Summary
Фокус Формирование анализ обеспечивает простой метод для оценки преобразующую потенциал кандидата онкоген.
Introduction
Опухолевые клетки можно отличить от их нормальных аналогов широким диапазоном изменений, из форм генной экспрессии в Epigenomics в морфологических и пролиферативных изменений. Среди последних, уменьшение зависимости от сыворотки, потеря контакта (плотности) торможения, приобретение крепления независимой пролиферации и, в конечном счете, способность образовывать опухоли при введении животным полезны, измеримые показатели злокачественной трансформации 3. Несколько в пробирке и в естественных условиях анализов были разработаны для трансформации клеток. В пробирке анализы направлены на выявление и измерение изменений в области культуры морфологии (образование анализа фокус), динамики культуры (темп роста, плотность насыщения) и фактор роста (рост в восстановленной сыворотки) или якорь (рост на мягком агаре) требованиям. Золотой стандарт для определения злокачественной природы клеток определенного типа, остается формирование опухоли (ксенотрансплантаты) у экспериментальных животных. Тем не менее, тон стоит и продолжительность обучения в естественных условиях не всегда делают их оправдано в качестве первого этапа проверки или досмотра кандидатов онкогенов. Хотя ни анализ в пробирке не дает определенную оценку онкогенного потенциала гена, они дают полное представление онкогенного потенциала, который может сузить будущее в естественных условиях исследования. Одним из наиболее широко используемых систем для оценки онкогенного потенциала в пробирке находится в центре внимания Формирование Анализ 2. Этот подход основан на использовании NIH-3T3 мыши фибробластов, не-трансформированной клеточной линии, которая показывает сильное ингибирование контактной. Избыточная экспрессия онкогенов приводит к потере плотности в зависимости от роста; Трансформированные клетки можно затем растут в несколько слоев, образующих "очаги", легко визуализировать на фоне монослоя нетрансформированных клеток. Фокус Формирование Анализ, то, измеряет способность кандидата онкоген, чтобы вызвать злокачественную трансформацию, о чем свидетельствует потеря контакта Inhibition как измеримое фенотипа. FFA был использован для оценки трансформации сверхэкспрессией протеинкиназ (например, Src 4, 5 BRAF), факторы транскрипции (например, N-Myc 6), G-белками рецепторы (например, P2RY8 7) и GTPases (например, Рас 1), среди прочих. Относительная простота этого теста делает его хорошим выбором, который обеспечит быстрый и визуально четкий ответ на ли избыточная экспрессия гена достаточно, чтобы превратить NIH 3T3 фибробластов мышей клетки в пробирке.
FFA описано в данном протоколе используется Plat-E упаковка клеточную линию 8, который обеспечивает вирусные белки упаковки и ретровирусный вектор pBABEpuro 9 (Addgene плазмиду 1764), чтобы произвести ретровирус. После трансфекции с pBABEpuro конструкции, содержащей нужный ген, клеточная линия Plat-E будет производить экотропного ретровируса, который может быть использован для инфицирования клеток NIH-3T3. Tвирусная способ доставки генов является более эффективным, чем традиционные методы химической трансфекции и предлагает способ устойчиво экспрессировать ген 10. После того, как включается в геном клеток NIH-3T3, избыточная экспрессия интересующего гена приводится в действие вирусных длинные концевые повторы (LTR), промотор 11. Эта константа выражение может быть использовано для определения того, имеет ли интерес ген онкогенного активности, измеренной с образованием очагов на клетках NIH-3T3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Создание вирусных векторов
Кодирующие последовательности для интересующего гена, а также положительных и отрицательных контролей, которые вставлены в pBABEpuro традиционными методами клонирования (ПЦР-амплификации, ограничение и лигирования). Существуют четыре сайты рестрикции на векторе, где ДНК могут быть вставлены: BamHI, SnaBI, EcoRI и SalI.
- Подготовка трансфекции-класса плазмидной ДНК из компетентных клеток с использованием плазмиды миди набор QIAGEN.
- Измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра NanoDrop2000.
2. ретровируса Производство
Plat-E упаковка клеточная линия будет использоваться для получения экотропного ретровируса, который будет доставлять кДНК интерес для клеток NIH-3T3.
- Создание Плат-E культур из замороженных клеток
- Быстро оттаивают Plat-E клеток в ° С на водяной бане при 37 и передавать в 15 мл коническую трубку. Медленно добавьте 9 мл Плат-E среды (Дуlbecco в модификации Дульбекко (DMEM) + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) + пенициллина и стрептомицина).
- Центрифуга трубки на 180 х г в течение 5 мин и отбросить супернатант.
- Повторное приостановить клетки с 10 мл Plat-E среды и передачи в 10 см чашки для культивирования.
- Инкубируйте клетки в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе, пока они не 80-90% сливной (около 2 дней).
- Сотовый Разделение
- Аспирируйте среды и мыть клетки один раз PBS.
- Добавить 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
- Открепления клеток от палец нажатие, добавить 10 мл Plat-E среды, и передачи клеточной суспензии в 15 мл пробирку.
- Центрифуга трубки на 180 х г в течение 5 мин и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют клеток с 10 мл Plat-E среды и семян их в новые чашки 1: 4-1: 6 разведений.
- Плат-E Посевная и Трансфекцию
- Семена 2 × 10 6клеток на 10 см блюдо культуры с использованием Плат-E среду без каких-либо антибиотиков.
- Инкубируйте клетки O / N в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.
- На следующий день, передача 300 мкл Opti-MEM в 1,5 мл пробирке.
- Добавить 27 мкл полиэтиленимина (PEI), экономически эффективный реагента для трансфекции 12, на подготовленную трубу с Opti-MEM. Осторожно перемешать пальцем разговоров и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Добавить 9 мкг трансфекции класса плазмидной ДНК в OPTI-MEM / PEI трубки, осторожно перемешать на вортексе и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Добавить ДНК / ПЭИ комплекс по каплям в Plat-E блюдо и инкубировать O / N при 37 ° С, 5% СО 2.
- На следующий день, аспирации среду, содержащую реагента для трансфекции и добавить 10 мл свежей Плат-E среды (без антибиотиков).
- Вернуться клеток в инкубатор.
3. NIH 3T3, и инфекции
- Создание NIH3T3 Культуры и посев
- Быстро оттаивают NIH-3T3 клеток в ° С на водяной бане при 37 и передавать в 15 мл пробирку. Медленно добавляют 9 мл NIH-3T3 среде (DMEM + 10% FBS).
- Центрифуга трубки на 180 х г в течение 5 мин и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют клеток с 10 мл NIH 3T3 среды и перенести в 10 см блюдо культуры.
- Инкубируйте клетки в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора. Очень важно, что NIH 3T3, всегда хранятся underconfluent (50-60%), так как частота спонтанного преобразования (и, следовательно, базальных уровней фокусов формирования) увеличивает когда культура достигает слитности.
- Семя 3 х 10 5 клеток на 10 см чашку и инкубировать O / N для инфекции следующий день.
- Инфекция
- Урожай ретровирусный супернатант от Plat-E тарелки с помощью 10 мл одноразовый шприц, фильтрации его через нейлон размер мембранный фильтр 0,45 мкм пор, и передачи его в 15 млтруба.
- Добавить 10 мл свежего Плат-E среды к клеткам (без антибиотиков), и вернуть их в инкубатор.
- Аспирируйте среду от клеток NIH-3T3 блюдо быть заражены, и добавляют 5 мл регулярной NIH-3T3 среды и 5 мл, содержащих вирус отфильтрованной надосадочной жидкости.
- Добавить полибрена к чашке с концентрацией 6 мкг / мл.
- Инкубируйте клетки O / N при 37 ° С, 5% СО 2.
- На следующий день повторите шаги 3.2.1 - 3.2.5 для второго раунда инфекции.
- Заменить Содержащую вирус среду с регулярным NIH-3T3 среды.
- Разрешить клетки NIH-3T3 культивировали в течение 2-3 недель, заменяя среду по мере необходимости. Проверка экспрессии интересующего белка с помощью обычного электрофореза белков и иммуноблоттинга на целых клеточных лизатов из реплик пластин.
4. Окрашивание и количественного
- Кристалл Фиолетовый Окрашивание
- Аспирируйте среду NIH 3T3 и поместите посудуна льду.
- Мыть посуду в два раза с ледяной PBS.
- Зафиксировать клетки с ледяной метанола в течение 10 мин.
- Удалить посуду из льда, аспирации метанола и добавляют 3 мл 0,5% -ного раствора кристаллического фиолетового, сделанные в 25% метаноле (RT).
- Инкубируйте блюда в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Аспирируйте кристаллическим фиолетовым решение и тщательно промыть блюдо с Milli-Q H 2 O, пока цвет не сходит при полоскании.
- Разрешить блюда высохнуть O / N на настольной (непокрытый).
- Очаги Количественное
- После того, как блюда в сухом, используйте линейку, чтобы измерить потемневшие коллекции клеток на пластине. Только рассчитывать те, которые больше, чем 5 мм в диаметре, как "очагов." Записать число очагов и рассчитать средние и значение по сравнению с контрольной группой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MXD3 является основной спираль-петля-спираль лейцин молния (bHLHZ) транскрипционный фактор, который является членом MYC / MAX / MAD сети. Это нетипичный член MAD семьи 13-15 и было сообщено, участвуют в канцерогенезе 16,17. По сравнению с pBABEpuro (отрицательный контроль) и MYC (положительный контроль), блюда NIH-3T3, где MXD3 был избыточно экспрессируется было значительно меньше очагов (рис 1а). Данные в фиг.1В были собраны из нескольких опытов по определению значения.
Был первоначальный интерес в определении онкогенного потенциала MXD3, потому что он имеет такую же активность в MYC (известный онкогенов). Тем не менее, результаты этого анализа показывают, что MXD3 не функционирует как онкоген.
Рисунок 1. Фокус формирование анализРезультаты. онкогенными потенциал MXD3 определяли путем формирования фокус анализа (FFA) в клетках NIH-3T3. (A) Изображения клеток из одного эксперимента, окрашенном Хема 3. Примечание: Crystal Violet может быть использован в качестве альтернативного пятна. (B) в сочетании Результаты трех экспериментов. Все эксперименты выполняли в двух повторностях. Фокус рассчитывает для каждого эксперимента, следующие: Эксперимент 1: pBABEpuro (13, 11), MXD3 (3, 4), MYCN (23, 19); Эксперимент 2: pBABEpuro (8, 7), MXD3 (1, 0), MYCN (22, 20); Эксперимент 3: pBABEpuro (9, 20), MXD3 (3, 0), MYCN (21, 12). Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение числа очагов всех трех экспериментов. Значение: ** р <0,01; *** Р <0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FFA обеспечивает быстрый и простой способ оценить злокачественной трансформации в пробирке. Это поддается скрининга относительно большого количества генов-кандидатов, и его скромные технические требования делают рентабельным. Кроме того, два или более генов может быть совместной экспрессии (иногда упоминается как "сотрудничество" анализа) для оценки онкогенного потенциала в сочетании. Преимущества этого анализа опираться на его простой техники, простотой количественного и его сравнительно короткий время оборота. Следует подчеркнуть, однако, что она представляют ограничения всех анализов в пробирке. Анализ оценивает онкогенного преобразования путем измерения один фенотипический признак раковых клеток, а именно, их способность расти вне монослоя в культуральной чашке. Отрицательные результаты, следовательно, их следует интерпретировать с осторожностью, так как конкретного онкогена может вызвать трансформацию без содействия этой конкретной phenotypэлектронной или может потребовать совместная экспрессия с другим геном (например, взаимодействие упоминалось выше). В этом случае рекомендуется, чтобы оценить трансформацию с помощью других методов в пробирке, таких как определение скорости пролиферации и требований в сыворотке и / или крепления независимого роста, например, в мягком агаре анализа.
Хотя техника FFA является простым, несколько условий должны быть соблюдены. Самое главное, что важно использовать субклон 3Т3, которая показывает очень низкую спонтанную трансформацию. Будучи предварительной неопластических (в особенности, что делает эту клеточную линию очень чувствительный для этого анализа), определенные флаконы могут содержать значительное количество уже трансформированных клеток, в результате чего неприемлемо высоких базальных уровней для анализа. Чтобы свести к минимуму спонтанное превращение очень важно, что исходное культура получена из авторитетного источника. Кроме того, камеры должны быть субкультивировали на регулярной основе и никогда не позволял, чтобы достичь слияния.Мы рекомендуем поместить культур, когда они достигают примерно 50% слияния. По этой причине важно, чтобы создать дополнительные конструкции для использования в качестве контрольных. В наших экспериментах мы использовали pBABEpuro, содержащие MYC (известный онкогенов) 18 и пустой pBABEpuro в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно.
Конструкт интерес, могут быть введены в 3Т3 клеток с использованием различных методов; Наиболее часто, традиционные методы трансфекции были использованы. В протоколе, представленной здесь, использование вирусной трансдукции обеспечивает надежную, эффективную и стойкую способ доставки генов. Кроме того, использование экотропного ретровируса делает этот анализ достаточно безопасными при обращении потенциальных онкогенные конструкции; Однако, надлежащие меры биобезопасности, конечно, должны быть соблюдены.
При проведении вышеуказанного Протокола реплики эксперименты пластина должна быть выполнена для того, чтобы как пятно и сбора урожая клеток из тех, плАтеш. Собранные клетки затем могут быть использованы для подтверждения сверхэкспрессии гена интересов, с помощью иммуноблот.
Хотя вирусной доставки генов представляет ряд преимуществ по сравнению с преобразованием, следует отметить, что это делает представить некоторые недостатки, а также и многие лаборатории все еще используют стандартные протоколы трансформации. Вирусный трансдукция не могут быть пригодны при сильном избыточная экспрессия необходима; С другой стороны, физиологическое значение очень высоким уровнем экспрессии достигается плазмиды трансфекции может быть сомнительной.
Наконец, следует подчеркнуть, что второй тест обычно требуется, чтобы убедиться, что очаги в результате онкогенной трансформации. Очаги могут быть выбраны (до окрашивания) и выращивают в мягкой-агар для подтверждения якорной независимый распространения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом из Нью-Новатор программы по присуждению директора NIH (ЭД). АА частично поддержана студентов награды от Национального института рака и Национального научного фонда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pBABE-puro vector | Addgene | Plasmid 1764 | cloning vector |
| Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic | Cell Biolabs, Inc. | RV-101 | cell line for viral production |
| NIH 3T3 Cell Line murine | Sigma-Aldrich | 93061524 | cell line for focus formation assay |
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe | BD Biosciences | 309604 | viral production reagent |
| 0.45 μm Puradisc Syringe Filter | Whatman | 6750-2504 | viral production reagent |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc. | 23966-2 | cell transfection reagent |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | EMD Millipore | TR-1003-G | cell transfection reagent |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | cell stain reagent |
| Plasmid Plus Midi Kit | QIAGEN | 12945 | plasmid purification |
| BD Falcon Tissue Culture Dishes | BD Biosciences | 353003 | cell culture supplies |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | cell culture media |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | cell culture supplies |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-062 | cell culture media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | cell culture media |
References
- Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. Biological assays for Ras transformation. Methods in enzymology. , 255-395 (1995).
- Celis, J. E. Cell biology : a laboratory handbook. , 3rd edn, Elsevier Academic. 345-352 (2006).
- Raptis, L., Vultur, A. Neoplastic transformation assays. Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).
- Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells. Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).
- Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene. IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).
- Yancopoulos, G. D., et al. N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).
- Fujiwara, S., et al. Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening. Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene. 7, 1063-1066 (2000).
- Morgenstern, J. P., Land, H. Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
- Klaver, B., Berkhout, B. Comparison of 5' and 3' long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus. Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).
- Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).
- Fox, E. J., Wright, S. C. S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells. The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).
- Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation. Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).
- Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression. Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).
- Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3. Cell cycle. 7, 423-427 (2008).
- Barisone, G. A., et al. Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells. PloS One. 7, e38508 (2012).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112, 193-205 (2003).
