Summary
フォーカス形成アッセイは、候補癌遺伝子の形質転換能を評価するための簡単な方法を提供する。
Introduction
腫瘍細胞は、遺伝子発現のパターンの形態学的および増殖性の変化にエピゲノミクスに、変化の広い範囲によってそれらの正常な対応物と区別することができる。後者の中では、、、接触の損失（密度）阻害を血清への依存を軽減足場非依存性増殖の取得と、最終的には、動物に注射した場合に腫瘍を形成する能力は、悪性形質転換3の有効、測定可能な指標である。 in vitroおよびin vivoアッセイにおけるいくつかの細胞の形質転換のために開発されてきた。 インビトロアッセイは、（成長速度、飽和密度）及び増殖因子（低血清成長）、培養形態（フォーカス形成アッセイ）の変化を識別し、測定時に培養ダイナミクスを目指すまたは要件アンカレッジ（ソフトアガーでの成長）。細胞型の悪性の性質を決定するためのゴールドスタンダードは、実験動物における腫瘍形成（異種移植片）のままである。しかし、T彼は、コストとのインビボ研究の長さは、常に候補癌遺伝子の最初の検証ステップまたはスクリーニング、それらに正当ことはありません。何のin vitroアッセイは、遺伝子の発癌性の明確な評価を提供していないが、これらは、生体内の研究で未来を絞り込むことが発癌性への洞察を提供します。 インビトロでの発癌性を評価するための最も広く使用されているシステムの一つはフォーカス形成アッセイ2である。このアプローチは、NIH 3T3マウス線維芽細胞、強く接触阻害を示し、非形質転換細胞株の使用に依存している。密度依存性増殖の損失の癌遺伝子の過剰発現。形質転換された細胞は、次に簡単に非形質転換細胞のバックグラウンド単層に対して可視化「病巣」を形成する、複数の層で成長することができる。フォーカス形成アッセイは、その後、コンタクトInhibが喪失によって証明されるように、悪性形質転換を誘導する候補癌遺伝子の能力を測定する測定可能な表現型としてition。 FFAは、プロテインキナーゼ（ 例えば 、Srcの4、BRAF 5）の過剰発現により形質転換を評価するために使用されている、転写因子（ 例えば 、N-mycの6）、Gタンパク質共役受容体（ 例えば 、P2RY8 7）およびGTPアーゼ（ 例えばとりわけラス1）。このアッセイの相対的な容易さは、遺伝子の過剰発現は、インビトロで NIH 3T3マウス線維芽細胞を形質転換するのに十分であるか否かを迅速かつ視覚的に明確な答えを提供する適切な選択肢となる。
FFAは、このプロトコルに記載のレトロウイルスを産生するウイルスパッケージングタンパク質を提供するのPlat-Eパッケージング細胞株8、およびレトロウイルスベクターpBABEpuro 9（Addgeneプラスミド1764）を使用する。目的の遺伝子を含むpBABEpuro構築物でトランスフェクションした後、のPlat-E細胞株は、NIH 3T3細胞を感染させるために使用することができるエコトロピックレトロウイルスを産生する。 T遺伝子送達の彼のウイルスの方法は、従来の化学的なトランスフェクション法よりも効率的であり、それは持続的に遺伝子10を表現する方法を提供しています。 NIH 3T3細胞のゲノムに組み込まれると、目的の遺伝子の過剰発現は、ウイルスの長い末端反復（LTR）プロモーター11によって駆動される。この定数式は、NIH 3T3細胞に、病巣の形成によって測定されるように、目的の遺伝子は、発癌活性を有するかどうかを決定するために使用することができる。
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Protocol
1.ウイルスベクターを作る
目的の遺伝子、ならびに陽性および陰性対照のためのコード配列は、従来のクローニング法（PCR増幅、制限消化およびライゲーション）によってpBABEpuroに挿入される。 BamHIでSnaBIで、EcoRIおよびSalIで：DNAを挿入することができるベクター上の4つの制限部位がある。
- QIAGENプラスミドミディキットを使用してコンピテント細胞からトランスフェクショングレードのプラスミドDNAを準備します。
- NanoDrop2000分光光度計を用いてDNA濃度を測定します。
2.レトロウイルス生産
のPlat-Eパッケージング細胞株は、NIH 3T3細胞に目的のcDNAを送達するエコトロピックレトロウイルスを産生するために使用される。
- 凍結細胞からのPlat-Eの文化の確立
- すぐに37℃の水浴中でのPlat-E細胞を解凍し、15mlのコニカルチューブに移す。ゆっくりとのPlat-E培地9ml（デュを追加lbecco改変イーグル培地（DMEM）+ 10％ウシ胎児血清（FBS）+ペニシリン及びストレプトマイシン）。
- 180 xでのチューブを遠心 gで5分間、上清を捨てる。
- 再懸濁のPlat-E培地及び10cmの培養皿に移し、10 mlの細胞。
- それらは80〜90％コンフルエント（約2日）になるまで37℃、5％CO 2インキュベーター中で細胞をインキュベートする。
- セル分割
- メディアを吸引除去し、PBSで細胞を1回洗浄します。
- 0.05％トリプシンEDTAの2ミリリットルを加え、室温で1分間インキュベートする。
- 指タッピングによって細胞を剥離、ぷらっと-E培地10mlを追加し、15ミリリットルチューブに細胞懸濁液を移す。
- 180 xでのチューブを遠心 gで5分間、上清を捨てる。
- ぷらっと-E培地10mlで細胞を再懸濁し、1から新しい料理でそれらをシード：4-1：6の希釈。
- PLAT-Eシードおよびトランスフェクション
- シード2×10 6任意の抗生物質を含まないのPlat-E培地を用いて10cmの培養皿当たり細胞。
- 37℃、5％CO 2インキュベーター中で細胞をO / Nでインキュベートする。
- 翌日、1.5mlマイクロチューブにのOpti-MEM300μlのを転送する。
- のOpti-MEMでプリペアチューブに、ポリエチレンイミンの27μL（PEI）、費用対効果の高いトランスフェクション試薬12を追加します。指タッピングにより穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートする。
- 、のOpti-MEM / PEIチューブにトランスフェクショングレードのプラスミドDNAの9μgのを追加し、ボルテックスにより穏やかに混合し、室温で15分間インキュベートする。
- 追加DNA / PEIのPlat-E皿に、37℃でO / Nインキュベート複雑なワイズドロップ、5％のCO 2。
- 翌日、トランスフェクション試薬を含む培地を吸引し、（抗生物質を含まない）新鮮なのPlat-E培地10mlを追加します。
- インキュベーターにセルを返します。
3. NIH 3T3細胞と感染
- NIHの確立3T3文化や播種
- すぐに37℃の水浴中でNIH 3T3細胞を解凍し、15mlチューブに移す。ゆっくりとNIH 3T3培地（DMEM + 10％FBS）の9ミリリットルを追加します。
- 180 xでのチューブを遠心 gで5分間、上清を捨てる。
- 10cmの培養皿にNIH 3T3媒体と転送10mlで細胞を再懸濁。
- 37℃、5％CO 2インキュベーター中で細胞をインキュベートする。これは、自発的な変換（および病巣形成の、したがって基礎レベル）の周波数として文化がコンフルエントに達すると増加、NIH 3T3細胞は常にunderconfluent（百分の50から60）を保持していることが非常に重要です。
- シード3×10 10 cmディッシュあたり5個の細胞と、翌日感染のためにO / Nインキュベートする。
- 感染
- 孔径0.45μmのナイロン膜フィルターを介して濾過する10mlの使い捨てシリンジを使用し、そして15mlにそれを転送することによってのPlat-E皿からレトロウイルス上清を収穫チューブ。
- （抗生物質を含まない）を細胞に新鮮なのPlat-E培地10mlを追加し、インキュベーターに戻す。
- 感染していることがNIH 3T3細胞ディッシュから培地を吸引し、ウイルス含有濾過した上清の5の正規NIH 3T3培地1mlと5ミリリットルを追加します。
- 610μg/ mlの濃度で、皿にポリブレンを追加します。
- 37℃、5％CO 2で細胞をO / Nでインキュベートする。
- 感染の第二ラウンドのために3.2.5 - 次の日、繰り返して3.2.1を繰り返します。
- 定期的なNIH 3T3培地でウイルス含有培地を交換してください。
- NIH 3T3細胞は、必要に応じて培地を交換、2-3週間成長できるようにします。レプリカプレートから全細胞溶解物に従来のタンパク質電気泳動およびイムノブロットにより、目的のタンパク質の発現を確認してください。
4.染色および定量
- クリスタルバイオレット染色
- NIH 3T3培地を吸引し、食器を置く氷の上で。
- 氷冷PBSで2回皿を洗う。
- 10分間氷冷メタノールで細胞を固定します。
- 氷から皿を外し、メタノールを吸引し、25％のメタノール（RT）で行われた、0.5％クリスタルバイオレット溶液の3ミリリットルを追加します。
- RTで5分間皿をインキュベートする。
- クリスタルバイオレット溶液を吸引し、色がリンスに外れなくなるまで注意深くのMilli-Q H 2 Oとの皿をすすぐ。
- 料理はベンチトップ（発見）にO / Nを乾燥することができます。
- 病巣の定量
- 料理が乾燥したら、プレート上の細胞の暗色コレクションを測定するために定規を使用しています。として、直径5ミリメートルよりも大きくされているもののみをカウント "巣"を病巣の数を記録し、対照と比較して平均値と有意性を計算。
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Representative Results
MXD3は、MYC / MAX / MADネットワークのメンバーである塩基性ヘリックス - ループ - ヘリックスロイシンジッパー（bHLHZ）転写因子である。それは、MADファミリー13-15の異型メンバーであり、発癌16,17に関与することが報告されている。 pBABEpuro（陰性対照）およびMYC（陽性対照）と比較した場合、MXD3を過剰発現させたNIH 3T3料理が著しく少ない病巣（ 図1A）を有していた。 図1Bのデータは有意性を決定するために複数の実験から収集した。
それはMYC（既知の癌遺伝子）に同様の活性を持っているのでMXD3の発癌性を決定する際の初期の関心があった。しかし、このアッセイからの結果はMXD3は癌遺伝子として機能しないことを示唆している。
図1フォーカス形成アッセイ結果を図MXD3の発癌能はNIH 3T3細胞のフォーカス形成アッセイ（FFA）によって決定した。ヘマ3注で染色した単一の実験からの細胞の（A）画像：クリスタルバイオレット染色代替として使用することができる。 （B）は、3つの実験からの結果を組み合わせる。全ての実験は二連で行った。実験＃1：焦点は、各実験のために次のようにしているカウントpBABEpuro（13、11）、MXD3（3,4）、MYCN（23、19）。実験＃2：pBABEpuro（8,7）、MXD3（1,0）、MYCN（22、20）。実験＃3：pBABEpuro（9、20）、MXD3（3,0）、MYCN（21、12）。エラーバーは、3実験全体で病巣の数の標準偏差を表す。意義：** P <0.01; *** P <0.001。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
FFAは、in vitroでの悪性形質転換を評価するための迅速かつ容易な方法を提供する。これは、候補遺伝子の比較的多数のスクリーニングに適用され、その控えめな技術的要件は、費用対効果を高める。さらに、2つ以上の遺伝子を共発現させることができる組み合わせの腫瘍形成能を評価するために（時には「協力」アッセイと呼ばれる）。このアッセイの利点は、その単純な手法、定量化の容易さと、その比較的短いターンアラウンドタイムに依存している。それは、すべてのインビトロアッセイの限界をもたらすないことが強調されなければならない。アッセイは、癌細胞の一つの表現型特性を測定することにより、発癌性形質転換を評価する、すなわち、それらの能力は、培養皿で単層を越えて成長する。陰性の結果は、したがって、この特定のphenotypを促進することなく、形質転換を誘導することができる特定の癌遺伝子として、慎重に解釈されるべきであるeまたは別の遺伝子（ すなわち 、協力は、上述した）との共発現が必要な場合があります。この場合には、例えば、軟寒天アッセイにより増殖速度の決定及び血清要件および/ または足場非依存性増殖のような他のin vitroの方法によって形質転換を評価するために推奨される。
FFA技術は簡単ですが、いくつかの条件が守らなければなりません。最も重要なことは、非常に低い自発的な変換を示した3T3細胞のサブクローンを使用することが重要である。プレ新生物（この細胞株は、このアッセイのために非常に敏感になる機能）され、特定のバイアルは、アッセイのために許容できないほど高い基底レベルをもたらし、すでに形質転換された細胞のかなりの数を含むことができる。自発的な変換を最小限に抑えるためには、出発培養物は、信頼できるソースから取得されることが非常に重要である。また、細胞が一定の間隔で継代培養し、コンフルエントに到達させたことがないべきである。我々は、それらが約50％コンフルエントに達したときに培養物を通過させることをお勧めします。このため、コントロールとして使用するための追加の構築物を作製することが重要である。我々の実験では、それぞれ、陽性および陰性対照としてMYC（既知の癌遺伝子）18を含むpBABEpuro、空pBABEpuroを使用する。
関心対象の構築物は、様々な方法を用いて3T3細胞に導入することができる。最も一般的には、従来のトランスフェクション法が使用されてきた。ここに提示されたプロトコルでは、ウイルス形質導入を使用することは、遺伝子送達の信頼性の高い効率的かつ一貫した方法を提供する。潜在的な発癌性の構造を取り扱う際さらに、エコトロピックレトロウイルスの使用は、このアッセイは比較的安全になる。しかし、適切なバイオセーフティ予防措置はもちろん従うべきである。
上記のプロトコルを行う際に、レプリカプレート実験をplのものとの両方の染色及び細胞収穫するために行われるべきであるのATE。採取した細胞は、その後イムノブロットによって目的遺伝子の過剰発現を確認するために用いることができる。
形質転換と比較した場合、ウイルス遺伝子送達は、いくつかの利点を提供するが、それは同様に、いくつかの欠点を提示しないことに留意すべきであり、多くの研究室は、まだ標準的な形質転換プロトコルを使用する。強力な過剰発現が必要とされる場合、ウイルス形質導入は適当でないかもしれません。一方、プラスミドトランスフェクションによって達成発現の非常に高レベルの生理的関連性は疑わしいかもしれない。
最後に、第二のアッセイは、通常、病巣は発癌性形質転換によるものであることを検証する必要があることが強調されるべきである。病巣が（染色前）に採取し、足場非依存性増殖を確認するために、ソフト寒天中で成長させることができる。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
この作品は、NIHのディレクターの新イノベーター賞プログラム（ED）からの助成金によってサポートされていました。 AAは国立がん研究所、国立科学財団からの学部賞によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pBABE-puro vector | Addgene | Plasmid 1764 | cloning vector |
| Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic | Cell Biolabs, Inc. | RV-101 | cell line for viral production |
| NIH 3T3 Cell Line murine | Sigma-Aldrich | 93061524 | cell line for focus formation assay |
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe | BD Biosciences | 309604 | viral production reagent |
| 0.45 μm Puradisc Syringe Filter | Whatman | 6750-2504 | viral production reagent |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc. | 23966-2 | cell transfection reagent |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | EMD Millipore | TR-1003-G | cell transfection reagent |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | cell stain reagent |
| Plasmid Plus Midi Kit | QIAGEN | 12945 | plasmid purification |
| BD Falcon Tissue Culture Dishes | BD Biosciences | 353003 | cell culture supplies |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | cell culture media |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | cell culture supplies |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-062 | cell culture media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | cell culture media |
References
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