Summary
초점 형성의 분석은 후보 종양 유전자의 변화 가능성을 평가하기위한 간단한 방법을 제공한다.
Introduction
종양 세포 유전자 발현의 패턴에서 증식 및 형태 학적 변화 후성 유전학에, 변경의 폭 넓은 정상 대조 구별 될 수있다. 후자 중에서, 궁극적으로 동물에 주입시 종양을 형성하는 능력은 악성화 (3)의 유용한 측정 지표 인 혈청에 의존하여, 접점 (밀도) 억제의 상실, 앵커리지 - 독립된 확산 인수를 감소. 생체 외 및 생체 내 분석 몇몇 셀룰러 변환을 위해 개발되었다. 시험 관내 분석법을 목표 (환원 혈청 성장)을 식별하고 배양 모폴로지 (초점 형성 어 세이), 문화 역학 (성장 속도, 포화 농도) 및 성장 인자의 변화가 측정 또는 요구 사항 앵커리지 (소프트 한천의 성장). 세포 유형의 악성 특성을 결정하기위한 금 표준 실험 동물에서 종양 형성 (이종) 남아있다. 그러나, t그는 비용 및 생체 내 연구의 길이는 항상 후보 종양 유전자의 첫 번째 검증 단계 또는 스크리닝 그들을 정당화하지 않습니다. 어떤 시험 관내 분석은 유전자의 발암 가능성의 명확한 평가를 제공하지 않지만, 그들은 생체 내 (in vivo) 연구가 미래를 좁힐 수 발암 가능성에 대한 통찰력을 제공 않습니다. 시험관 내에서 종양 발생 가능성을 평가하기위한 가장 널리 사용되는 시스템 중 하나는 초점 형성 분석법이있다. 이 접근법은 NIH 3T3 마우스 섬유 모세포, 강한 접촉 억제를 나타내고 형질 전환되지 않은 세포주의 사용에 의존한다. 밀도에 의존하는 성장의 손실 종양 유전자 결과의 과발현; 형질 전환 된 세포를 용이하게 형질 전환되지 않은 세포의 배경에 대해 단층 가시화 "초점"을 형성하는, 다층으로 성장할 수있다. 접점의 ON 인 손실에 의해 입증되는 바와 같이 포커스 정량법 형성 후, 악성 변환을 유도하는 후보의 종양 유전자 능력을 측정측정 표현형으로 ition. FFA (예를 들면, Src에 4 BRAF 5) 단백질 키나제의 과발현, 전사 인자 (예, N-myc의 6) (예 P2RY8 7), G는 단백질 - 결합 수용체와 GTP 아제 (예에 의해 변형을 평가하기 위해 사용되어왔다 , 라스 1), 다른 사람의 사이에서. 이 분석의 상대적 용이성은 유전자의 과발현은 체외에서 NIH 3T3 마우스 섬유 아세포를 변환 할만큼 충분한 지 여부에 대한 신속하고 시각적으로 명확한 답을 제공 할 것입니다 좋은 선택입니다.
이 프로토콜에서 설명 FFA 패키징 바이러스 단백질을 제공 Plat의 E-패키징 세포주 (8)를 사용하고, 레트로 바이러스 벡터 pBABEpuro 9 (Addgene 플라스미드 1764)는 레트로 바이러스를 생성한다. 관심의 유전자를 포함하는 구조체 pBABEpuro 형질 감염 후, E-Plat의 세포주는 NIH 3T3 세포를 감염시키기 위해 사용될 수 ecotropic 레트로 바이러스를 생성 할 것이다. 티유전자 전달에있어서의 그의 바이러스 전통적인 화학적 형질 전환 방법보다 더 효율적이며 지속적으로 10 유전자를 발현 할 수있는 방법을 제공한다. 일단 NIH 3T3 세포의 게놈 내로 혼입, 목적 유전자의 과발현은 바이러스 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터 (11)에 의해 구동된다. 이 상수는 식 NIH 3T3 세포상의 초점의 형성에 의해 측정 된 관심 유전자, 종양 활성을 가지고 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수있다.
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Protocol
1. 바이러스 성 벡터를 만들기
목적 유전자뿐만 아니라, 양성 및 음성 대조군에 대한 코딩 서열은, 전통적인 클로닝 방법 (PCR 증폭, 제한 효소 및 라이 게이션)에 의하여 pBABEpuro 삽입된다. BamHI로, SnaBI로, EcoRI 및 SalI로 : DNA가 삽입 될 수있다 벡터 네 개의 제한 부위가있다.
- QIAGEN 플라스미드 미디 키트를 사용하여 유능한 세포에서 형질 급 플라스미드 DNA를 준비합니다.
- NanoDrop2000 분광 광도계를 이용하여 DNA 농도를 측정한다.
2. 레트로 바이러스 생산
Plat의 E-패키징 세포주 NIH 3T3 세포가 관심 cDNA를 제공한다 ecotropic 레트로 바이러스를 생산하는 데 사용한다.
- 냉동 세포에서 Plat의-E 문화 구축
- 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 Plat의-E 세포를 해동하고 15 ML 원뿔 튜브에 전송할 수 있습니다. 천천히 (뒤를 Plat의-E 매체의 9를 가하여lbecco 개변 이글 DMEM 배지 + 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 스트렙토 마이신 +).
- 180 X에서 튜브를 원심 분리기 g 5 분 상층 액을 버린다.
- 10cm의 배양 접시에 작은지면-E 매체 및 전송 10 mL로 세포를 다시 일시 중지합니다.
- 그들은 80 ~ 90 %의 합류 (약 2 일) 때까지 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 세포를 품어.
- 셀 분할
- 매체를 대기음 PBS로 한 번 세포를 씻으십시오.
- 0.05 % 트립신 EDTA 2 ㎖를 추가하고 실온에서 1 분 동안 품어.
- 도청 손가락으로 세포를 분리 Plat의-E 배지 10 mL를 넣고 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송.
- 180 X에서 튜브를 원심 분리기 g 5 분 상층 액을 버린다.
- 작은지면-E 매체의 10 ml의 세포를 재현 탁 1에서 새로운 요리를 시드 : 4-1 : 6 희석.
- 작은지면-E 시드 및 형질
- 시드 2 × 10 (6)어떤 항생제없이 작은지면-E 매체를 이용하여 10cm 배양 접시 당 세포.
- 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 세포 O / N을 품어.
- 다음 날, 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 옵티-MEM 300 μl를 전송합니다.
- 옵티-MEM으로 준비 관, 폴리에틸렌 이민의 27 μL (PEI), 비용 효율적인 형질 전환 시약 (12)를 추가합니다. 도청 손가락으로 부드럽게 섞어 실온에서 5 분 동안 품어.
- , 옵티-MEM / PEI 튜브에 형질 급 플라스미드 DNA의 9 μg의 추가 텍싱하여 부드럽게 혼합하고, 실온에서 15 분 동안 품어.
- 추가 DNA / PEI Plat의-E 접시에, 37 ° C에서 O / N을 품어 복합 한 방울 씩, 5 % CO 2.
- 다음 날, 형질 전환 시약을 포함하는 매체를 대기음 (항생제없이) 신선한 Plat의-E의 10 ml의 배지를 추가합니다.
- 인큐베이터에 세포를 돌려줍니다.
3. NIH 3T3 세포 및 감염
- NIH 구축3T3 문화 및 시드
- 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 NIH 3T3 세포를 해동하고 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 천천히 NIH 3T3 배지 (DMEM + 10 % FBS)의 구를 가하여.
- 180 X에서 튜브를 원심 분리기 g 5 분 상층 액을 버린다.
- 10cm 배양 접시 NIH 3T3 매체와 전사 10 mL로 세포를 재현 탁.
- 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 세포를 배양한다. 그것은 자연 변환 (그리고 초점 형성 따라서 기초 수준)의 주파수로 문화 포화 상태에 도달하면 증가, NIH 3T3 세포는 항상 underconfluent (50~60%)을 유지하는 것이 매우 중요합니다.
- 10cm 접시 당 종자 3 × 10 5 세포는 다음날 감염 O / N을 배양한다.
- 감염
- 0.45 ㎛의 세공 크기를 나일론 멤브레인 필터로 여과 한, 10 ㎖의 일회용 주사기를 사용하고, 15 ㎖ 중에 전송해서 E-Plat의 접시에서 레트로 바이러스 상등액을 수확튜브.
- (항생제없이) 세포에 신선한 Plat의-E 매체의 10 ML을 추가하고 인큐베이터에 반환.
- 감염 될 수있는 NIH 3T3 세포 접시에서 매체를 대기음, 바이러스 함유 필터링 된 상층 액의 5 정기적 인 NIH 3T3 매체 ml의 5 mL를 추가합니다.
- 6 ㎍ / ml의 농도로 폴리 브렌 접시에 추가.
- 37 ° C, 5 % CO 2의 세포 O / N을 품어.
- 감염의 두 번째 라운드에 대한 3.2.5 - 다음 날, 반복 3.2.1 단계를 반복합니다.
- 일반 NIH 3T3 매체와 바이러스 함유 배지를 교체합니다.
- 필요에 따라 매체를 교체, NIH 3T3 세포를 2 ~ 3 주 동안 성장하는 것을 허용합니다. 복제 판에서 전체 세포 용 해물에 기존의 단백질 전기 영동 및 면역에 의해 관심의 단백질의 발현을 확인합니다.
4. 염색 및 정량화
- 크리스탈 바이올렛 염색
- NIH 3T3 매체를 대기음 요리를 배치얼음에.
- 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 요리를 씻으십시오.
- 10 분 동안 빙냉 메탄올로 세포를 고정.
- 얼음에서 요리를 제거하고 메탄올을 대기음, 25 % 메탄올 (RT)에서 만든 0.5 % 크리스탈 바이올렛 용액 3 ㎖를 추가합니다.
- RT에서 5 분 동안 요리를 품어.
- 크리스탈 바이올렛 솔루션을 기음과 컬러가 린스 벗기하지 않을 때까지 조심스럽게 밀리-Q의 H 2 O와 접시를 씻어.
- 요리는 벤치 탑에 O / N을 건조하도록 허용 (발견).
- 초점 정량화
- 요리가 건조되면, 접시에 세포의 음울 색깔의 컬렉션을 측정하는 통치자를 사용합니다. 만 등의 직경보다 5mm 된 것을 계산 "초점을."초점의 수를 기록하고 평균과 컨트롤에 비해 중요성을 계산합니다.
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Representative Results
MXD3는 MYC / MAX / MAD 네트워크의 구성원 인 염기성 헬릭스 - 루프 - 헬릭스 류신 지퍼 (bHLHZ) 전사 인자이다. 그것은 MAD 가족 13-15의 비정형 부재이며, 그것은 암화 (16, 17)에 관여하는 것으로보고되었다. pBABEpuro (대조군)과 MYC (양성 대조군)과 비교했을 때, MXD3가 과발현 된 NIH 3T3 요리는 훨씬 적은 초점 (그림 1A)를했다. 도 1b의 데이터는 중요성을 결정하기 위해 여러 실험으로부터 수집 하였다.
이 MYC와 유사한 활동 (알려진 발암 유전자)를 가지고 있기 때문에 MXD3의 발암 가능성을 결정하는 초기 관심이 있었다. 그러나,이 분석 결과는 MXD3는 종양 유전자의 기능을하지 않는 것이 좋습니다.
그림 1. 초점 형성 분석결과. MXD3의 발암 잠재력은 NIH 3T3 세포에서의 초점 형성 분석법 (FFA)으로 측정 하였다. 헤마 3. 참고로 염색 한 실험에서 세포의 (A) 이미지 : 크리스탈 바이올렛은 대안 얼룩으로 사용될 수있다. (B) 세 가지 실험에서 결합 된 결과. 모든 실험은 중복으로 수행되었다. 초점은 각각 다음과 같이 계산 실험 : 실험 1 : pBABEpuro (13, 11), MXD3 (3, 4), MYCN (23, 19); 실험 예 # 2 : pBABEpuro (8, 7), MXD3 (1, 0), MYCN (22, 20); 실험 예 # 3 : pBABEpuro (9, 20), MXD3 (3, 0), MYCN (21, 12). 오차 막대는 세 가지 실험에서 병소의 수의 표준 편차를 나타냅니다. 의의 : ** P <0.01; *** P <0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
FFA는 체외에서 악성 변화를 평가하기위한 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다. 이는 후보 유전자의 상대적으로 큰 수의 검사 의무이며, 그 완만 한 기술적 요구는 비용 효율적인 만든다. 또한, 두 개 이상의 유전자를 공 발현 할 수있다 조합 발암 잠재력을 평가하는 (때때로 "협동"분석법이라 함). 이 분석의 장점은 간단 기술, 정량의 용이성과 상대적으로 짧은 턴어라운드 시간에 의존하고있다. 그것은 그것이 모든 시험 관내 분석의 한계를 제기 않는다는 점을 강조해야한다. 분석은 암세포의 한 표현형 특성을 측정함으로써 평가 발암 변환, 즉, 자신의 능력을 배양 접시에 단층 넘을한다. 부정적인 결과는, 따라서,이 특정 phenotyp을 추진하지 않고 변화를 유도 할 수있는 특정 암에서 신중하게 해석되어야한다e 또는 다른 유전자 (즉, 협력 위에서 언급 한)와 동시 발현을 필요로 할 수있다. 이 경우에, 그것은 예를 들면 증식률 혈청 요건 및 / 또는 독립적 앵커리지 의해 결정 성장 등의 다른 생체 외 방법, 연질 한천 분석으로 변형을 평가하기 위해 추천된다.
FFA 기술은 간단하지만, 몇 가지 조건을 준수해야합니다. 가장 중요한 것은 매우 낮은 자발적인 변화를 도시 3T3 세포의 서브 클론을 사용하는 것이 중요하다. 사전 신생 물성 (neoplasic) (이 세포 라인이 분석에 매우 민감하게 기능)이기 때문에, 어떤 병은 분석을 위해 허용 할 수 없을 정도로 높은 기저 수준의 결과로, 이미 형질 전환 된 세포의 상당수를 포함 할 수있다. 자발적인 변화를 최소화하기 위해이 시작 문화가 믿을만한 소스에서 얻을 것이 매우 중요합니다. 또한, 세포는 일정 간격으로 계대 배양 및 포화 상태에 도달하도록 결코한다.그들은 약 50 %의 포화 상태에 도달했을 때 우리는 문화를 전달하는 것이 좋습니다. 그렇기 때문에 대조군으로 사용하기위한 추가 구조체를 작성하는 것이 중요하다. 실험에서, 우리는 각각 양성 및 음성 대조군 역할을 MYC (공지 된 종양 유전자) 및 빈 18 pBABEpuro 함유 pBABEpuro을 사용했다.
관심 구조물은 다양한 방법 3T3 세포 내로 도입 될 수있다; 가장 일반적으로, 기존의 형질 전환 방법이 사용되어왔다. 여기에 제시된 프로토콜에서, 바이러스 형질 도입의 사용은 유전자 전달의 신뢰성과 일관성있는 효율적인 방법을 제공한다. 잠재적 인 발암 구조를 처리 할 때 또한, ecotropic 레트로 바이러스의 사용은이 분석 비교적 안전합니다; 그러나, 적절한 바이오 안전성주의 사항은 물론 따라야한다.
상기 프로토콜을 수행 할 때, 레플리카 플레이트 실험 PL 것과 모두 얼룩과 세포 수확하기 위해 수행되어야오버라이드. 수확 된 세포를 유전자 관심 - 이뮤 의해 과발현을 확인하는데 사용될 수있다.
변환에 비해 바이러스 성 유전자 전달은 여러 가지 장점을 제공하지만, 그것은 또한 몇 가지 단점을 제시한다는 것을 주목해야하고, 여전히 많은 실험실 표준 프로토콜 변환을 사용한다. 강한 과발현이 필요할 때 바이러스 형질 도입은 적합하지 않을 수있다; 한편, 플라스미드 형질 발현에 의해 달성 매우 높은 수준의 생리 학적 관련성은 의심 할 수있다.
마지막으로,이 두 번째 분석은 일반적으로 초점이 종양 변화로 인한 있는지 확인하기 위해 필요하다는 것을 강조되어야한다. 초점은 (염색 전) 골 랐고, 앵커리지 독립적 인 확산을 확인하는 소프트 한천에서 재배 할 수있다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 감독의 새로운 혁신 상 프로그램 (ED)에서 부여에 의해 지원되었다. AA는 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)와 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 학부 상에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pBABE-puro vector | Addgene | Plasmid 1764 | cloning vector |
| Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic | Cell Biolabs, Inc. | RV-101 | cell line for viral production |
| NIH 3T3 Cell Line murine | Sigma-Aldrich | 93061524 | cell line for focus formation assay |
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe | BD Biosciences | 309604 | viral production reagent |
| 0.45 μm Puradisc Syringe Filter | Whatman | 6750-2504 | viral production reagent |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc. | 23966-2 | cell transfection reagent |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | EMD Millipore | TR-1003-G | cell transfection reagent |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | cell stain reagent |
| Plasmid Plus Midi Kit | QIAGEN | 12945 | plasmid purification |
| BD Falcon Tissue Culture Dishes | BD Biosciences | 353003 | cell culture supplies |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | cell culture media |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | cell culture supplies |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-062 | cell culture media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | cell culture media |
References
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