Summary
Il saggio Formazione Focus fornisce un metodo semplice per valutare il potenziale di trasformare un oncogene candidato.
Introduction
Le cellule tumorali possono essere distinti dalle loro controparti normali da una vasta gamma di alterazioni, dai modelli di espressione genica per epigenomica ai cambiamenti morfologici e proliferativi. Tra questi ultimi, ridotta dipendenza da siero, perdita di contatto (densità) inibizione, l'acquisizione della proliferazione di ancoraggio-indipendente e, in ultima analisi, la capacità di formare tumori quando iniettate in animali sono utili, indicatori misurabili di trasformazione maligna 3. Diversi in vitro e in vivo sono stati sviluppati per la trasformazione cellulare. In vitro mirare a individuare e cambiamenti nella cultura morfologia (attenzione test formazione), la dinamica della cultura (il tasso di crescita, la densità di saturazione) e fattore di crescita di misura (la crescita nel siero ridotta) o ancoraggio (crescita in soft agar) esigenze. Il gold standard per determinare la natura maligna di un tipo di cellula rimane la formazione di tumori (xenotrapianti) negli animali da esperimento. Tuttavia, tl costo e la durata degli studi in vivo non sempre li rendono giustificabile in una prima fase di validazione o proiezione di oncogeni candidati. Anche se nessun test in vitro fornisce una valutazione definitiva del potenziale oncogeno di un gene, essi forniscono informazioni in potenziale oncogeno che potrebbero restringere futuro studi in vivo. Uno dei sistemi più utilizzati per valutare il potenziale oncogeno in vitro è al centro di Formazione Assay 2. Questo approccio si basa sull'uso di NIH 3T3 fibroblasti di topo, una linea cellulare non trasformato che mostra forte inibizione contatto. Sovraespressione di un oncogene si traduce in perdita di crescita di densità-dipendente; cellule trasformate possono crescere in strati multipli, formando "fuochi", facilmente visualizzato sullo sfondo monostrato di cellule non trasformate. La formazione fuoco Assay, poi, misura la capacità di un oncogene candidato per indurre la trasformazione maligna, come dimostra la perdita di contatto inibition come un fenotipo misurabile. L'FFA è stato utilizzato per valutare la trasformazione da sovraespressione di proteine chinasi (ad esempio, Src 4, BRAF 5), fattori di trascrizione (ad esempio, N-myc 6) recettori, G-accoppiati alle proteine (ad esempio, P2RY8 7) e GTPases (ad esempio, , Ras 1), tra gli altri. La relativa facilità di questo saggio rende una buona scelta che fornirà una risposta rapida e visivamente chiaro se sovraespressione del gene è sufficiente per trasformare cellule di fibroblasti di topo NIH 3T3 in vitro.
L'FFA descritto in questo protocollo utilizza la linea cellulare di confezionamento Plat-E 8, che fornisce proteine virali di imballaggio, e il vettore retrovirale pBABEpuro 9 (Addgene plasmide 1764) per la produzione di retrovirus. Dopo trasfezione con il costrutto pBABEpuro contenente il gene di interesse, la linea cellulare Plat-E produrrà retrovirus ecotropic che può essere utilizzato per infettare cellule NIH 3T3. Til suo metodo virale di consegna del gene è più efficiente rispetto ai metodi di trasfezione chimici tradizionali e offre un modo per esprimere in modo sostenibile il gene 10. Una volta inseriti nel genoma delle cellule NIH 3T3, sovraespressione del gene di interesse è guidato dalla lunghe ripetizioni terminali virali (LTR) promotore 11. Questa costante espressione può essere usato per determinare se il gene di interesse ha attività oncogenica, come misurato dalla formazione di foci, sulle cellule NIH 3T3.
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Protocol
1. Rendere i vettori virali
Le sequenze codificanti per il gene di interesse, così come i controlli positivi e negativi, sono inseriti in pBABEpuro con metodi tradizionali di clonazione (amplificazione PCR, digestione di restrizione e legatura). Ci sono quattro siti di restrizione sul vettore in cui il DNA può essere inserito: BamHI, SnaBI, EcoRI e Sali.
- Preparare trasfezione-grade plasmide DNA dalle cellule competenti mediante il kit plasmide midi QIAGEN.
- Misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop2000.
2. Retrovirus Produzione
La linea cellulare di packaging Plat-E sarà utilizzato per produrre retrovirus ecotropic che porterà il cDNA di interesse per cellule NIH 3T3.
- Stabilire Plat-E culture di cellule congelate
- Scongelare rapidamente cellule Plat-E in un bagno d'acqua ° C 37 e trasferire in una provetta da 15 ml. Lentamente aggiungere 9 ml di Plat-E medio (Dudi lbecco modificato (DMEM) + 10% siero fetale bovino (FBS) + penicillina e streptomicina).
- Centrifugare la provetta a 180 x g per 5 minuti e scartare il surnatante.
- Risospendere le cellule con 10 ml di Plat-E a medio e trasferimento in un piatto di cultura 10 cm.
- Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore fino a quando sono 80-90% confluenti (circa 2 giorni).
- Splitting cellulare
- Aspirare il medio e lavare le cellule una volta con PBS.
- Aggiungere 2 ml di 0,05% tripsina-EDTA e incubare per 1 min a RT.
- Staccare le cellule finger tapping, aggiungere 10 ml di Plat-E di media, e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml.
- Centrifugare la provetta a 180 x g per 5 minuti e scartare il surnatante.
- Risospendere le cellule con 10 ml di Plat-E a medio e sementi in nuovi piatti a 1: 4-1: 6 diluizioni.
- Plat-E Seeding e Transfection
- Seed 2 x 10 6cellule per 10 centimetri piatto di coltura usando Plat-E medio senza antibiotici.
- Incubare le cellule O / N a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
- Il giorno dopo, il trasferimento di 300 ml di Opti-MEM in 1,5 ml provetta da microcentrifuga.
- Aggiungere 27 ml di polyethylenimine (PEI), un costo-efficacia di trasfezione reattivo 12, al tubo preparato con Opti-MEM. Mescolare delicatamente con le dita toccando e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 9 mg di trasfezione-grade plasmide DNA nel tubo Opti-MEM / PEI, mescolare delicatamente con il vortex e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere il DNA / PEI goccia a goccia complesso nel piatto Plat-E, e incubare O / N a 37 ° C, 5% CO 2.
- Il giorno dopo, aspirare il supporto contenente il reagente di trasfezione e aggiungere 10 ml di fresco medio Plat-E (senza antibiotici).
- Riportare le cellule per l'incubatore.
3. Cellule NIH 3T3 e infezioni
- Stabilire NIHCulture 3T3 e il seeding
- Scongelare rapidamente cellule NIH 3T3 in ° C bagnomaria 37 e trasferire in una provetta da 15 ml. Aggiungere lentamente 9 ml di NIH 3T3 medium (DMEM + 10% FBS).
- Centrifugare la provetta a 180 x g per 5 minuti e scartare il surnatante.
- Risospendere le cellule con 10 ml di NIH 3T3 media e il trasferimento ad un piatto di cultura 10 cm.
- Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. È molto importante che le cellule NIH 3T3 sono sempre tenute underconfluent (50-60%), la frequenza di trasformazione spontanea (e quindi i livelli basali di formazione foci) aumenta una volta coltura raggiunga confluenza.
- Seed 3 x 10 5 cellule per 10 centimetri piatto e incubare O / N per l'infezione il giorno successivo.
- Infezione
- Raccogliere il supernatante retrovirale dal piatto Plat-E utilizzando una siringa monouso 10 ml, filtrare attraverso un filtro a membrana di nylon dimensioni 0,45 micron pori, e trasferirlo in un 15 mltube.
- Aggiungere 10 ml di fresco medio Plat-E per le cellule (senza antibiotici), e restituirli alla incubatrice.
- Aspirare il supporto dal piatto delle cellule NIH 3T3 di essere infetti, e aggiungere 5 ml di regolare medie NIH 3T3 e 5 ml di virus contenenti surnatante filtrato.
- Aggiungere polibrene al piatto ad una concentrazione di 6 mg / ml.
- Incubare le cellule O / N a 37 ° C, 5% CO 2.
- Il giorno dopo, ripetere i punti 3.2.1 - 3.2.5 per un secondo turno di infezione.
- Sostituire il supporto contenente il virus, con regolare medio NIH 3T3.
- Lasciare le cellule NIH 3T3 a crescere per 2-3 settimane, sostituendo la soluzione, se necessario. Controllare espressione della proteina di interesse mediante elettroforesi delle proteine convenzionale e immunoblot su lisati cellulari interi da lastre di replica.
4. Colorazione e quantificazione
- Cristallo viola colorazione
- Aspirare il mezzo di NIH 3T3 e posizionare i piattisul ghiaccio.
- Lavare i piatti due volte con PBS freddo.
- Fissare le cellule con metanolo ghiacciata per 10 min.
- Togliere i piatti da ghiaccio, aspirare il metanolo, e aggiungere 3 ml di soluzione di cristallo viola 0,5% effettuati nel 25% di metanolo (RT).
- Incubare i piatti per 5 minuti a RT.
- Aspirare la soluzione a cristalli viola e risciacquare accuratamente il piatto con Milli-Q H 2 O fino a quando nessun colore si stacca nel risciacquo.
- Lasciare i piatti asciugare O / N su un banco (scoperto).
- Foci Quantificazione
- Una volta che i piatti sono asciutti, utilizzare un righello per misurare le collezioni di colore scuro di cellule sulla piastra. Contano solo quelli che sono più di 5 mm di diametro come "focolai". Registrare il numero di focolai e calcolare le medie e il significato rispetto ai controlli.
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Representative Results
MXD3 è un fattore fondamentale cerniera elica-ansa-elica leucina (bHLHZ) di trascrizione che è un membro del MYC / MAX / network MAD. Si tratta di un atipico membro della famiglia MAD 13-15, ed è stato segnalato per essere coinvolti nella carcinogenesi 16,17. Rispetto al pBABEpuro (controllo negativo) e MYC (controllo positivo), i piatti NIH 3T3 dove era sovraespresso MXD3 era significativamente inferiore foci (Figura 1A). I dati della figura 1B sono stati raccolti da più esperimenti per determinare significato.
C'era interesse iniziale nel determinare il potenziale oncogeno di MXD3 perché ha un'attività simile al MYC (l'oncogene noto). Tuttavia, i risultati di questo test indicano che MXD3 non funziona come un oncogene.
Figura 1. Messa a fuoco test formazionerisultati. Il potenziale oncogeno di MXD3 è stata determinata mediante test formazione messa a fuoco (FFA) in cellule NIH 3T3. (A) Immagini di cellule da un singolo esperimento macchiato con Hema 3. Nota: Crystal Violet possono essere utilizzati come alternativa macchia. (B) i risultati combinati di tre esperimenti. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato. Fuoco conta per ciascun esperimento sono i seguenti: Esperimento # 1: pBABEpuro (13, 11), MXD3 (3, 4), MYCN (23, 19); Esperimento # 2: pBABEpuro (8, 7), MXD3 (1, 0), MYCN (22, 20); Esperimento # 3: pBABEpuro (9, 20), MXD3 (3, 0), MYCN (21, 12). Barre di errore rappresentano la deviazione standard del numero di focolai tra i tre esperimenti. Significato: ** p <0.01; *** P <0.001. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La FFA fornisce un metodo semplice e veloce per valutare trasformazione maligna in vitro. E 'suscettibile di proiezione di un numero relativamente elevato di geni candidati, e le sue esigenze tecniche modeste rendono conveniente. Inoltre, due o più geni possono essere coexpressed (talvolta indicato come un saggio "cooperazione") per valutare il potenziale cancerogeno della combinazione. I vantaggi di questo test si basano sulla sua tecnica semplice, la facilità di quantificazione e la sua relativamente breve tempo di ritorno. Si deve sottolineare, tuttavia, che non pongono dei limiti di tutti i saggi in vitro. Il test valuta la trasformazione oncogenica misurando una caratteristica fenotipica di cellule cancerose, vale a dire, la loro capacità di crescere oltre un monostrato in un piatto di coltura. Risultati negativi, quindi, devono essere interpretati con cautela, come un particolare oncogene può indurre trasformazione senza promuovere questa particolare phenotype può richiedere o coespressione con un altro gene (cioè, la cooperazione di cui sopra). In questo caso, si consiglia di valutare trasformazione con altri metodi in vitro, come la determinazione del tasso di proliferazione e requisiti di siero e / o ancoraggio crescita indipendente, per esempio, il saggio agar morbido.
Anche se la tecnica di FFA è semplice, devono essere rispettate alcune condizioni. La cosa più importante, è fondamentale utilizzare un subclone di 3T3 che mostra molto basso trasformazione spontanea. Essendo pre-neoplastica (una caratteristica che rende questa linea cellulare molto sensibile per questo test), alcune fiale possono contenere un numero significativo di cellule già trasformate, con conseguente inaccettabilmente elevati livelli basali per il saggio. Per minimizzare trasformazione spontanea è molto importante che la coltura è ottenuto a partire da una fonte affidabile. Inoltre, le cellule devono essere subcoltivate ad intervalli regolari e mai portati a confluenza.Si consiglia di passare culture quando raggiungono circa il 50% di confluenza. Per questa ragione, è importante creare costrutti aggiuntivi da utilizzare come controlli. Nei nostri esperimenti, abbiamo utilizzato pBABEpuro contenenti MYC (un oncogene noto) 18 e pBABEpuro vuoto per servire come il controllo positivo e negativo, rispettivamente.
Il costrutto di interesse può essere introdotto nelle cellule 3T3 utilizzando una varietà di metodi; più comunemente, sono stati utilizzati metodi di trasfezione tradizionali. Nel protocollo qui presentato, l'uso di trasduzione virale fornisce un metodo affidabile, efficiente e coerente di consegna del gene. Inoltre, l'uso di retrovirus ecotropic rende questo dosaggio relativamente sicuro nella manipolazione di potenziali costrutti oncogeni; tuttavia, le precauzioni di sicurezza biologica adeguate devono naturalmente essere seguiti.
Nell'effettuare il protocollo di cui sopra, gli esperimenti piastra replica devono essere eseguite in modo da entrambe le celle macchia e raccolta da quelle plAtes. Le cellule raccolte possono poi essere utilizzati per confermare sovraespressione del gene-di-interessi per immunoblot.
Sebbene consegna gene virale presenta diversi vantaggi rispetto alla trasformazione, va notato che lo fa presentare alcuni svantaggi, e molti laboratori usano ancora protocolli standard di trasformazione. Trasduzione virale può non essere adatto se è necessaria una forte sovraespressione; d'altra parte, la rilevanza fisiologica di livelli molto elevati di espressione raggiunti da trasfezione plasmide può essere discutibile.
Infine, va sottolineato che un secondo test è di solito necessario verificare che i focolai sono dovuti alla trasformazione oncogenica. Foci possono essere ritirati (prima colorazione) e coltivate in soft-agar per confermare la proliferazione di ancoraggio-indipendente.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da New Innovator Award Program del direttore NIH (ED). AA è stato sostenuto in parte da premi di laurea dal National Cancer Institute e la National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pBABE-puro vector | Addgene | Plasmid 1764 | cloning vector |
| Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic | Cell Biolabs, Inc. | RV-101 | cell line for viral production |
| NIH 3T3 Cell Line murine | Sigma-Aldrich | 93061524 | cell line for focus formation assay |
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe | BD Biosciences | 309604 | viral production reagent |
| 0.45 μm Puradisc Syringe Filter | Whatman | 6750-2504 | viral production reagent |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc. | 23966-2 | cell transfection reagent |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | EMD Millipore | TR-1003-G | cell transfection reagent |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | cell stain reagent |
| Plasmid Plus Midi Kit | QIAGEN | 12945 | plasmid purification |
| BD Falcon Tissue Culture Dishes | BD Biosciences | 353003 | cell culture supplies |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | cell culture media |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | cell culture supplies |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-062 | cell culture media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | cell culture media |
References
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