Summary
El ensayo Focus Formación ofrece un método sencillo para evaluar el potencial de transformación de un oncogén candidato.
Introduction
Las células tumorales se pueden distinguir de sus homólogos normales por una amplia gama de alteraciones, a partir de patrones de expresión génica a epigenomics a cambios morfológicos y proliferativas. Entre estos últimos, la reducción de la dependencia de suero, la pérdida de contacto (densidad) la inhibición, la adquisición de la proliferación independiente de anclaje y, en última instancia, la capacidad de formar tumores cuando se inyectan en animales son útiles, indicadores medibles de la transformación maligna 3. Varios in vitro y en ensayos in vivo se han desarrollado para la transformación celular. Los ensayos in vitro como objetivo la identificación y medición de los cambios en la morfología de cultivo (ensayo de formación de foco), la dinámica de cultivo (tasa de crecimiento, densidad de saturación) y factor de crecimiento (crecimiento en el suero reducida) o fondeadero (crecimiento en agar blando) requisitos. El estándar de oro para la determinación de la naturaleza maligna de un tipo de célula sigue siendo la formación de tumores (xenoinjertos) en animales de experimentación. Sin embargo, tl costo y la duración de los estudios in vivo no siempre hacen justificable como un primer paso de validación o screening de oncogenes candidatos. Aunque no hay ensayo in vitro proporciona una evaluación definitiva de la potencial oncogénico de un gen, que no proporcionan información sobre potencial oncogénico que pueden reducir futuro en estudios in vivo. Uno de los sistemas más utilizados para evaluar el potencial oncogénico in vitro es la formación de ensayo Focus 2. Este enfoque se basa en el uso de NIH 3T3 de fibroblastos de ratón, una línea de células no transformadas que muestra la inhibición por contacto fuerte. La sobreexpresión de un oncogén resultados en pérdida de crecimiento dependiente de la densidad; a continuación, las células transformadas pueden crecer en múltiples capas, formando "focos", fácil de visualizar contra la monocapa de fondo de células no transformadas. La formación de focos de ensayo, a continuación, mide la capacidad de un oncogén candidato para inducir la transformación maligna, como lo demuestra la pérdida de contacto inhibition como un fenotipo medible. El FFA ha sido utilizado para evaluar la transformación por la sobreexpresión de las proteínas quinasas (por ejemplo, Src 4, 5 BRAF), factores de transcripción (por ejemplo, N-myc 6) receptores, G acoplados a la proteína (por ejemplo, P2RY8 7) y GTPasas (por ejemplo, , Ras 1), entre otros. La relativa facilidad de este ensayo hace que sea una buena opción que proporcionará una respuesta rápida y visualmente claro si la sobreexpresión del gen es suficiente para transformar células de fibroblastos de ratón NIH 3T3 in vitro.
El FFA se describe en este protocolo utiliza la línea celular de empaquetamiento Plat-E 8, que proporciona proteínas de empaquetamiento virales, y el vector retroviral pBabePuro 9 (Addgene plásmido 1764) para producir retrovirus. Después de la transfección con el constructo de pBabePuro que contiene el gen de interés, la línea celular Plat-E producirá retrovirus ecotrópico que se puede utilizar para infectar células NIH 3T3. Tsu método viral del suministro de genes es más eficiente que los métodos de transfección química tradicionales y ofrece una manera de expresar el gen sostenible 10. Una vez incorporado en el genoma de las células NIH 3T3, la sobreexpresión del gen de interés es impulsado por el promotor viral repeticiones terminales largas (LTR) 11. Esta expresión constante se puede utilizar para determinar si el gen de interés tiene actividad oncogénica, medida por la formación de focos, en las células NIH 3T3.
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Protocol
1. Hacer los vectores virales
Las secuencias de codificación para el gen de interés, así como los controles positivos y negativos, se insertan en pBabePuro por los métodos tradicionales de clonación (amplificación por PCR, digestión de restricción y ligadura). Hay cuatro sitios de restricción en el vector donde se puede insertar el ADN: BamHI, SnaBI, EcoRI y SalI.
- Preparar transfección grado plásmido de ADN a partir de células competentes utilizando el kit de plásmido QIAGEN midi.
- Medir la concentración de ADN usando un espectrofotómetro NanoDrop2000.
2. Retrovirus Producción
La línea celular de empaquetamiento Plat-E se puede utilizar para producir retrovirus ecotrópico que entregará el ADNc de interés a las células NIH 3T3.
- Establecer Plat-E culturas de células congeladas
- Descongelar rápidamente las células Plat-E en un baño de agua ° C 37 y transferir a un tubo cónico de 15 ml. Poco a poco agregue 9 ml de medio Plat-E (DuMedio Eagle Modificado de lbecco (DMEM) + 10% de suero bovino fetal (FBS) + penicilina y estreptomicina).
- Centrifugar el tubo a 180 x g durante 5 min y descartar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las células con 10 ml de medio Plat-E y la transferencia a una placa de cultivo de 10 cm.
- Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora hasta que son 80-90% de confluencia (aproximadamente 2 días).
- La división celular
- Aspirar el medio y lavar las células una vez con PBS.
- Añadir 2 ml de 0,05% de tripsina-EDTA y se incuba durante 1 min a TA.
- Separe las células por el dedo de tapping, añadir 10 ml de medio Plat-E, y transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml.
- Centrifugar el tubo a 180 x g durante 5 min y descartar el sobrenadante.
- Resuspender las células con 10 ml de medio Plat-E y sembrar en nuevos platos en 1: 4-1: 6 diluciones.
- Plat-E Siembra y transfección
- Semilla 2 x 10 6células por placa de 10 cm de cultivo utilizando medio Plat-E sin antibióticos.
- Se incuban las células O / N en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora.
- Al día siguiente, la transferencia de 300 l de Opti-MEM en 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
- Añadir 27 l de polietilenimina (PEI), un reactivo de transfección rentable 12, al tubo preparado con Opti-MEM. Mezclar suavemente por el dedo tocando e incubar durante 5 min a TA.
- Añadir 9 g de ADN plásmido de grado de transfección en el tubo de Opti-MEM / PEI, mezclar suavemente mediante agitación con vórtex, y se incuba durante 15 min a TA.
- Añadir el ADN / PEI complejo gota a gota en el plato Plat-E, e incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Al día siguiente, aspirar el medio que contiene el reactivo de transfección y agregar 10 ml de medio Plat-E fresco (sin antibióticos).
- Devolver las células a la incubadora.
3. Las células NIH 3T3 y la infección
- El establecimiento de los NIHCulturas 3T3 y Siembra
- Descongelar rápidamente las células NIH 3T3 en un baño de agua ° C 37 y transferir a un tubo de 15 ml. Poco a poco agregue 9 ml de medio NIH 3T3 (DMEM + 10% FBS).
- Centrifugar el tubo a 180 x g durante 5 min y descartar el sobrenadante.
- Resuspender las células con 10 ml de medio y la transferencia de NIH 3T3 a una placa de cultivo de 10 cm.
- Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. Es muy importante que las células NIH 3T3 se mantienen siempre underconfluent (50-60%), como la frecuencia de transformación espontánea (y, por tanto, los niveles basales de la formación de focos) aumenta una vez al cultivo alcanza la confluencia.
- Seed 3 x 10 5 células por placa de 10 cm y se incuban O / N para la infección el día siguiente.
- Infección
- Se recoge el sobrenadante retroviral de la placa de Plat-E mediante el uso de una jeringa desechable de 10 ml, filtrándola a través de un filtro de membrana de nylon de 0,45 micras de tamaño de poro, y transferir en un 15 mltubo.
- Añadir 10 ml de medio Plat-E fresco a las células (sin antibióticos), y devolverlos a la incubadora.
- Aspirar el medio de la placa de células NIH 3T3 de estar infectados, y añadir 5 ml de medio regular de NIH 3T3 y 5 ml de sobrenadante filtrado que contiene el virus.
- Añadir al plato polibreno a una concentración de 6 mg / ml.
- Se incuban las células O / N a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Al día siguiente, repita los pasos 3.2.1 - 3.2.5 para una segunda ronda de la infección.
- Sustituya el medio que contiene el virus con medio normal NIH 3T3.
- Permitir que las células NIH 3T3 crecer durante 2-3 semanas, reemplazando el medio según sea necesario. Compruebe expresión de la proteína de interés por electroforesis de proteínas convencional y inmunoblot sobre lisados de células enteras de placas de réplica.
4. La tinción y cuantificación
- Tinción con cristal violeta
- Aspirar el medio NIH 3T3 y coloque los platosen hielo.
- Lavar los platos dos veces con helado de PBS.
- Fijar las células con metanol enfriado con hielo durante 10 min.
- Quitar los platos de hielo, aspirar el metanol, y añadir 3 ml de solución de cristal violeta al 0,5% hechos en 25% de metanol (RT).
- Incubar los platos durante 5 min a RT.
- Aspirar la solución de cristal violeta y enjuague cuidadosamente el plato con Milli-Q H 2 O hasta que no hay color sale en el enjuague.
- Deje que los platos se sequen O / N en una mesa de trabajo (al descubierto).
- Focos Cuantificación
- Una vez que los platos están secos, use una regla para medir las colecciones de color oscuro de las células en el plato. Sólo contar los que son mayores que 5 mm de diámetro como "focos". Registrar el número de focos y calcular los promedios y la importancia en comparación con los controles.
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Representative Results
MXD3 es un factor de transcripción de la cremallera de leucina básica hélice-bucle-hélice (bHLHZ) que es un miembro de la MYC / MAX / MAD red. Es un miembro atípico de la familia MAD 13-15, y se ha informado a participar en la carcinogénesis 16,17. Cuando se compara con pBabePuro (control negativo) y MYC (control positivo), los platos NIH 3T3 donde se sobreexpresa MXD3 tuvieron significativamente menos focos (Figura 1A). Los datos en la Figura 1B se recogieron a partir de múltiples experimentos para determinar la significación.
Hubo interés inicial para determinar el potencial oncogénico de MXD3 porque tiene una actividad similar a MYC (oncogén conocido). Sin embargo, los resultados de este ensayo indican que MXD3 no funciona como un oncogén.
Figura ensayo de formación 1. Enfoqueresultados. El potencial oncogénico de MXD3 se determinó mediante el ensayo de formación de focos (FFA) en las células NIH 3T3. (A) Imágenes de células de un solo experimento manchado con Hema 3. Nota: Crystal Violet se pueden utilizar como una mancha alternativa. (B) Los resultados combinados de tres experimentos. Todos los experimentos se realizaron por duplicado. Focus cuenta para cada experimento son los siguientes: Experimento 1: pBabePuro (13, 11), MXD3 (3, 4), MYCN (23, 19); Experimento 2: pBabePuro (8, 7), MXD3 (1, 0), MYCN (22, 20); Experimento 3: pBabePuro (9, 20), MXD3 (3, 0), MYCN (21, 12). Las barras de error representan la desviación estándar de número de focos en los tres experimentos. Importancia: ** p <0,01; *** P <0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La FFA proporciona un método rápido y fácil de evaluar la transformación maligna in vitro. Es susceptible a la detección de un número relativamente grande de genes candidatos, y sus requisitos técnicos modestos que sea rentable. Además, dos o más genes pueden ser coexpressed (a veces conocido como un ensayo de la "cooperación") para evaluar el potencial tumorigénico de la combinación. Las ventajas de este ensayo se basan en su técnica sencilla, su facilidad de cuantificación y su relativamente corto tiempo de vuelta. Hay que destacar, sin embargo, que no plantean las limitaciones de todos los ensayos in vitro. El ensayo evalúa la transformación oncogénica mediante la medición de una característica fenotípica de las células cancerosas, a saber, su capacidad para crecer más allá de una monocapa en una placa de cultivo. Los resultados negativos, por lo tanto, deben interpretarse con cautela, como un oncogén particular puede inducir transformación sin la promoción de este phenotyp particular,e o puede requerir la coexpresión con otro gen (es decir, la cooperación se mencionó anteriormente). En este caso, se recomienda para evaluar la transformación mediante otros métodos in vitro, tales como la determinación de la tasa de proliferación y los requisitos de suero y / o el crecimiento de anclaje independiente, por ejemplo, el ensayo de agar blando.
Aunque la técnica FFA es sencillo, se deben cumplir varias condiciones. Lo más importante, es fundamental utilizar un subclon de células 3T3 que muestra transformación espontánea muy bajo. Siendo pre-neoplásica (una característica que hace que esta línea celular muy sensible para este ensayo), ciertos viales pueden contener un número significativo de células ya transformadas, lo que resulta en niveles inaceptablemente altos basales para el ensayo. Para minimizar la transformación espontánea es muy importante que el cultivo de partida se obtiene de una fuente confiable. Además, las células deben ser subcultivados a intervalos regulares y nunca dejaron alcanzar la confluencia.Recomendamos pasar culturas cuando alcanzan aproximadamente el 50% de confluencia. Por esta razón, es importante para crear construcciones adicionales para utilizar como controles. En nuestros experimentos, hemos utilizado pBabePuro que contienen MYC (un oncogén conocido) 18 y pBabePuro vacío para servir como control positivo y negativo, respectivamente.
El constructo de interés puede ser introducido en las células 3T3 usando una variedad de métodos; más comúnmente, se han utilizado métodos de transfección tradicionales. En el protocolo presentado aquí, el uso de la transducción viral proporciona un método fiable, eficiente y consistente de la entrega de genes. Además, el uso de retrovirus ecotrópico hace este ensayo relativamente seguro para la manipulación de potenciales construcciones oncogénicos; sin embargo, las precauciones de bioseguridad adecuadas deben por supuesto ser seguidas.
Al llevar a cabo el protocolo anterior, los experimentos de placa de réplica se deben realizar con el fin de ambos mancha y cosechar las células de los plates. Las células recogidas se pueden utilizar para confirmar la sobreexpresión del gen de interés por inmunoblot.
Aunque la entrega de genes viral presenta varias ventajas en comparación a la transformación, debe señalarse que presenta algunas desventajas también, y muchos laboratorios todavía utilizan protocolos de transformación estándar. Transducción viral puede no ser adecuado cuando se necesita una fuerte sobreexpresión; Por otro lado, la relevancia fisiológica de niveles muy altos de expresión alcanzado por el plásmido de transfección podía ser cuestionable.
Por último, cabe destacar que un segundo ensayo se requiere generalmente para verificar que los focos se deben a la transformación oncogénica. Los focos pueden ser recogidos (antes de la tinción) y se cultivaron en agar blando para confirmar la proliferación independiente de anclaje.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca del Programa de Premios Nueva Innovador del director del NIH (ED). AA fue financiada en parte por los premios de licenciatura del Instituto Nacional del Cáncer y la Fundación Nacional de Ciencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pBABE-puro vector | Addgene | Plasmid 1764 | cloning vector |
| Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic | Cell Biolabs, Inc. | RV-101 | cell line for viral production |
| NIH 3T3 Cell Line murine | Sigma-Aldrich | 93061524 | cell line for focus formation assay |
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe | BD Biosciences | 309604 | viral production reagent |
| 0.45 μm Puradisc Syringe Filter | Whatman | 6750-2504 | viral production reagent |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc. | 23966-2 | cell transfection reagent |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | EMD Millipore | TR-1003-G | cell transfection reagent |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | cell stain reagent |
| Plasmid Plus Midi Kit | QIAGEN | 12945 | plasmid purification |
| BD Falcon Tissue Culture Dishes | BD Biosciences | 353003 | cell culture supplies |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | cell culture media |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | cell culture supplies |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-062 | cell culture media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | cell culture media |
References
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