Stabiliser hépatocellulaire phénotype en utilisant des surfaces synthétiques optimisés

Introduction

Les matières biologiques ont été largement utilisés dans l'entretien et la différenciation des cellules souches pluripotentes ^1. Tout en permettant, ces substrats biologiques contiennent souvent une multitude de composants définis. Matrigel est un substrat communément utilisé pour la culture de cellules souches et de la différenciation. Malheureusement, sa composition variable influe sur la fonction des cellules et le phénotype. Bien qu'une grande variété de matrices biologiques alternatives, mieux définis ont été utilisés ^2-7, leur origine animale ou pauvres évolutivité en fait des candidats inappropriés pour la production industrielle. Par conséquent, l'identification des alternatives synthétiques, à composition définie et des performances fiables, sont des objectifs clés de la recherche sur les cellules souches.

Dans une tentative pour surmonter les limitations des indéfinis substrats de culture de cellules, des collaborations interdisciplinaires entre la chimie et de la biologie ont identifié des matériaux synthétiques ayant la capacité de supporter le phénotype cellulaire. Synthsubstrats étiques sont évolutives, rentables, et peuvent être fabriqués dans des structures 3D complexes, imitant l'environnement in vivo. En raison de ces propriétés des substrats synthétiques ont été largement utilisés pour supporter et entraîner la différenciation de nombreux types de cellules ^8-10.

Essais de débit de pointe et haute ont facilité la sélection rapide de matériaux synthétiques, de grandes bibliothèques, et livré de nouveaux matériaux aux propriétés flexibles avec de larges applications dans la recherche et le développement ^11-13 biomédicale. Utilisant à haut débit, la technologie de dépistage micro-réseau polymère, nous avons identifié rapidement d'une simple polyuréthane (PU134), adapté pour l'entretien des hépatocytes dérivés de cellules souches humaines. Ce polymère a été jugée supérieure à des substrats provenant des animaux en ce qui concerne la différenciation et la fonction des hépatocytes ^14-16. Nous avons par la suite optimisé le processus conditions de revêtement, de la topographie et de stérilisation pour accéder à effetssur le rendement en polymère stabilisant fonction des hépatocytes et la durée de vie. Ceci a des implications importantes en ce qui concerne la compréhension des fondamentaux de la biologie des hépatocytes pour la modélisation à base de cellules et des applications en médecine régénérative.

La technologie décrite ici est un exemple de la façon dont la surface d'un polymère synthétique peut être optimisée pour conserver le phénotype cellulaire. Nous croyons que la combinaison de cette technologie avec un hépatocyte libre protocole de différenciation de sérum efficace a le potentiel de fournir une production évolutive des hépatocytes pour l'utilisation de la modélisation in vitro et la médecine régénérative.

Protocol

1. Synthèse de PHNGAD (poly [1,6-hexanodiol / néopentylglycol / di (éthylène glycol), de l'acide adipique--ALt] diol)

Schéma 1: Synthèse de PHNAGD représentation schématique de la synthèse de PHNAGD.. PHNAGD a été préparé par la réaction de 1,6-Hexanodiol, le diéthylène glycol, neoppentyl glycol et d'acide adipique. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / néopentylglycol / di (éthylène glycol), l'acide adipique--ALt] diol.

1. Appliquer un traitement thermique à des monomères de 1,6-hexanediol, le di (éthylène glycol) et du néopentylglycol à 40 ° C pendant 48 heures dans une étuve à vide pour éliminer l'eau résiduelle. Laisser froid jusqu'à température ambiante sous vide.
2. Ajouter 22 mmol de chaque monomère et d'acide adipique (55 mmol) dans un ballon à fond rond à deux cols équipé d'un barreau agité et raccordé à un appareil de Dean-Stark.
3. Placez tout l'ensemble sous vide et chauffer doucement la glassware à 40 ° C pendant 6 heures, afin d'éviter toute absorption d'humidité au cours de l'addition de la substance chimique dans le ballon.
4. Ajouter à la seringue, goutte à goutte, 0,0055 mole de titane de catalyseur (IV) de butoxyde.
5. On agite le mélange réactionnel à 180 ° C, sous une atmosphère _{de N2} pendant 24 heures, et recueillir l'eau résiduelle dans le piège de Dean-Stark. Laissez le produit refroidir à température ambiante.

Synthèse de 2 PU134

Schéma 2: Synthèse de PU134 représentation schématique de la synthèse de polyuréthanne PU134 134 a été préparé par la réaction de 1,0 équivalent d'un PHNGAD avec 2,0 équivalents d'un 4,4 '-méthylène bis (isocyanate de phényle), suivi par l'addition de 1,0. équivalents d'un agent d'allongement de chaîne 1,4-butanediol.

1. Mélanger un équivalent de la PHNGAD polyol (Mn ~ 1800 Da, 3,2 mmol) avec deux équivalents de 4»4-méthylène-bis (isocyanate de phényle) (6,4 mmol) dans anhydre N, N-diméthylformamide (12 ml).
2. On agite le mélange réactionnel à 70 ° C, sous une atmosphère _{de N2.}
3. Ajouter à la seringue, goutte à goutte le titane de catalyseur (IV) butoxyde (0,8% en poids).
4. Après 1 heure, ajouter un équivalent de l'allongeur de chaîne 1,4-butanediol (3,2 mmole). Augmenter la température à 90 ° C et agiter pendant 24 heures sous une atmosphère _de N _2.
5. Après la réaction, collecter le polyuréthanne par précipitation par addition d'éther diéthylique (hexane ou de l'eau peut aussi être utilisé) goutte à goutte dans la solution de réaction jusqu'à ce que la précipitation se produit.
6. Centrifuger la solution à 5300 g pendant 5 min.
7. Décanter le surnageant et sécher à 40 ° C dans une étuve à vide jusqu'à ce que le solvant s'évapore.
   Remarque: Afin de garantir que le produit final de la réaction possède les bons paramètres en ce qui concerne la distribution de la masse moléculaire, le grou fonctionnelps du polymère, et les températures de fusion et de transition vitreuse, diverses techniques analytiques et les méthodes peuvent être utilisées, telles que la Chromatographie de permeation sur gel ou par spectroscopie FITR.

3 Préparation des solutions de PU134

1. Peser 200 mg de PU134 dans une bouteille en verre.
2. Diluer PU134 à une concentration finale de 2% dans un certain nombre de solvants: chloroforme, un mélange de chloroforme et de toluène à 1: 1, le tétrahydrofuranne, et la combinaison de tétrahydrofurane et de dichlorométhane dans le rapport 1: 1.
   Remarque: L'élection du droit solvant varie en fonction du polymère à utiliser. Différents solvants possèdent des points d'ébullition différents qui peuvent influer sur la solubilisation du polymère.
3. Agiter la solution vigoureusement pendant 20 min à température ambiante en utilisant un agitateur à une vitesse de 200 MOT / min, jusqu'à ce que la solution devienne homogène et aucun précipité n'est observé.

4. revêtement de lames de verre avec PU134

1. Placez un roue 15 mm ² lamelle sur la tournette.
2. Appliquer 50 ul de la solution de chaque PU134 à l'aide d'une pipette. Ajuster le volume de la solution de PU134 en conséquence de la taille de la lamelle couvre-objet en maintenant le volume nécessaire à la surface rapport proportionnel.
3. Faites tourner chaque lamelle pendant 7 secondes à 23 x g.
4. Lamelle air sec à température ambiante pendant au moins 24 heures avant la stérilisation.

5. irradiation de Coverslip

1. Gamma-irradier polymère lamelle revêtue par application d'une dose de 10 Grays l'aide d'un irradiateur de laboratoire pendant 12 min.
2. UV irradier revêtu de polymère en utilisant une lamelle 30 W, lampe UV pour 16 min de chaque côté.
3. Placer la lamelle revêtue de polymère dans une plaque de culture de tissu approprié en fonction de la taille de la diapositive.

6. microscopie électronique à balayage

1. Or polymère manteau lamelle par pulvérisation pour 200 secondes dans une atmosphère de 5 x 10 ^-1 millibars de pression.
2. Capturez le micrographies de la lamelle couvre-objet revêtu de polymère en utilisant un microscope électronique à balayage à une tension d'accélération de 20 kV en mode de formation d'image d'électrons secondaires.

7. microscopie à force atomique Observations

1. Balayer une zone de 20 x 20 um de la surface du polymère.
2. Mettre en place une vitesse de balayage de 1,32 Hz à 1,60 Hz.
3. Mettre en place une résolution de 512 x 512 pixels dans la région balayée.
4. Calculer la moyenne quadratique (RMS ou Rq) du revêtement à l'aide de la moyenne des écarts de hauteur à partir de prises au plan moyen de données d'image exprimée en tant que:
   
   Où Zi est la valeur courante de Z, et N est le nombre de points à l'intérieur de la zone donnée.
5. 7.5 Calculer l'écart ou rugosité de surface moyenne (Ra) de l'image en utilisant,
   
   Où Z (x) est la fonction qui décrit til analyse le profil de surface en termes de hauteur (Z) et la position (x) de l'échantillon sur la longueur d'évaluation de "L". Ra représente la valeur moyenne de la surface par rapport au plan médian.

8. culture cellulaire et de la différenciation

1. Culture et différencier la lignée humaine de cellules souches embryonnaires (CSEh) H9 comme décrit dans Hay ^17.
2. Détacher les cellules en utilisant un réactif de dissociation et les Réensemencement sur ​​des lames revêtues PU134 à 9 jours du processus de différenciation, en présence d'un milieu sans sérum comme décrit dans Szkolnicka ^18,19.
   Remarque: L'utilisation d'une dissociation enzymatique des cellules est préférable de détachement de cellule physique.

9. cytochrome P450 de dosage fonctionnel

1. Mesurer l'activité du CYP3A suivant les instructions du fabricant.
2. Incuber CSEh hépatocytes dérivés au jour 13 ou 19 jours, et les médias sans cellules - comme contrôle négatif, avec le substr appropriémangé pendant 5 heures à 37 ° C.
3. Recueillir les surnageants de cellules et les médias, effectuer l'essai selon les instructions du fabricant.
4. Mesurer le niveau de l'activité de CYP et normalisée par rapport à la zone de surface (cm ^2).

10 Immunocoloration

1. Laver CSEh hépatocytes dérivé avec du PBS, pendant 1 min, répéter deux fois.
2. Ajouter glacée 100% de méthanol pour fixer les cellules, dans -20 ° C pendant 10 min.
3. Laver les cellules avec du PBS pendant 5 min et répéter deux fois.
4. Incuber les cellules avec du PBS / T (0,1% de Tween) / 10% de BSA pendant 1 heure à température ambiante.
5. Aspirer la solution de PBST et ajouter l'anticorps primaire approprié dilué dans PBS / T (0,1% de Tween) / BSA à 1%, incubation à 4 ° C avec agitation douce O / N.
6. Laver les cellules avec du PBS / T (0,1% de Tween) / BSA à 1% pendant 5 minutes et répéter trois fois.
7. Diluer l'anticorps approprié dans du PBS / T (0,1% de Tween) / 1% de BSA, ajouter aux cellules et incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 1 h sous agitation douce.
8. Laver les cellules avec du PBS pendant 5 min et répéter trois fois.
9. Ajouter MOWIOL 488 (contenant DAPI 1: 1,000) à chaque puits, ajouter une lamelle doucement pour réduire le nombre de bulles d'air. Magasin cellules fixé à 4 ° C dans l'obscurité. Observer la coloration à l'aide d'un microscope avec filtre approprié et d'une lampe fluorescente. Les anticorps primaires et secondaires optimisés sont répertoriés dans le tableau 1.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips
Shaker	Edmun Bühler	KS-15
Irradiator	CIS Biointernational	IBL 637
Spin coater	Specialty Coating System	P-6708
Scanning Electron Microscope	Philips	XL30CPSEM
Atomic Force Microscope	DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4	Promega	V8902
UV bulb	ESCO
NanoScope analysis software	VEECO		version 1.20
Fluorescence microscope	Olympus	TH45200	Use Volocity 4 Software
Tissue culture plates	Corning, UK	3527
glass slides	Scientific Laboratory Supplies	MIC3308
Diethylene glycol	Sigma–Aldrich	93171
1,6-hexanediol	Sigma–Aldrich	240117
Neopentyl glycol	Sigma–Aldrich	408255
Adipic acid	Sigma–Aldrich	9582
anhydrous N,N-Dimethylformamide	Sigma–Aldrich	227056
Diethyl ether	Sigma–Aldrich	676845
titanium (IV) butoxide	Sigma–Aldrich	244112
1,4-butanediol	Sigma–Aldrich	493732
Vacuum oven	Thermoscientific
4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate)	Sigma–Aldrich	101688
Tetrahydrofurane	Sigma–Aldrich	401757
Sputter coater	Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2)	Gibco	10010031	Store at room temperature
PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20	Scientific Laboratory Supplies Ltd	EC607
Methanol	Scientific Laboratory Supplies Ltd	CHE5010
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich, UK	A7906
MOWIOL 488 DAPI	Calbiochem	475904	Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions
Cell culture and Functional assay
CYP3A activity pGLO kit	Promega	V8902
Hepatozyme	Gibco	17705021
TryLE express	Life Technologies	12604013