Summary
O ensaio de formao de foco fornece um método simples para avaliar o potencial de transformação de um oncogene candidato.
Introduction
As células tumorais podem ser distinguidos dos seus homólogos normais por uma ampla gama de alterações, a partir de padrões de expressão de genes para epigenomics a alterações morfológicas e proliferativas. Entre estes últimos, redução da dependência do soro, a perda de contacto (densidade) de inibição, a aquisição de proliferação independente de ancoragem e, em última análise, a capacidade de formar tumores quando injectadas em animais são indicadores úteis, mensuráveis de transformação maligna 3. Vários in vitro e em ensaios in vivo têm sido desenvolvidos para a transformação celular. Os ensaios in vitro por objectivo a identificação e medindo alterações na morfologia da cultura (ensaio de formação de foco), dinâmica de cultura (taxa de crescimento, a densidade de saturação) e o factor de crescimento (crescimento em soro reduzido) ou ancoradouro (crescimento em agar mole) requisitos. O padrão de ouro para a determinação do carácter maligno de um tipo de célula permanece a formação de tumores (xenoenxertos) em animais experimentais. No entanto, tele custa e comprimento de estudos in vivo nem sempre fazê-los justificável como uma primeira etapa de validação ou screening de oncogenes candidatos. Embora nenhum ensaio in vitro fornece uma avaliação definitiva do potencial oncogénico de um gene, que não fornecem informações sobre potencial oncogénico que pode afinar futuro em estudos in vivo. Um dos sistemas mais utilizados para a avaliação do potencial oncogênico in vitro é o foco Formação Ensaio 2. Esta abordagem baseia-se na utilização de NIH 3T3 de fibroblastos de rato, uma linha de células não transformadas que mostram forte inibição de contacto. A sobre-expressão de um oncogene resulta em perda do crescimento dependente de densidade; As células transformadas podem então crescer em múltiplas camadas, formando "focos", facilmente visualizado contra a monocamada de células não transformadas fundo. O Ensaio de formação de focos, em seguida, mede a capacidade de um oncogene candidato para induzir a transformação maligna, como evidenciado pela perda de contacto Inibiç como um fenótipo mensurável. O FFA tem sido utilizado para avaliar a sobre-expressão por transformação de proteína-quinases (por exemplo, Src 4, 5 BRAF), factores de transcrição (por exemplo, N-myc 6) receptores, L-acoplados à proteína (por exemplo, P2RY8 7) e GTPases (p.ex. , Ras 1), entre outros. A relativa facilidade deste ensaio faz-se uma boa escolha que vai proporcionar uma resposta rápida e visualmente claro para se sobre-expressão do gene é suficiente para transformar células de fibroblastos NIH 3T3 de rato in vitro.
O FFA descrito neste protocolo utiliza a linha celular de empacotamento Plat-E 8, o qual fornece as proteínas virais de empacotamento, e o vector retroviral pBABEpuro 9 (Addgene plasmídeo 1764) para a produção de retrovírus. Após transfecção com a construção pBABEpuro contendo o gene de interesse, a linha celular Plat-E vai produzir retrovírus ecotrópico que pode ser utilizado para infectar as células NIH 3T3. Tseu método de entrega gene viral é mais eficiente do que os métodos de transfecção química tradicionais e oferece uma maneira de expressar de forma sustentável o gene 10. Uma vez incorporado no genoma das células NIH 3T3, a sobre-expressão do gene de interesse é impulsionado pelo repetições terminais longas virais (LTR) 11. Esta expressão constante pode ser usado para determinar se o gene de interesse tem actividade oncogénica, tal como medido pela formação de focos, sobre as células NIH 3T3.
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Protocol
1. Fazer os vetores virais
As sequências de codificação para o gene de interesse, bem como os controlos positivos e negativos, são inseridos em pBABEpuro por métodos tradicionais de clonagem (amplificação por PCR, digestão de restrição e de ligação). Existem quatro locais de restrição no vector em que o DNA pode ser inserido: BamHI, SnaBI, EcoRI e Sall.
- Prepare plasmídeo DNA transfecção-grade a partir de células competentes, segundo o kit plasmídeo midi QIAGEN.
- Medir a concentração de DNA usando um espectrofotômetro NanoDrop2000.
2. Retrovirus Produção
A linha celular de empacotamento Plat-E vai ser utilizado para produzir retrovírus ecotrópico que permitirá obter o ADNc de interesse a células NIH 3T3.
- Estabelecer Plat-E culturas de células congeladas
- Rapidamente descongelar células Plat-E de um ° C banho de água 37 e transferir para um tubo de 15 ml. Lentamente, adicionar 9 ml de meio de Plat-E (DuMeio Eagle Modificado de lbecco (DMEM) + 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) + penicilina e estreptomicina).
- Centrifugar o tubo em 180 x g durante 5 min e desprezar o sobrenadante.
- Re-suspender as células com 10 ml de Plat-E e meio de transferência para uma placa de cultura de 10 centímetros.
- Incubar as células em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2 até que eles são de 80-90% confluentes (cerca de 2 dias).
- Splitting celular
- Aspirar o meio e lave as células uma vez com PBS.
- Adicionar 2 ml de 0,05% de tripsina-EDTA e incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente.
- Retire as células por finger tapping, adicione 10 ml de meio Plat-E, e transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml.
- Centrifugar o tubo em 180 x g durante 5 min e desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células com 10 ml de meio Plat-E e semear-los em novas placas a 1: 4-1: 6 diluições.
- Plat-E Sementeira e Transfection
- Semente de 2 x 10 6células por 10 cm prato de cultura, utilizando meio de Plat-E sem quaisquer antibióticos.
- Incubar as células S / N em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2.
- No dia seguinte, transferir 300 ul de Opti-MEM em 1,5 ml de tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 27 ul de polietilenimina (PEI), um reagente de transfecção de baixo custo 12, o tubo preparado com Opti-MEM. Misturar suavemente batendo por dedo e incubar durante 5 min à TA.
- Adicionar 9 ug de ADN plasmídeo de transfecção de grau para o tubo de Opti-MEM / PEI, misturar suavemente em vórtex e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
- Adicionar o ADN / PEI gota a gota complexo no prato Plat-E, e incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2.
- No dia seguinte, aspirar o meio contendo o reagente de transfecção e adicione 10 ml de meio Plat-E fresco (sem antibióticos).
- Retorne as células para a incubadora.
3. As células NIH 3T3 e Infecção
- Estabelecer NIHCultures 3T3 e propagação
- Rapidamente descongelar células NIH 3T3 numa ° C num banho de água a 37 e transferir para um tubo de 15 ml. Adiciona-se lentamente 9 ml de meio de NIH 3T3 (DMEM + 10% FBS).
- Centrifugar o tubo em 180 x g durante 5 min e desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células com 10 ml de NIH 3T3 médio e transferir para um 10 centímetros prato de cultura.
- Incubar as células em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. É muito importante que as células NIH 3T3 são sempre mantidas underconfluent (50-60%), tal como a frequência de transformação espontânea (e, por conseguinte, níveis basais de formação de focos) aumenta uma vez que uma cultura atinge a confluência.
- Semente de 3 x 10 5 células por placa de 10 cm e incubar O / N para a infecção, no dia seguinte.
- Infecção
- Colher o sobrenadante retroviral do prato Plat-E usando uma seringa descartável de 10 ml, filtração através de um filtro de membrana de nylon de 0,45 um de tamanho de poro, e transferindo-o para um 15 mltubo.
- Adicionar 10 ml de meio Plat-E fresco às células (sem antibióticos), e devolvê-las para a incubadora.
- Aspirar o meio do prato de células NIH 3T3 de estarem infectados, e adicione 5 ml de meio de NIH 3T3 regular e 5 ml de sobrenadante filtrado que contém o vírus.
- Adicionar ao prato polibreno a uma concentração de 6 ug / ml.
- Incubar as células S / N a 37 ° C, 5% de CO 2.
- No dia seguinte, repita os passos 3.2.1 - 3.2.5 para uma segunda rodada de infecção.
- Substituir o meio contendo vírus NIH 3T3 com meio regular.
- Permitir que as células NIH-3T3 para crescer durante 2-3 semanas, substituindo o meio, conforme necessário. Verifique a expressão da proteína de interesse por electroforese e imunotransferência de proteína convencional em lisados de células inteiras a partir de placas réplica.
4. Coloração e Quantificação
- Violeta Cristal Coloração
- Aspirar o meio de NIH 3T3 e colocar os pratosem gelo.
- Lavam-se as placas duas vezes com PBS gelado.
- Fixar as células com metanol gelado durante 10 min.
- Remover os pratos de gelo, aspirar o metanol, e adicionar 3 ml de solução de violeta cristal 0,5% feitos em 25% de metanol (RT).
- Incubar as placas durante 5 min à TA.
- Aspirar a solução de cristal violeta e lavar cuidadosamente o prato com Milli-Q H2O até sem cor sai na lavagem.
- Permitir que os pratos para secar O / N em uma bancada (descoberto).
- Focos Quantificação
- Uma vez que os pratos estão secos, use uma régua para medir as coleções de cor escura de células na placa. Contar apenas aqueles que são maiores do que 5 mm de diâmetro, como "focos". Anote o número de focos e calcular médias e a importância em comparação com os controles.
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Representative Results
MXD3 é um fator fundamental zipper hélice-alça-hélice leucina (bHLHZ) de transcrição que é um membro da MYC / MAX / network MAD. Ele é um membro da família atípica MAD 13-15, e tem sido referida como estando envolvida na carcinogénese 16,17. Quando comparado com pBABEpuro (controlo negativo) e MYC (controlo positivo), os pratos de NIH 3T3 que sobre-expressas foi MXD3 tinham significativamente menos focos (Figura 1A). Os dados na Figura 1B foram recolhidos a partir de várias experiências para determinar a significância.
Houve um interesse inicial na determinação do potencial oncogênico MXD3 porque tem atividade semelhante ao MYC (o oncogene conhecido). No entanto, os resultados deste ensaio indicam que MXD3 não funciona como um oncogene.
Figura ensaio de formação 1. Focoresultados. O potencial oncogénico dos MXD3 foi determinada pelo ensaio de formação de focos (FFA) em células NIH 3T3. (A) Imagens de células a partir de uma única experiência coradas com Hema 3. Nota: Violeta Cristal pode ser utilizado como uma alternativa mancha. (B) Os resultados combinados de três experiências. Todas as experiências foram realizadas em duplicado. Focagem conta para cada experiência são os seguintes: Experiência # 1: pBABEpuro (13, 11), MXD3 (3, 4), MYCN (23, 19); Experiência # 2: pBABEpuro (8, 7), MXD3 (1, 0), MYCN (22, 20); Experiência nº 3: pBABEpuro (9, 20), MXD3 (3, 0), MYCN (21, 12). As barras de erro representam o desvio padrão do número de focos nos três experiências. Significado: ** p <0,01; *** P <0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A FFA fornece um método rápido e fácil de avaliar a transformação maligna in vitro. É passível de exibição de um número relativamente grande de genes candidatos e seus requisitos técnicos modestos torná-lo rentável. Além disso, dois ou mais genes pode ser co-expressa (por vezes referido como um ensaio de "cooperação") para avaliar o potencial tumorigénico de combinação. As vantagens deste ensaio contar com a sua técnica simples, a sua facilidade de quantificação e a sua relativamente curto tempo de rotação. Deve-se ressaltar, no entanto, que não representam as limitações de todos os ensaios in vitro. O ensaio avalia a transformação oncogénica medindo uma característica fenotípica de células cancerosas, isto é, a sua capacidade de crescer para além de uma monocamada em uma placa de cultura. Os resultados negativos, portanto, devem ser interpretados com cautela, como um oncogene particular pode induzir a transformação sem promover este phenotyp especiale ou pode requerer a co-expressão com um outro gene (ou seja, a cooperação mencionado acima). Neste caso, recomenda-se a avaliar a transformação in vitro por outros métodos, tais como a determinação da taxa de proliferação e requisitos de soro e / ou crescimento independente de ancoragem através de, por exemplo, o ensaio em agar mole.
Embora a técnica de FFA é simples, várias condições devem ser observadas. Mais importante ainda, é crítica a utilização de um sub-clone de células 3T3 que mostra muito baixo transformação espontânea. Sendo pré-neoplásicas (uma característica que torna esta linha celular muito sensível para este ensaio), certos frascos podem conter um número significativo de células já transformadas, resultando em níveis inaceitavelmente elevados basais para o ensaio. Para minimizar a transformação espontânea, é muito importante que a cultura inicial é obtida a partir de uma fonte respeitável. Além disso, as células devem ser subcultivadas em intervalos regulares e nunca deixou-se atingir a confluência.Recomendamos passando culturas quando atingem cerca de 50% de confluência. Por esta razão, é importante para criar construções adicionais para serem usados como controlos. Nas nossas experiências, utilizou-se pBABEpuro contendo MYC (um oncogene conhecido) e pBABEpuro vazio 18 para servir como controlo positivo e negativo, respectivamente.
O construto de interesse pode ser introduzido nas células 3T3 utilizando uma variedade de métodos; mais comumente, foram utilizados métodos de transfecção tradicionais. No protocolo aqui apresentado, o uso de transdução virai proporciona um método fiável, eficiente e consistente de entrega de genes. Além disso, a utilização de retrovírus ecotrópico torna este ensaio relativamente seguro ao manusear potenciais construções oncogênicos; no entanto, medidas de biossegurança adequadas devem, naturalmente, ser seguido.
Ao conduzir o protocolo acima, as experiências de placas réplica deve ser realizada de forma a ambas as células de manchas e de colheita aqueles plates. As células colhidas pode então ser utilizado para confirmar a sobre-expressão do gene de interesse por imunotransferência.
Embora a entrega de genes virais apresenta várias vantagens quando comparado com a transformação, deve notar-se que ela apresenta algumas desvantagens bem, e muitos laboratórios ainda usar protocolos de transformação padrão. Transdução virai pode não ser apropriado quando é necessário forte sobre-expressão; por outro lado, a relevância fisiológica de níveis muito elevados de expressão alcançados por transfecção de plasmídeo pode ser questionável.
Finalmente, deve salientar-se que um segundo ensaio é geralmente necessária para verificar que os focos estão devido à transformação oncogénica. Os focos podem ser colhidos (antes da coloração) e crescidas em ágar macio para confirmar proliferação independente de ancoragem.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma bolsa da New Innovator Award Program Director do NIH (ED). AA foi apoiado em parte por prêmios de graduação do Instituto Nacional do Câncer e da Fundação Nacional de Ciência.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pBABE-puro vector | Addgene | Plasmid 1764 | cloning vector |
| Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic | Cell Biolabs, Inc. | RV-101 | cell line for viral production |
| NIH 3T3 Cell Line murine | Sigma-Aldrich | 93061524 | cell line for focus formation assay |
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe | BD Biosciences | 309604 | viral production reagent |
| 0.45 μm Puradisc Syringe Filter | Whatman | 6750-2504 | viral production reagent |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc. | 23966-2 | cell transfection reagent |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | EMD Millipore | TR-1003-G | cell transfection reagent |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | cell stain reagent |
| Plasmid Plus Midi Kit | QIAGEN | 12945 | plasmid purification |
| BD Falcon Tissue Culture Dishes | BD Biosciences | 353003 | cell culture supplies |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | cell culture media |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | cell culture supplies |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-062 | cell culture media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | cell culture media |
References
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