irradiar cubreobjetos recubiertos de polímero mediante la aplicación de una dosis de 10 Grays usando un irradiador de laboratorio durante 12 min.
- UV irradiar polímero recubierto cubreobjetos usando una 30 W, lámpara de rayos UV durante 16 minutos cada lado.
- Coloque el cubreobjetos recubierto de polímero en una placa de cultivo tisular adecuado de acuerdo con el tamaño de diapositiva.
6. Microscopía Electrónica de Barrido
- Oro escudo cubreobjetos polímero mediante pulverización catódica de 200 seg en una atmósfera de 5 x 10 -1 milibares de presión.
- Capturar la micrographs del cubreobjetos recubierto con polímero utilizando un microscopio electrónico de barrido a un voltaje de aceleración de 20 kV en modo de imagen de electrones secundarios.
7. Observaciones Microscopía de Fuerza Atómica
- Analiza un área de 20 x 20 m de la superficie del polímero.
- Establecer una velocidad de barrido de 1,32 Hz a 1,60 Hz.
- Configurar una resolución de 512 x 512 píxeles en la región explorada.
- Calcula la raíz cuadrada media (RMS o Rq) del recubrimiento mediante el uso de la media de desviaciones de altitud tomadas del plano medio de datos de imagen, expresado como:
Cuando Zi es el valor actual Z, y N es el número de puntos dentro del área determinada. - 7.5 Se calcula la desviación o la media de rugosidad superficial (Ra) de la imagen utilizando,
Cuando Z (x) es la función que describe tque la superficie del perfil se analiza en términos de altura (Z) y la posición (x) de la muestra sobre la longitud de evaluación "L". Ra representa el valor medio de la superficie con respecto al plano central.
8. Cultivo Celular y Diferenciación
- Cultura y diferenciar lo humano línea de células madre embrionarias (células madre) H9 como se describe en Hay 17.
- Separar las células usando un reactivo de disociación y replate ellos en PU134 portaobjetos recubiertos en el Día 9 del proceso de diferenciación, en presencia de un medio libre de suero como se describe en Szkolnicka 18,19.
Nota: Se prefiere el uso de una disociación celular enzimática para el desprendimiento de células físico.
9. citocromo P450 ensayo funcional
- Medir la actividad de CYP3A, siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Incubar hepatocitos derivados de células madre en el Día 13 o día 19, y medios sin células - como control negativo, con el substr apropiadacomió durante 5 horas a 37 ° C.
- Recoger los sobrenadantes de las células y los medios de comunicación, llevar a cabo el ensayo según las instrucciones del fabricante.
- Medir el nivel de actividad de CYP y relativa normalizada para el área de superficie (cm 2).
10. Inmunoticción
- Lave hESC deriva hepatocitos con PBS, durante 1 min, repita dos veces.
- Añadir hielo frío metanol al 100% para fijar las células, en lugar de -20 ° C durante 10 min.
- Lavar las células con PBS durante 5 min y repetir dos veces.
- Se incuban las células con PBS / T (0,1% de Tween) / 10% de BSA durante 1 hora a RT.
- Aspirar la solución PBST y añadir el anticuerpo primario apropiado diluido en PBS / T (0,1% de Tween) / 1% de BSA, se incuba a 4 ° C con suave agitación O / N.
- Lavar las células con PBS / T (0,1% de Tween) / BSA al 1% durante 5 min y repetir tres veces.
- Diluir el anticuerpo apropiado en PBS / T (0,1% de Tween) / 1% de BSA, añadir a las células y se incuba en la oscuridad a RT durante 1 h con agitación suave.
- Lavar las células con PBS durante 5 min y repetir tres veces.
- Añadir MOWIOL 488 (que contiene DAPI 1: 1.000) a cada pocillo, añadir un cubreobjetos con cuidado para reducir el número de burbujas de aire. Tienda células fija a 4 ° C en la oscuridad. Observe tinción utilizando un microscopio con un filtro adecuado y la lámpara fluorescente. Los anticuerpos primarios y secundarios optimizados se enumeran en la Tabla 1.
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Representative Results
Disolvente de polímero influye en la topografía de la superficie del polímero recubierto
Poliuretano 134 se solubilizó en cloroformo, ya sea solo o en combinación con tolueno o tetrahidrofurano o diclorometano y los portaobjetos de vidrio mediante revestimiento por centrifugación con las diferentes formulaciones. Microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía de fuerza atómica (AFM) se utilizaron para caracterizar las propiedades físicas de los revestimientos de polímero (Figura 1). El recubrimiento obtenido usando tolueno o cloroformo no fue homogénea, lo que demuestra un recubrimiento desigual con PU134 precipitación (Figura 1A). En contraste, tetrahidrofurano era un disolvente adecuado permitiendo que el recubrimiento por rotación de un mucho más uniforme de la superficie (Figura 1A). Topografía de la superficie se midió mediante AFM utilizando la raíz cuadrada media (RMS) y la rugosidad media (Ra). PU134 tetrahidrofurano disuelto exhibió una reducción del 40% en la rugosidad en comparación a the otros disolventes (Figura 1B y 1C). Estos datos demuestran que el uso de tetrahidrofurano como disolvente proporciona un recubrimiento más uniforme de PU134 para aplicación biológica.
Topografía polímero tiene un impacto significativo sobre la función de los hepatocitos
células madre puede diferenciarse eficientemente a endodermo hepática in vitro, que exhibe muchas de las funciones que se encuentran en el hígado adulto 17-20. La diferenciación del endodermo hepática fue inducida y en el Día 9-hepatoblastos como células eran aparente, con la mayoría de las células que expresan citoqueratina 19 (99% ± 1,2), α-fetoproteína (99% ± 0,6), y el factor nuclear hepático 4α (97% ± 2,6); y niveles bajos de albúmina (20% ± 1,7) (Figura 2). En este punto, las células fueron separadas utilizando TrypLE expresar y replated sobre las diferentes superficies de polímero recubierto. Como una medida de la función metabólica, citocromo P450 función se evaluó 4 días después de replating. Se observó un aumento de 2 veces en la actividad metabólica en las células se volvieron a sembrar en tetrahidrofurano / superficies recubiertas PU134 (Figura 3). Estos resultados demuestran que la actividad metabólica de los hepatocitos derivados de células madre se mejora con un recubrimiento más uniforme de PU134, esto es consistente con los enfoques anteriores 21.
Impactos de esterilización de superficie sobre las propiedades bioactivas de polímero
El efecto de la esterilización en el rendimiento PU134 también fue investigado. Polymer portaobjetos de vidrio recubiertos fueron expuestos a UV o irradiación gamma. Fase de formación de imágenes de contraste de portaobjetos de vidrio recubiertos PU134 no mostró diferencias evidentes post UV o irradiación gamma (Figura 4A). Estas observaciones fueron confirmadas por análisis SEM (Figura 4B). Se examinó el comportamiento biológico de PU134 usando hepatocitos células madre derivadas a los 10 días después de la resiembra. hESC derivadoshepatocitos se volvieron a sembrar en portaobjetos de vidrio recubiertos PU134 γ-radiada muestran un aumento de 3 veces en la actividad CYP3A sobre las células se volvieron a sembrar en portaobjetos de vidrio recubiertos PU134 UV-radiada (Figura 4C). Estas observaciones demostraron que la irradiación gamma fue la técnica de esterilización óptima para nuestros propósitos.
Figura 1. Optimización de la superficie recubierta de poliuretano 134. Diapositivas (A) de vidrio se recubrieron con una solución al 2% de PU134 disuelto en diferentes disolventes. Escaneo de imágenes de Microscopía Electrónica (SEM) de los diferentes portaobjetos de vidrio recubiertos muestran la presencia de una superficie recubierta homogénea y la ausencia de polímero se precipita cuando se usó tetrahidrofurano en comparación con tolueno, cloroformo o mezclas de los disolventes (negro y flechas blancas). Las imágenes fueron tomadas con una ampliación de x1664 y escalas de barras ar e se muestra a continuación las imágenes. (BC) Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) fue empleado para analizar la rugosidad de las superficies recubiertas PU134 sobre los disolventes seleccionados. Análisis de los parámetros de rugosidad RMS (raíz cuadrada media) (B) y RA (la rugosidad media) (C) de las diferentes superficies PU134 recubierto mostrar que el recubrimiento obtenido usando tetrahidrofurano como disolvente tenía la superficie más lisa en comparación con el resto de las condiciones (n = 7). Los datos se expresan como media ± sd, p <0,05 se denota *, p <0,01 se denota **, y p <0,001 se denota ***, medido por los estudiantes t-test en comparación con portaobjetos recubiertos con PU134 solubilizados en tetrahidrofurano. Las barras de error representan 1 desviación estándar. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 Caracterización de las células madre derivadas hepatoblastos. Inmunocitoquímica que muestra la expresión de marcadores hepáticos AFP, CK19, HNF4α y albúmina en células madre (H9) deriva endodermo hepática. Se realizaron controles negativos con inmunoglobulina correspondiente G (IgG) y se muestran imágenes representativas. El porcentaje de células positivas y la desviación estándar se calcula a partir de al menos cinco campos aleatorios de vista que contienen al menos 300 células por punto de vista. Las imágenes fueron tomadas a 20 aumentos. Los datos se expresan como media ± error barras representan 1 desviación estándar. HNF4α, hepatocitos nuclear factor 4α; AFP, α-fetoproteína; ALB, albúmina; CK19, citoqueratina 19, IgG de cabra, inmunoglobulina G anti-cabra, ratón IgG, Inmunoglobulina G anti-ratón. Haga clic aquí para ver una versi grandesen esta figura.
Figura 3. implicaciones funcionales de la topografía de la superficie PU134 recubierto sobre la función de los hepatocitos células madre derivadas. Medición de la actividad del citocromo P450 3A en hepatocitos derivados de células madre mantenido durante 96 horas en portaobjetos de vidrio recubiertos con PU134 disuelto en diferentes disolventes. Una mejora en la en la actividad de citocromo en células mantenidas en portaobjetos de vidrio recubierto PU134 solubiliza con tetrahidrofurano (n = 6). Los datos se expresan como media ± sd, p <0,05 se denota *, p <0,01 se denota **, y p <0,001 se denota ***, medido por los estudiantes t-test en comparación con hepatocitos hESC derivados mantenidos en portaobjetos recubiertos con PU134 solubiliza en tetrahidrofurano. Las barras de error representan 1 desviación estándar.
Figura 4. Optimización de la esterilización de las superficies recubiertas. Imágenes de contraste de fase (A) o imágenes de SEM (B) no muestran diferencias manifiestas en la superficie recubierta PU134 entre γ-radiación o la radiación UV (UV) tratamientos. Imágenes de contraste de fase se tomaron a 40 aumentos y SEM imágenes con una ampliación 1,664X. (C) Análisis de la actividad del citocromo P450 3A en hepatocitos derivados de células madre se mantuvo durante 10 días en portaobjetos de vidrio recubiertos PU134. Un aumento en la actividad del citocromo P450 3A en las células se volvieron a sembrar en portaobjetos de vidrio recubiertos PU134 γ-radiada en comparación con las células se volvieron a sembrar en UV irradiada portaobjetos de vidrio recubiertos PU134. Las unidades de actividad se expresan como unidades relativas de luz (RLU) ml -1 cm -2 de superficie de cultivo (n = 3). Los datos se expresan como media ± sd, p <0.001 is denota *** medido por los estudiantes t-test en comparación con hepatocitos hESC derivados mantenidos en cubreobjetos de vidrio recubiertos PU134 esterilizados por γ-radiación. Las barras de error representan 1 desviación estándar. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Los anticuerpos primarios | |||
| Antígeno | Tipo | Empresa | La dilución |
| HNF4α | Policlonal de conejo | Santa Cruz | Centésima |
| Albúmina | Monoclonal de ratón | Sigma | 1/500 |
| AFP | Monoclonal de ratón | Abcam | 1/500 |
| La citoqueratina 19 | Monoclonal de ratón | Dako | 1/50 |
| IgG | Monoclonal de ratón | Dako | 1/500 |
| Secundaria anticuerpos | |||
| Anti-conejo Alexa 568 Harina | Cabra | Invitrogen | 1/400 |
| Anti-ratón Alexa 488 Harina | Conejo | Invitrogen | 1/500 |
Tabla 1 Lista de anticuerpos y concentraciones primarias y secundarias optimizados utilizados en este estudio. HNF4α, hepatocitos nuclear factor 4α; AFP, α-fetoproteína; IgG, Inmunoglobulina G.
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Discussion
Muchos de los métodos actuales utilizados para generar hepatocitos a partir de células madre se basan en matrices indefinidos de origen animal. Estos sustratos pueden ser costosos y altamente variable, que afecta a la función celular y la estabilidad, lo que representa una barrera significativa a la aplicación. Por lo tanto, se realizó una pantalla para materiales sintéticos que apoyan la cultura de células madre de hepatocitos derivados. Hemos identificado, un poliuretano sencilla (PU134), formado por la polimerización de PHNGAD, MDI y un extensor, que, en combinación con un enfoque de diferenciación de hepatocitos robusta, estabiliza el fenotipo de hepatocitos y mejora la función de las células en comparación con matrigel 15.
Manipulación de las células madre matrices biológicas, comúnmente usados en el cultivo existentes y diferenciadores tales como vitronectina 22, 23 o 521 laminina matrigel, es eficaz para el mantenimiento a corto plazo. En contraste, las superficies recubiertas PU134 proporcionan un sustrato superior para hepatocyla cultura del te. Por otra parte, la optimización de la topografía de la superficie y la esterilización de polímero han dado lugar a nuevas mejoras en el rendimiento de células, un factor clave en la entrega de los modelos de hígado humano a escala con un rendimiento fiable.
La naturaleza del extendedor de cadena y isocianato de fenilo representa una de las etapas críticas del proceso; como la eliminación o la sustitución de cualquiera de los componentes pueda afectar significativamente la superficie del polímero y, por tanto, la unión celular y actividad funcional de los hepatocitos derivados de células madre. La composición del polímero afecta a parámetros físicos tales como la elasticidad y la capacidad de humectación 24, que tiene efectos de la capacidad del polímero para absorber proteínas de la matriz extracelular clave involucrados en la función de los hepatocitos. Además, las variaciones en el catalizador, tiempo de reacción y la temperatura afectan a la distribución del peso molecular del polímero.
La selección del disolvente para solubilizar el polímero representa otro punto crítico en la obtención de una superficie recubierta de polímero optimizado. Hemos observado que la naturaleza del disolvente afecta a la topografía de la superficie revestida, que tiene implicaciones directas en la función de las células 25-31. Además, el tiempo y la velocidad de hilatura también son cruciales en la obtención de este recubrimiento uniforme y homogénea. Otro paso a tomar en consideración es el procedimiento de esterilización aplicado en la superficie revestida de polímero, como la actividad de las células puede ser influenciada por el tratamiento de esterilización usado. Esto puede ser debido a la presencia de área sensible (s) dentro de la estructura del polímero a diferentes procedimientos de esterilización 32-34.
Los modelos actuales de células pluripotentes de células madre basado poseen fenotípica y limitaciones funcionales. Creemos que este polímero optimizado superficie recubierta representa un avance en el campo, evitando algunas de las limitaciones asociadas con el uso de subst biológicatasas. Además, la posibilidad de utilizar el polímero en 3D matrices para apoyar la fijación de diferentes tipos celulares que se encuentran en el tejido de interés, puede mejorar aún más la fidelidad de la célula.
En conclusión, el uso de materiales sintéticos se está convirtiendo cada vez más importante en la entrega de soma humano a partir de células madre pluripotentes. Hemos desarrollado un procedimiento superficial y revestimiento optimizado que es robusto y entrega fiable hepatocitos humanos funcionales con implicaciones significativas para el modelado basado celular y la medicina regenerativa.
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Disclosures
DCH es CSO, Director, fundador y accionista de FibromEd Products Ltd. MB y JPI son accionistas fundadores en FibromEd Products Ltd.
Acknowledgments
DCH, MB y FK fueron apoyados por un seguimiento EPSRC el Fondo. BL-V y DS fueron cada apoyados por becas de doctorado MRC. KC fue apoyado por la financiación de la Plataforma de Medicina Regenerativa del Reino Unido.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips | |||
| Shaker | Edmun Bühler | KS-15 | |
| Irradiator | CIS Biointernational | IBL 637 | |
| Spin coater | Specialty Coating System | P-6708 | |
| Scanning Electron Microscope | Philips | XL30CPSEM | |
| Atomic Force Microscope | DimensionV Nanoscope, VEECO | ||
| p4-GLO CYP3A4 | Promega | V8902 | |
| UV bulb | ESCO | ||
| NanoScope analysis software | VEECO | version 1.20 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | TH45200 | Use Volocity 4 Software |
| Tissue culture plates | Corning, UK | 3527 | |
| glass slides | Scientific Laboratory Supplies | MIC3308 | |
| Diethylene glycol | Sigma–Aldrich | 93171 | |
| 1,6-hexanediol | Sigma–Aldrich | 240117 | |
| Neopentyl glycol | Sigma–Aldrich | 408255 | |
| Adipic acid | Sigma–Aldrich | 9582 | |
| anhydrous N,N-Dimethylformamide | Sigma–Aldrich | 227056 | |
| Diethyl ether | Sigma–Aldrich | 676845 | |
| titanium (IV) butoxide | Sigma–Aldrich | 244112 | |
| 1,4-butanediol | Sigma–Aldrich | 493732 | |
| Vacuum oven | Thermoscientific | ||
| 4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) | Sigma–Aldrich | 101688 | |
| Tetrahydrofurane | Sigma–Aldrich | 401757 | |
| Sputter coater | Bal-Tec SCD 050 | ||
| Inmunostaining | |||
| Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) | Gibco | 10010031 | Store at room temperature |
| PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 | Scientific Laboratory Supplies Ltd | EC607 | |
| Methanol | Scientific Laboratory Supplies Ltd | CHE5010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, UK | A7906 | |
| MOWIOL 488 DAPI | Calbiochem | 475904 | Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions |
| Cell culture and Functional assay | |||
| CYP3A activity pGLO kit | Promega | V8902 | |
| Hepatozyme | Gibco | 17705021 | |
| TryLE express | Life Technologies | 12604013 | |
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