Summary
本文将重点发展聚合物涂层表面进行长期，干细胞的培养稳定来源的人肝细胞。
Introduction
生物材料已经被广泛用于多能干细胞1的维持和分化。同时使这些生物基质通常包含未定义了大量元器件。基质胶是一种常用的基质干细胞的培养和分化。不幸的是，它的可变成分影响细胞功能和表型。虽然各种各样的替代方案中，更明确的生物基质已用于2-7，其动物来源或可扩展性差，使它们不适合的候选用于工业制造。因此合成的替代品，具有固定的成分，性能可靠的鉴定，是干细胞研究的主要目标。
在克服不确定的细胞培养基质的限制的尝试，化学和生物学的交叉学科的合作已经确定了合成材料，以支持细胞表型的能力。合成器客位基板具有可扩展性，成本效益和可制造成复杂的三维结构，模仿体内环境。由于这些特性的合成底物已被广泛使用，以支持和驱动许多细胞类型8-10的分化。
先进的高通量检测提供了便利合成材料的快速筛选，从大型图书馆，并提供新的材料，具有灵活的特性，在生物医药研究和开发11-13广泛的应用。利用高通量，聚合物微阵列筛选技术，我们迅速确定了一个简单的聚氨酯（PU134），适用于维护人类干细胞衍生的肝细胞。该聚合物被认为是优于动物源性底物对于肝细胞的分化和功能14-16。我们随后优化的涂覆条件，地形和灭菌过程来访问效果在稳定肝细胞的功能和寿命聚合物的性能。这有针对了解肝细胞生物学细胞建模和再生医学应用基础显著影响。
此处所描述的技术代表了如何由合成聚合物的表面可以进行优化，以保持细胞的表型的实例。我们认为，这种技术提供了高效的无血清肝细胞分化方案的组合有可能提供一种可伸缩的生产肝细胞在体外模型和再生医学中使用。
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Protocol
1，合成PHNGAD（聚[1,6-hexanodiol /新戊二醇/二（乙二醇）-alt - 己二酸]二醇）的
方案1：PHNAGD合成 PHNAGD的合成的示意图。 PHNAGD制备的1,6-Hexanodiol的反应中，二甘醇，neoppentyl乙二醇和己二酸。 PHNAGD，聚[1,6-hexanodiol /新戊二醇/二（乙二醇）-alt - 己二酸]二醇。
- 适用于热处理的单体1,6 - 己二醇，二（乙二醇）和新戊二醇，在40℃下进行48小时的真空炉中，以除去任何残余的水。允许冷至室温下真空。
- 加入22毫摩尔的各单体和己二酸（55毫摩尔）到两颈圆底烧瓶配有搅拌棒并连接到一个Dean-Stark装置。
- 放置在真空下整机组装，轻轻加热GLAssware在40℃下6小时，以避免在加入化学品向烧瓶中的任何湿气的吸收。
- 添加经由注射器，一滴一滴，0.0055摩尔的催化剂的钛（Ⅳ）丁醇。
- 搅拌该反应混合物在180℃下，N 2气氛下进行24小时，并在Dean-Stark分水器收集残留的水。使产物冷却至室温。
2，合成PU134的
方案2：PU134合成聚氨酯134的PU134的制备是在1.0当量ÂPHNGAD与2.0当量4,4'--亚甲基双（异氰酸苯酯）的反应合成的示意图，接着加入1.0。当量的1,4 - 丁二醇扩链剂。
- 混一当量的多元醇PHNGAD的（锰〜1800道尔顿，3.2毫摩尔）与两个当量的4'4-亚甲基双（苯基异氰酸酯）（6.4毫摩尔）在无水N，N二甲基甲酰胺（12毫升）中。
- 搅拌反应混合物，在70℃，N 2气氛下。
- 添加经由注射器逐滴催化剂的钛（Ⅳ）叔丁醇钾（0.8％重量）。
- 1小时后，加入一当量的增链剂1,4丁二醇（3.2毫摩尔）。增加，在90℃的温度和N 2气氛下搅拌24小时。
- 以下的反应中，（也可以用己烷或水），加入乙醚收集的聚氨酯通过沉淀，直至出现沉淀逐滴加入到反应溶液中。
- 离心溶液以5300×g离心5分钟。
- 倒出上清液并擦干，在40℃的真空烘箱中，直到溶剂蒸发。
注意：为了确保反应的最终产物具有对于对分子量分布的正确参数，功能GROU的聚合物，熔点和玻璃化转变温度的PS，各种分析技术和方法都可以使用，如凝胶渗透色谱法或FITR光谱。
3，准备PU134解决方案
- 称取200毫克PU134到一个玻璃瓶。
- 比为1：四氢呋喃，及组合四氢呋喃和dicloromethane在1比1，稀释：PU134到2％的终浓度在许多溶剂：氯仿，氯仿和甲苯中的1的组合。
注意：根据要使用的聚合物上的合适的溶剂的选举而变化。不同的溶剂具有不同的沸点，可以影响聚合物的溶解。 - 摇使用振动器的溶液剧烈20分钟，在室温以200 MOT /分钟的速度，直到溶液变得均匀，没有沉淀物观察到的。
4，镀膜玻璃幻灯片与PU134的
- 将一个柔第二15毫米2盖玻片上的旋涂机。
- 适用于50微升的PU134的解决方案给每个使用吸液管。调整PU134溶液的体积相应于所要求的盖玻片大小保持表面比成比例的量。
- 旋转每个盖玻片7秒，23×g的。
- 空气干燥的盖玻片，在室温下灭菌前至少24小时。
5，辐射盖玻片
- 通过将10灰色的剂量使用实验室照射12分钟伽玛辐照聚合物涂层的盖玻片。
- 紫外用30瓦紫外线灯16分钟每侧照射聚合物涂层的盖玻片。
- 根据滑动大小将聚合物涂覆的盖玻片在合适的组织培养板中。
6，扫描电子显微镜
- 通过在5×10 -1毫巴的压力的气氛中溅射为200秒黄金涂层聚合物的盖玻片。
- 捕捉微克使用扫描电子显微镜以20千伏在二次电子成像模式的加速电压，聚合物涂覆的盖玻片的raphs。
7，原子力显微镜观察
- 扫描20的聚合物表面的×20微米的区域。
- 设置的扫描率从1.32 Hz至1.60赫兹。
- 设置在扫描区域为512×512像素的分辨率。
- 计算均方根涂层的方（RMS或RQ）通过利用从平均影像数据平面截取的高度偏差的平均值，表示为：
其中Z是当前Z值，而N是在给定区域内的点的数量。 - 7.5计算的偏差或平均表面粗糙度（Ra）使用图像的
其中Z（x）是一个描述吨的功能他表面轮廓的高度（Z）和该样品在评价长度“L”的位置（x）来分析。 Ra表示的表面相对于中心面的平均值。
8，细胞培养和分化
- 培养并如干草17所述的分化的人类胚胎干细胞系（人类胚胎干细胞）H9。
- 分离用的解离试剂的细胞和replate他们到PU134包被的载玻片，在分化过程的第9天，在无血清培养基中的存在，作为描述在Szkolnicka 18,19。
注意：使用的酶的细胞解离的优选物理小区脱离。
9，细胞色素P450功能分析
- 测量CYP3A活性按照制造商的说明进行操作。
- 培育人类胚胎干细胞衍生的肝细胞在13日或19日，和媒体没有细胞 - 作为阴性对照，用适当的SUBSTR连吃5小时，在37℃。
- 收集细胞和培养基的上清液，进行该测定按照生产商的说明进行操作。
- 测量CYP活性和归一化的相对的表面面积（cm 2）的水平。
10，免疫染色
- 洗涤胚胎干细胞衍生的肝细胞用PBS，1分钟，重复2次。
- 添加冰冷的100％甲醇中固定细胞，置于-20℃下进行10分钟。
- 用PBS进行5分钟清洗细胞，并重复两次。
- 孵育细胞用PBS / T（0.1％吐温）/ 10％BSA进行1小时，在室温。
- 吸出的PBST溶液并加入稀释在PBS / T（0.1％吐温）/ 1％BSA中的相应的第一抗体，孵育在4℃下温和搅拌O 2 / N。
- 洗涤细胞，用PBS / T（0.1％吐温）/ 1％BSA中进行5分钟，重复三次。
- 稀释在PBS / T（0.1％吐温）/ 1％BSA中的相应抗体，加入到细胞中，并孵育在黑暗中在RT下1小时，轻轻摇动。
- 用PBS进行5分钟清洗细胞，并重复三次。
- 添加MOWIOL 488（含DAPI 1:1,000）到每个孔中，加盖玻片轻轻以减少气泡的数目。储存固定的细胞在4°C黑暗。观察用显微镜适当的过滤器和荧光灯染色。优化的第一和第二抗体都列在表1中 。
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Representative Results
聚合物溶剂影响聚合物涂覆的表面的形貌
聚氨酯134溶解在氯仿中，无论是单独使用或与甲苯或四氢呋喃或二氯甲烷中，并在载玻片上旋涂一层的不同制剂的组合。扫描电子显微镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）进行了表征的聚合物涂层的物理性能（ 图1）。使用甲苯或氯仿中得到的涂层不是均匀的，这表明一个不均匀的涂层与PU134沉淀（ 图1A）。与此相反，四氢呋喃是一种合适的溶剂，允许一个更均匀的表面（ 图1A）的旋涂。表面形貌是使用均方根（RMS），平均粗糙度（Ra）用AFM测得的。 PU134溶于四氢呋喃展出粗糙度的降低相比40％为the其他溶剂（ 图1B和1C）。这些数据表明，使用四氢呋喃作为溶剂，提供PU134的生物应用的更均匀的涂层。
聚合物形貌对肝功能的影响显著
人类胚胎干细胞，可以高效率地分化为肝脏内胚层在体外表现出许多在成年肝17-20发现的功能。肝脏内胚层的分化诱导，并在第9天成肝细胞样细胞是明显的，其中大部分细胞表达细胞角蛋白19（99％±1.2），α-胎蛋白（99％±0.6），和肝细胞核因子4α（97％±的2.6）;和白蛋白的水平低（20％±1.7）（ 图2）。在这一点上，将细胞用的TrypLE表达和再接种到不同聚合物涂覆的表面脱离。作为代谢功能的量度，细胞色素P450˚F恩膏评估后4天replating。我们观察到在细胞再接种于四氢呋喃/ PU134涂层的表面（ 图3）的2倍，增加的代谢活性。这些结果表明，人类胚胎干细胞衍生的肝细胞代谢活性与PU134的更均匀的涂层的提高，这是与以前的方法21。
关于该聚合物的生物活性性质的表面灭菌的影响
还研究了灭菌的上PU134性能的影响。聚合物涂覆的玻璃载片暴露于UV或γ射线照射。中PU134涂层玻片相衬成像均无差异总额张贴紫外线或γ射线（ 图4A）。这些观察通过扫描电镜分析（ 图4B）被进一步证实。使用人类胚胎干细胞衍生的肝细胞在后10天replating PU134的生物学性能进行了检查。人类胚胎干细胞衍生的肝细胞铺板在γ-辐射PU134涂层的玻璃载片显示了细胞再接种于紫外线辐射PU134涂覆的玻璃载片（ 图4C）的3倍，增加CYP3A活性。这些观察结果表明，γ射线照射，对于我们而言最佳的灭菌技术。
图1中优化的聚氨酯134涂覆的表面的（A）玻璃载玻片上涂布PU134的2％的溶液溶解在不同的溶剂中。不同的涂覆的玻璃载片的扫描电子显微（SEM）图像显示，当使用四氢呋喃，用溶剂（黑色和白色箭头）的甲苯，氯仿或它们的混合物比较均匀的涂布面的存在与不存在聚合物的沉淀。这些照片被采取x1664放大和规模的酒吧AR Ë显示的图像下方。 （BC）的原子力显微镜（AFM）是用来分析在选定溶剂中的PU134涂层表面的粗糙度。的粗糙度参数的RMS（均方根）（B）和不同PU134涂层的表面Ra为（平均粗糙度），（C）的分析表明，通过使用四氢呋喃作为溶剂，所得到的涂层具有光滑的表面，当与比较的条件其余组（n = 7）。数据表示为平均值±标准差，P <0.05表示为*，P <0.01表示**， 和 p <0.001表示***，通过学生t检验，相比于载玻片涂有PU134溶解在四氢呋喃测定。误差条代表1个标准差。 请点击这里查看该图的放大版本。
图2表征的人类胚胎干细胞源性肝细胞中，肝标志物AFP，CK19，HNF4α和白蛋白的人类胚胎干细胞（H9亚型）免疫组化显示表达式得出肝胚层。阴性对照进行与相应的免疫球蛋白G（IgG）的和有代表性的图像被显示。阳性细胞和标准偏差的百分比从视图包含每个视图的至少300个细胞至少五个随机场进行估计。这些照片被拍摄时放大20倍。数据表示为平均值±标准差误差条代表一个标准差。 HNF4α，肝细胞核因子4α;法新社报道，α-胎儿蛋白;白蛋白，白蛋白;细胞角蛋白19，细胞角蛋白19，IgG羊，免疫球蛋白G抗羊，鼠IgG抗体，免疫球蛋白G抗鼠。 请点击这里查看大图versi在这个数字的。
图中PU134涂层表面的形貌上的人类胚胎干细胞衍生的肝细胞的功能3功能的影响。保持96小时在载玻片上涂布有PU134溶解在不同溶剂中的hESC衍生的肝细胞中的细胞色素P450 3A活性的测定。上保持在PU134涂层玻璃载玻片细胞中的改进，在细胞色素的活性溶解，用四氢呋喃（N = 6）。数据表示为平均值±标准差，P <0.05表示为*，P <0.01表示**， 和 p <0.001表示***，由学生t检验比较测量，以保持在载玻片上涂布有人类胚胎干细胞衍生的肝细胞PU134溶解在四氢呋喃。误差棒表示1个标准差。
图4优化涂层表面的灭菌。相衬图像（A）或SEM图像（B）表示无毛的差异在γ-辐射或紫外线辐射（UV）处理之间的PU134涂层表面。相位对比图像拍摄于40倍的放大倍率和扫描电镜图像在1,664X放大。 （ 三）分析保持在PU134涂层载玻片10天对人类胚胎干细胞源性肝细胞色素P450 3A活性。在细胞铺板在γ-辐射PU134涂层的玻璃载片，与细胞再接种于紫外线相比，在细胞色素P450 3A活性的增加辐射PU134涂层的玻璃载片。活性单位表示为相对光单位毫升-1 cm -2的培养表面（RLU）组（n = 3）。数据表示为平均值±标准差，P <0.001ìš记***通过学生t检验，相比于保持在由γ-射线消毒PU134涂覆的玻璃盖玻片上的hESC衍生的肝细胞中测量的。误差条代表1个标准差。 请点击这里查看该图的放大版本。
| 一抗 | |||
| 抗原 | 类型 | 公司 | 稀释 |
| HNF4α | 兔多克隆 | 圣克鲁斯 | 1/100 |
| 白蛋白 | 鼠单克隆 | 西格玛 | 1/500 |
| 法新社 | 鼠单克隆 | Abcam公司 | 1/500 |
| 细胞角蛋白19 | 鼠单克隆 | Dako公司 | 1/50 |
| 抗体 | 鼠单克隆 | Dako公司 | 1/500 |
| 二抗 | |||
| 抗兔568 Alexa的面粉 | 山羊 | Invitrogen公司 | 1/400 |
| 抗鼠488 Alexa的面粉 | 兔子 | Invitrogen公司 | 1/500 |
表1列出本研究中使用优化的初级和二级抗体和浓度 。 HNF4α，肝细胞核因子4α;法新社报道，α-胎儿蛋白; IgG抗体，免疫球蛋白G。
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Discussion
许多用于产生从干细胞的肝细胞的现有方法依赖于动物来源的未定义的矩阵。这些基材可以是昂贵的，充满变数，影响细胞的功能和稳定性，较显著障碍中的应用。因此，我们进行了一个屏幕的量支持的干细胞衍生的肝细胞培养的合成材料。我们已经确定了，一个简单的聚氨酯（PU134），通过聚合PHNGAD，MDI和一个扩展，在结合强大的肝细胞分化的方式形成，稳定肝细胞的表型，当与基质胶15相比提高了细胞的功能。
处理现有的生物基质，培养中常用的分化干细胞，如玻连蛋白22，层粘连蛋白521 23或基质胶的，是有效的短期内维修。相比之下，PU134涂层表面提供了优越的底hepatocy德文化。此外，表面形貌与聚合物灭菌的优化导致了电池的性能，在提供人类肝模型在规模和可靠的性能的关键因素进一步改进。
扩链剂与异氰酸苯酯的性质表示该过程的关键步骤之一;为消除或更换任何部件会显著损害聚合物表面的，因此，细胞附着和干细胞衍生的肝细胞功能活性。该聚合物的组合物将影响物理参数，如弹性和湿润性24，其具有影响聚合物的吸收涉及肝功能键外基质蛋白的能力。此外，不同的催化剂，反应时间和温度会影响聚合物的分子量分布。
所用溶剂的选择，以溶解该聚合物重呈现在一个优化的聚合物涂覆的表面的取得另一个临界点。我们已经观察到所用溶剂的性质影响涂布的表面，其具有在细胞25-31的功能直接影响的地形。另外，纺丝时和速度，可以在取得此均匀和均一的涂层是至关重要的。另一个步骤采取在考虑是适用于聚合物涂覆表面的灭菌过程，因为细胞的活性可以通过使用该杀菌处理的影响。这可能是因为敏感区域（S）的聚合物，以不同的灭菌程序32-34的结构内的存在。
目前的多能性干细胞的基础细胞模型具有表型和功能上的限制。我们相信，这个优化的聚合物涂覆的表面代表在本领域的进步，绕过一些与使用生物SUBST相关联的局限性率。此外，使用内三维聚合物的可能性矩阵，以支持在感兴趣的组织中发现的不同的细胞类型的附接，可以进一步提高电池的保真度。
最后，该合成材料的使用正变得在从多能干细胞的递送人的体细胞中越来越重要。我们已经开发了一种优化的表面和涂层的过程，是稳健和可靠的传送功能的人类肝细胞为基础的细胞模型和再生医学显著影响。
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Disclosures
大昌行是民间组织，董事，创始人和FibromEd制品有限公司MB和JPI股东是公司创始人股东FibromEd制品有限公司
Acknowledgments
大昌行，MB和FK是由EPSRC按照有关基金的支持。 BL-V和DS分别支持MRC博士助学金。 KC是由来自英国的再生医学平台提供资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips | |||
| Shaker | Edmun Bühler | KS-15 | |
| Irradiator | CIS Biointernational | IBL 637 | |
| Spin coater | Specialty Coating System | P-6708 | |
| Scanning Electron Microscope | Philips | XL30CPSEM | |
| Atomic Force Microscope | DimensionV Nanoscope, VEECO | ||
| p4-GLO CYP3A4 | Promega | V8902 | |
| UV bulb | ESCO | ||
| NanoScope analysis software | VEECO | version 1.20 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | TH45200 | Use Volocity 4 Software |
| Tissue culture plates | Corning, UK | 3527 | |
| glass slides | Scientific Laboratory Supplies | MIC3308 | |
| Diethylene glycol | Sigma–Aldrich | 93171 | |
| 1,6-hexanediol | Sigma–Aldrich | 240117 | |
| Neopentyl glycol | Sigma–Aldrich | 408255 | |
| Adipic acid | Sigma–Aldrich | 9582 | |
| anhydrous N,N-Dimethylformamide | Sigma–Aldrich | 227056 | |
| Diethyl ether | Sigma–Aldrich | 676845 | |
| titanium (IV) butoxide | Sigma–Aldrich | 244112 | |
| 1,4-butanediol | Sigma–Aldrich | 493732 | |
| Vacuum oven | Thermoscientific | ||
| 4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) | Sigma–Aldrich | 101688 | |
| Tetrahydrofurane | Sigma–Aldrich | 401757 | |
| Sputter coater | Bal-Tec SCD 050 | ||
| Inmunostaining | |||
| Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) | Gibco | 10010031 | Store at room temperature |
| PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 | Scientific Laboratory Supplies Ltd | EC607 | |
| Methanol | Scientific Laboratory Supplies Ltd | CHE5010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, UK | A7906 | |
| MOWIOL 488 DAPI | Calbiochem | 475904 | Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions |
| Cell culture and Functional assay | |||
| CYP3A activity pGLO kit | Promega | V8902 | |
| Hepatozyme | Gibco | 17705021 | |
| TryLE express | Life Technologies | 12604013 | |
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