Summary
फोकस गठन परख एक उम्मीदवार ओंकोजीन के बदलने क्षमता का आकलन करने के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है।
Introduction
ट्यूमर कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के पैटर्न से रूपात्मक और proliferative परिवर्तन करने के लिए epigenomics करने के लिए, परिवर्तन की एक विस्तृत श्रृंखला से अपने सामान्य समकक्षों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। बाद में, अंत में, जानवरों में इंजेक्शन जब ट्यूमर फार्म की क्षमता घातक परिवर्तन 3 की उपयोगी, औसत दर्जे का संकेतक हैं, सीरम पर निर्भरता, संपर्क (घनत्व) निषेध की हानि, लंगर स्वतंत्र प्रसार के अधिग्रहण के लिए कम और। इन विट्रो में और vivo assays में कई सेलुलर परिवर्तन के लिए विकसित किया गया है। इन विट्रो assays उद्देश्य (कम सीरम में वृद्धि) की पहचान करने और संस्कृति आकृति विज्ञान (फोकस गठन परख), संस्कृति गतिशीलता (विकास दर, संतृप्ति घनत्व) और विकास का पहलू में परिवर्तन को मापने में या आवश्यकताओं लंगर (नरम अगर में वृद्धि)। एक सेल प्रकार का घातक प्रकृति का निर्धारण करने के लिए स्वर्ण मानक प्रायोगिक पशुओं में ट्यूमर गठन (xenografts) बनी हुई है। हालांकि, टीवह लागत और vivo अध्ययन की लंबाई हमेशा उम्मीदवार ओंकोजीन की पहली सत्यापन कदम या स्क्रीनिंग के रूप में उन्हें न्यायोचित नहीं बनाते हैं। कोई इन विट्रो परख एक जीन के oncogenic क्षमता का एक निश्चित आकलन प्रदान करता है, वे vivo अध्ययन में भविष्य के नीचे संकीर्ण हो सकता है कि oncogenic क्षमता में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। इन विट्रो में oncogenic संभावित मूल्यांकन के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रणालियों में से एक फोकस गठन परख 2 है। यह दृष्टिकोण एनआईएच 3T3 माउस तंतुप्रसू, मजबूत संपर्क निषेध से पता चलता है कि एक गैर तब्दील सेल लाइन के उपयोग पर निर्भर करता है। घनत्व पर निर्भर विकास के नुकसान में एक ओंकोजीन परिणामों की overexpression; बदल कोशिकाओं तो आसानी से गैर-बदल कोशिकाओं की पृष्ठभूमि monolayer के खिलाफ कल्पना "foci", बनाने, कई परतों में विकसित कर सकते हैं। संपर्क inhib के नुकसान के सबूत के रूप फोकस गठन परख, तो, घातक परिवर्तन के लिए प्रेरित करने के लिए एक उम्मीदवार ओंकोजीन की क्षमता के उपायएक औसत दर्जे का phenotype के रूप में ition। एफएफए (जैसे, एसआरसी 4, BRAF 5) प्रोटीन kinases की overexpression, प्रतिलेखन कारक (उदाहरण के लिए, एन-MYC 6) (जैसे, P2RY8 7), जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स और GTPases (जैसे द्वारा परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है , रास 1), दूसरों के बीच में। इस परख के रिश्तेदार आसानी यह जीन की overexpression इन विट्रो में एनआईएच 3T3 माउस fibroblast कोशिकाओं को बदलने के लिए पर्याप्त है कि क्या करने के लिए एक त्वरित और नेत्रहीन स्पष्ट जवाब प्रदान करेगा कि एक अच्छा विकल्प बनाती है।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित एफएफए वायरल पैकेजिंग प्रोटीन प्रदान करता है जो बेनी-ई पैकेजिंग सेल लाइन 8, का उपयोग करता है, और रेट्रोवायरल वेक्टर pBABEpuro 9 (Addgene प्लाज्मिड 1764) रेट्रोवायरस निर्माण करने के लिए। ब्याज की जीन से युक्त pBABEpuro निर्माण के साथ अभिकर्मक के बाद, बेनी-ई सेल लाइन एनआईएच 3T3 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि ecotropic रेट्रोवायरस का उत्पादन होगा। टीजीन डिलीवरी के अपने वायरल विधि पारंपरिक रासायनिक अभिकर्मक तरीकों की तुलना में अधिक कुशल है और यह स्थायी जीन 10 व्यक्त करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है। एक बार एनआईएच 3T3 कोशिकाओं के जीनोम में शामिल किया है, ब्याज की जीन की overexpression वायरल लंबे टर्मिनल दोहराता (लीटर) प्रमोटर 11 से प्रेरित है। यह लगातार अभिव्यक्ति एनआईएच 3T3 कोशिकाओं पर foci के गठन, द्वारा मापा के रूप में ब्याज की जीन, oncogenic गतिविधि है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
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Protocol
1. वायरल वाहक बनाना
ब्याज की जीन है, साथ ही सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के लिए कोडिंग दृश्यों, पारंपरिक क्लोनिंग तरीकों (पीसीआर प्रवर्धन, प्रतिबंध पाचन और बंधाव) द्वारा pBABEpuro में डाला जाता है। BamHI, SnaBI, EcoRI और साली: डीएनए डाला जा सकता है, जहां वेक्टर पर चार प्रतिबंध साइटों रहे हैं।
- QIAGEN प्लाज्मिड मिडी किट का उपयोग सक्षम कोशिकाओं से अभिकर्मक ग्रेड प्लास्मिड डीएनए तैयार करें।
- एक NanoDrop2000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग डीएनए एकाग्रता उपाय।
2. retrovirus उत्पादन
बेनी-ई पैकेजिंग सेल लाइन एनआईएच 3T3 कोशिकाओं के लिए ब्याज की सीडीएनए उद्धार करेगा कि ecotropic रेट्रोवायरस निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
- जमे हुए कोशिकाओं से बेनी-ई संस्कृतियों की स्थापना
- जल्दी से एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में बेनी-ई कोशिकाओं पिघलना और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण। धीरे धीरे (दू बेनी-ई मध्यम के 9 मिलीलीटर जोड़नेlbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) + पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन)।
- 180 एक्स पर ट्यूब अपकेंद्रित्र जी 5 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
- एक 10 सेमी संस्कृति डिश के लिए बेनी-ई मध्यम और हस्तांतरण के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
- वे 80-90% मिला हुआ (के बारे में 2 दिन) कर रहे हैं जब तक एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं।
- सेल बंटवारे
- मध्यम Aspirate और पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें।
- 0.05% trypsin-EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़ें और आरटी पर 1 मिनट के लिए सेते हैं।
- , दोहन उंगली से कोशिकाओं को अलग बेनी-ई के माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब सेल निलंबन हस्तांतरण।
- 180 एक्स पर ट्यूब अपकेंद्रित्र जी 5 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
- बेनी-ई के माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं Resuspend और एक पर नए बर्तन में उन्हें बीज: 4-1: 6 dilutions के।
- बेनी-ई सीडिंग और अभिकर्मक
- बीज 2 एक्स 10 6किसी भी एंटीबायोटिक दवाओं के बिना बेनी-ई माध्यम का उपयोग कर 10 सेमी संस्कृति डिश प्रति कोशिकाओं।
- एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं हे / एन सेते हैं।
- अगले दिन, 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में Opti- सदस्य के 300 μl हस्तांतरण।
- Opti- सदस्य के साथ तैयार ट्यूब, polyethylenimine के 27 μl (पी), एक लागत प्रभावी अभिकर्मक अभिकर्मक 12 जोड़ें। दोहन उंगली से धीरे मिक्स और आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
- , Opti- सदस्य / पी ट्यूब में अभिकर्मक ग्रेड प्लास्मिड डीएनए के 9 माइक्रोग्राम प्रति जोड़ें vortexing द्वारा धीरे मिश्रण, और आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
- जोड़ें डीएनए / पी बेनी-ई डिश में, और 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते जटिल वार ड्रॉप, 5% सीओ 2।
- अगले दिन, अभिकर्मक अभिकर्मक युक्त मध्यम महाप्राण और (एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) ताजा बेनी-ई के माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
- इनक्यूबेटर में कोशिकाओं लौटें।
3. एनआईएच 3T3 कोशिकाओं और संक्रमण
- एनआईएच की स्थापना3T3 संस्कृति और सीडिंग
- जल्दी से एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एनआईएच 3T3 कोशिकाओं पिघलना और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण। धीरे धीरे एनआईएच 3T3 मध्यम (DMEM 10% FBS) के 9 मिलीलीटर जोड़ने।
- 180 एक्स पर ट्यूब अपकेंद्रित्र जी 5 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
- एक 10 सेमी संस्कृति डिश के लिए एनआईएच 3T3 मध्यम और हस्तांतरण के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं Resuspend।
- एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं। यह सहज परिवर्तन (और foci के गठन की इसलिए बेसल स्तर) की आवृत्ति के रूप में एक संस्कृति confluency तक पहुँचता एक बार बढ़ जाती है, एनआईएच 3T3 कोशिकाओं हमेशा underconfluent (50-60%) रखा जाता है कि बहुत महत्वपूर्ण है।
- 10 सेमी पकवान प्रति बीज 3 एक्स 10 5 कोशिकाओं और अगले दिन के संक्रमण के लिए हे / एन सेते हैं।
- संक्रमण
- एक 0.45 माइक्रोन रोमकूप आकार नायलॉन झिल्ली फिल्टर के माध्यम से इसे छान, एक 10 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सिरिंज का उपयोग कर, और एक 15 मिलीलीटर में स्थानांतरित द्वारा बेनी-ई पकवान से रेट्रोवायरल सतह पर तैरनेवाला फसलटूबे।
- (एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) कोशिकाओं को ताजा बेनी-ई के माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें, और इनक्यूबेटर में उन्हें वापस।
- संक्रमित होने की एनआईएच 3T3 सेल पकवान से मध्यम Aspirate, और वायरस युक्त फ़िल्टर्ड सतह पर तैरनेवाला के 5 नियमित एनआईएच 3T3 माध्यम की मिलीग्राम और 5 मिलीलीटर जोड़ें।
- छह माइक्रोग्राम प्रति / एमएल की एकाग्रता में डिश के लिए polybrene जोड़ें।
- 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं हे / एन सेते हैं।
- संक्रमण के दूसरे दौर के लिए 3.2.5 - अगले दिन, दोहराने 3.2.1 कदम।
- नियमित एनआईएच 3T3 माध्यम के साथ वायरस युक्त मध्यम बदलें।
- आवश्यक के रूप में मध्यम जगह, एनआईएच 3T3 कोशिकाओं 2-3 सप्ताह के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दें। प्रतिकृति प्लेटों से पूरे सेल lysates पर पारंपरिक प्रोटीन वैद्युतकणसंचलन और immunoblot द्वारा ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति की जाँच करें।
4. धुंधला और मात्रा का ठहराव
- क्रिस्टल वायलेट धुंधला
- एनआईएच 3T3 मध्यम Aspirate और व्यंजन जगहबर्फ पर।
- ठंडा पीबीएस के साथ दो बार बर्तन धो लें।
- 10 मिनट के लिए बर्फ ठंड मेथनॉल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
- , बर्फ से बर्तन निकालें मेथनॉल महाप्राण, और 25% मेथनॉल (आरटी) में की गई 0.5% क्रिस्टल बैंगनी समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें।
- आरटी पर 5 मिनट के लिए व्यंजन सेते हैं।
- क्रिस्टल बैंगनी समाधान Aspirate और कोई रंग कुल्ला में उतर आता है, जब तक ध्यान से मिल्ली क्यू एच 2 ओ के साथ पकवान कुल्ला।
- व्यंजन एक benchtop पर हे / एन सूखे की अनुमति दें (खुला)।
- Foci मात्रा
- व्यंजन सूख रहे हैं एक बार, थाली पर कोशिकाओं के अंधेरे में रंगीन संग्रह को मापने के लिए एक शासक का उपयोग करें। केवल के रूप में व्यास में अधिक से अधिक से अधिक 5 मिमी हैं कि उन गिनती "foci।" Foci के संख्या रिकॉर्ड और औसत और नियंत्रण की तुलना में महत्व की गणना।
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Representative Results
MXD3 MYC / मैक्स / पागल नेटवर्क का एक सदस्य है कि एक बुनियादी हेलिक्स पाश-हेलिक्स leucine जिपर (bHLHZ) प्रतिलेखन कारक है। यह पागल परिवार 13-15 की एक असामान्य सदस्य है, और यह कैंसरजनन 16,17 में शामिल होने की सूचना दी गई है। PBABEpuro (नकारात्मक नियंत्रण) और MYC (सकारात्मक नियंत्रण) की तुलना में, MXD3 overexpressed गया था, जहां एनआईएच 3T3 व्यंजन काफी कम foci (चित्रा 1 ए) के लिए किया था। चित्रा 1 बी में डेटा महत्व को निर्धारित करने के लिए कई प्रयोगों से एकत्र किए गए थे।
यह MYC करने के लिए इसी तरह की गतिविधि (ज्ञात ओंकोजीन) है क्योंकि MXD3 के oncogenic क्षमता का निर्धारण करने में प्रारंभिक ब्याज हुई थी। हालांकि, इस परख से परिणाम MXD3 एक ओंकोजीन के रूप में कार्य नहीं कर रहा है कि सलाह देते हैं।
चित्रा 1. फोकस गठन परखपरिणाम है। MXD3 के oncogenic संभावित एनआईएच 3T3 कोशिकाओं में ध्यान देने के गठन परख (एफएफए) द्वारा निर्धारित किया गया था। हेमा 3. नोट के साथ दाग एक ही प्रयोग से कोशिकाओं की (ए) छवियाँ: क्रिस्टल वायलेट एक विकल्प के दाग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। (बी) के तीन प्रयोगों से संयुक्त परिणाम। सभी प्रयोगों दो प्रतियों में प्रदर्शन किया गया। फोकस इस प्रकार हैं एक प्रयोग के लिए मायने रखता है: प्रयोग # 1: pBABEpuro (13, 11), MXD3 (3, 4), MYCN (23, 19); प्रयोग # 2: pBABEpuro (8, 7), MXD3 (1, 0), MYCN (22, 20); प्रयोग # 3: pBABEpuro (9, 20), MXD3 (3, 0), MYCN (21, 12)। त्रुटि सलाखों तीन प्रयोगों भर foci के संख्या के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। महत्व: ** पी <0.01; *** पी <0.001। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
एफएफए इन विट्रो में घातक परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए एक त्वरित और आसान तरीका प्रदान करता है। यह उम्मीदवार जीन की एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या की स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदायी है, और उसके मामूली तकनीकी आवश्यकताओं यह लागत प्रभावी बनाने। इसके अलावा, दो या दो से अधिक जीन coexpressed किया जा सकता है संयोजन के tumorigenic क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए (कभी कभी एक "सहयोग" परख के रूप में करने के लिए कहा गया है)। इस परख का लाभ अपने सरल तकनीक है, मात्रा का ठहराव के अपने आसानी और इसके अपेक्षाकृत कम बारी के आसपास समय पर भरोसा करते हैं। यह सब इन विट्रो assays की सीमाओं को पैदा करता है, तथापि, कि जोर दिया जाना चाहिए। परख कैंसर कोशिकाओं के एक प्ररूपी विशेषता को मापने के द्वारा oncogenic परिवर्तन का मूल्यांकन करता है, अर्थात्, उनकी क्षमता एक संस्कृति डिश में एक monolayer परे विकसित करने के लिए। नकारात्मक परिणाम है, इसलिए इस विशेष phenotyp को बढ़ावा देने के बिना परिवर्तन के लिए प्रेरित कर सकते हैं एक विशेष ओंकोजीन के रूप में, सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिएई या किसी अन्य जीन (यानी, सहयोग उपर्युक्त) के साथ coexpression आवश्यकता हो सकती है। इस मामले में, यह उदाहरण के लिए इस तरह के प्रसार की दर और सीरम आवश्यकताओं और / या द्वारा लंगर स्वतंत्र विकास के लिए दृढ़ संकल्प के रूप में अन्य के लिए इन विट्रो विधियों, नरम अगर परख द्वारा परिवर्तन का आकलन करने के लिए सिफारिश की है।
एफएफए तकनीक सीधा है, यद्यपि कई स्थितियों मनाया जाना चाहिए। सबसे महत्वपूर्ण बात, यह बहुत कम सहज परिवर्तन से पता चलता है कि 3T3 कोशिकाओं के एक subclone उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। पूर्व neoplasic (इस सेल लाइन इस परख के लिए बहुत संवेदनशील बनाता है एक सुविधा) होने के नाते, कुछ शीशियों परख के लिए अस्वीकार्य उच्च बेसल स्तर में जिसके परिणामस्वरूप, पहले से ही बदल कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या हो सकती है। सहज परिवर्तन को कम से कम करने के लिए इसे शुरू करने की संस्कृति एक सम्मानित स्रोत से प्राप्त किया जाता है कि बहुत महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, कोशिकाओं नियमित अंतराल पर subcultured और confluency तक पहुँचने के लिए अनुमति कभी नहीं किया जाना चाहिए।वे लगभग 50% confluency तक पहुँचने जब हम संस्कृतियों गुजर सलाह देते हैं। इस कारण से, यह नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए अतिरिक्त निर्माणों को बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। हमारे प्रयोगों में, हम क्रमशः, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए MYC (एक ज्ञात ओंकोजीन) 18 और खाली pBABEpuro युक्त pBABEpuro इस्तेमाल किया।
ब्याज के निर्माण के तरीकों की एक किस्म का उपयोग 3T3 कोशिकाओं में पेश किया जा सकता है; सबसे अधिक परंपरागत अभिकर्मक तरीकों का इस्तेमाल किया गया है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, वायरल पारगमन का उपयोग जीन प्रसव के एक विश्वसनीय, कुशल और सुसंगत तरीका प्रदान करता है। संभावित oncogenic निर्माणों से निपटने इसके अलावा, जब ecotropic रेट्रोवायरस का उपयोग इस परख अपेक्षाकृत सुरक्षित बनाता है; हालांकि, उचित जैव सुरक्षा सावधानियों पाठ्यक्रम का पालन किया जाना चाहिए।
ऊपर प्रोटोकॉल का आयोजन करते हैं, प्रतिकृति थाली प्रयोगों PL उन दोनों से दाग और फसल कोशिकाओं के क्रम में किया जाना चाहिएates। काटा कोशिकाओं तो जीन के हित immunoblot द्वारा की overexpression पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
परिवर्तन की तुलना में जब वायरल जीन डिलीवरी के कई फायदे प्रस्तुत करता है, यह यह के रूप में अच्छी तरह से कुछ नुकसान पेश करता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए, और कई प्रयोगशालाओं अभी भी मानक परिवर्तन प्रोटोकॉल का उपयोग करें। मजबूत overexpression की जरूरत है जब वायरल पारगमन उपयुक्त नहीं हो सकता; दूसरी ओर, प्लाज्मिड अभिकर्मक द्वारा हासिल की अभिव्यक्ति की बहुत उच्च स्तर की शारीरिक प्रासंगिकता संदिग्ध हो सकता है।
अंत में, यह एक दूसरे परख आमतौर पर foci oncogenic परिवर्तन के कारण हैं कि सत्यापित करने के लिए आवश्यक है कि जोर दिया जाना चाहिए। Foci (धुंधला) से पहले उठाया और लंगर स्वतंत्र प्रसार पुष्टि करने के लिए नरम-अगर में उगाया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम एनआईएच निदेशक नई अन्वेषक पुरस्कार कार्यक्रम (ईडी) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। ए.ए. राष्ट्रीय कैंसर संस्थान और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से स्नातक पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pBABE-puro vector | Addgene | Plasmid 1764 | cloning vector |
| Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic | Cell Biolabs, Inc. | RV-101 | cell line for viral production |
| NIH 3T3 Cell Line murine | Sigma-Aldrich | 93061524 | cell line for focus formation assay |
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe | BD Biosciences | 309604 | viral production reagent |
| 0.45 μm Puradisc Syringe Filter | Whatman | 6750-2504 | viral production reagent |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc. | 23966-2 | cell transfection reagent |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | EMD Millipore | TR-1003-G | cell transfection reagent |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | cell stain reagent |
| Plasmid Plus Midi Kit | QIAGEN | 12945 | plasmid purification |
| BD Falcon Tissue Culture Dishes | BD Biosciences | 353003 | cell culture supplies |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | cell culture media |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | cell culture supplies |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-062 | cell culture media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | cell culture media |
References
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