Summary
Pattedyrs hud indeholder en bred vifte af strukturer - såsom hårsækkene og nerveender - der udviser karakteristiske mønstre af rumlig organisation. Analyse af huden som en flad montering drager fordel af 2-dimensional geometri dette væv til at producere fuld tykkelse billeder af hud strukturer med høj opløsning.
Abstract
Skin er en meget heterogen væv. Intradermal strukturer omfatter hårsækkene, arrector Pili muskler, epidermal specialer (såsom Merkel celle klynger), talgkirtler, nerver og nerveender, og kapillærer. Den rumlige arrangement af disse strukturer er tæt kontrolleret på en mikroskopisk skala - som det ses for eksempel i ordnede arrangement af celletyper inden for et enkelt hårsækken - og på en makroskopisk skala - som det ses af de næsten identiske orienteringer af tusindvis af hår hårsække inden for en lokal region i huden. Visualisere disse strukturer uden fysisk sektionering huden er muligt på grund af 2-dimensional geometri dette organ. I denne protokol, viser vi, at mus hud kan dissekeres, faste, permeabilized, farves, og præciseret som et intakt todimensionalt objekt, et fladskærms mount. Protokollen giver mulighed for nem visualisering af hud strukturer i deres helhed gennem hele tykkelsen af store områder af huden ved optiCal sektionering og genopbygning. Billeder af disse strukturer, kan også integreres med oplysninger om position og orientering i forhold til kroppens akser.
Introduction
Huden er en af de største organer i kroppen, med vigtige funktioner i somato-sensation, isolering / varmeregulering og immunforsvar 1.. Forståelse af det molekylære og cellulære grundlag for udvikling hud og funktion har været for langvarig interesse på grund af den grundlæggende betydning af huden som et biologisk system og dets relevans for dermatologi. Pattedyrs hud indeholder en række flercellede strukturer, herunder lagdelte lag af keratinocytter dermal bindevæv flere typer af hårsække, talgkirtler arrector pili muskler, blodkar, og mindst et dusin forskellige klasser af afferent (sensory) og efferente nerve fibre (figur 1). Forskellige regioner af kroppen er forbundet med karakteristisk forskellige typer af huden. I de fleste pattedyr, er næsten hele kroppens overflade dækket med hud, der er tæt pakket med hårsækkene. [Mennesker og nøgne muldvarp rotter er undtagelser til ther mønster.] Hair mangler palmar overflader af hænder og fødder, som også er forbundet med specialiserede epidermale mønstre (dermatoglyphs), eksokrine kirtler og sensoriske nerveender. De cellulære og molekylære begivenheder, der styrer vækst, differentiering og rumlige arrangement af celler i hårsækken er af særlig interesse, da hver follikel udstiller i miniature, mange af de centrale elementer i organogenese 2. Disse funktioner omfatter eksistensen af stamceller og en stamcelle niche, netop koreograferede celle vandringer, og montering af flercellede strukturer fra embryologisk forskellige komponenter.
Denne artikel beskriver metoder til at dissekere, fastgørelse, mærkning og billedbehandling mus huden som et intakt todimensionalt ark, der omtales som en "hel mount" eller "flat mount" præparat. Da musehud er relativt tynd, er det muligt at billede gennem den fulde tykkelse fladtrykt skin under anvendelse af konventionel konfokal mikroskopi. Den flade mount tilgang til billeddannelse pattedyrhud er teknisk fordelagtigt, fordi det omgår behovet for fysisk sektionering, hvorved strukturer skal rekonstrueres udelukkende af optiske sektionering. Eftersom næsten hele huden behandles som et enkelt objekt, flad mount fremgangsmåde letter også billeddannelse af flere områder af kroppens overflade, mens information om position og orientering i forhold bevares til kroppens akser. Endelig strukturer i huden er typisk til stede i mønstre, der gentages med regelmæssige mellemrum, således at lette samling af billeder fra flere repræsentanter for en given struktur. Disse egenskaber er velkendt for neurobiologi, der arbejder på nethinden, en todimensional del af det centrale nervesystem, som har tilsvarende fordele, til undersøgelser af neuronal morfologi 3.
Den flade mount tilgang beskrives her er af særlig utility for at studere strukturer, der udviser rumlige organisation på en relativt stor skala i det todimensionale plan af huden. Et eksempel på storstilet rumlige organisering er koordineret polaritet hårsækkene og hårsækken-associerede strukturer - Merkel celle klynger, arrector Pili muskler, talgkirtler og nerveender 4. Hårsækkene er orienteret i en vinkel i forhold til planet af huden, og komponenten af hårsækken vektor, der ligger inden for det 2-dimensional plan huden udviser generelt en orientering med hensyn til kroppens akser, der er præcist bestemt for hver position på kroppen. For eksempel hårsækkene på bagsiden point fra rostralt caudale hår på den dorsale overflade af fødderne peger fra proximale til den distale. Hårsækken orientering styres af plane celle polaritet signalering (PCP også kaldet tissue polaritet 5). Dette signalsystem blev opdaget i Drosophila, hvor en lillesæt af centrale PCP gener fandtes at styre orienteringen af kutikulære hår og børster. Tre pattedyr orthologues af centrale PCP gener - Frizzled homolog 6 (Fzd6, også kaldet FZ6) cadherin EGF LAG syv-pass type G-receptor 1 (Celsr1), og vang-lignende 2 (Vangl2) - spille analoge roller i pattedyr hud, koordinerer orienteringer af hårsækkene med kroppens akser. Undersøgelser af FZ6 knockout-mus (Fzd6 tm1Nat, i det følgende benævnt FZ6 - / -) viser, at den primære defekt i fravær af PCP signalering er en indledende randomisering eller forvaltningsmæssigt hårsækken orientering, uden effekt på den indre struktur af folliklerne 6-8. En anden ikke-PCP, optræder senere at fremme den lokale tilpasning af nærliggende hårsække, der fører til produktion af store hår mønstre som hvirvler og totter.
Et andet eksempel på stor skalarumlige organisation i huden ses i morfologi af sensoriske Axon dorne. Sensoriske neuroner, der innerverer huden har deres celle organer i den dorsale rod og trigeminusganglier. Disse neuroner detektere temperatur, smerter, kløe, og forskellige typer af mekaniske deformationer, som rammer huden og håret 9. De kan opdeles i subtyper baseret på axon diameter og ledningshastighed terminal nerveenden struktur, og mønstrene af ekspression af receptorer, kanaler og andre molekyler. På grund af den høje tæthed af innervation i huden, analyser, der involverer visualisere alle axoner (f.eks anti-neurofilament-immunfarvning) eller endog alle axoner af en enkelt klasse (som ses, når en enkelt celle er markeret af ekspression af en fluorescerende reporter) generelt afslører en tæt superposition af axoner, der gør det umuligt at definere morfologi af en enkelt dorn. For at omgå dette problem, har vi brugt meget sparsom genetisk rettet labeling at producere dorsale hud prøver, hvor de enkelte godt isoleret Axon dorne er visualiseret ved ekspression af et histokemisk reporter, human placental alkalisk phosphatase 10. Denne fremgangsmåde giver den utvetydige visualisering af individuelle axon arbor morfologier og en definition af somatosensoriske neuron typer baseret på morfologiske kriterier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Alle dyrene blev behandlet i henhold til godkendte institutionel dyrepleje og brug udvalg (IACUC) protokol MO11M29 af Johns Hopkins medicinske institutioner. Kontakt din lokale Institutional Animal Care og brug Udvalg retningslinjer for godkendte metoder til dødshjælp. Bær handsker, kittel og sikkerhedsbriller ved håndtering af aldehyd fiksativer eller organiske opløsningsmidler.
1.. Forberedelse af materialer
- Hælde Sylgard Plates
- Følg producentens anvisninger, bland hærderen med basen, og rør med en plastik stang.
- Pipette ~ 35 ml væske Sylgard pr 10 cm i diameter vævskulturskål. Vævskulturskåle er dybere end standard bakterielle retter; dette giver lodret godkendelse af de insekt ben.
- Placer dishes på en horisontal overflade ved stuetemperatur natten over. Bobler dannet under blanding vil forsvinde.
- Efter polymerisation, opbevare Sylgard pladerne ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Sylgard plader kan opbevares ved stuetemperatur i årevis, og genbruges flere gange, indtil Sylgard løsner fra pladen.
- Løsninger
- Benzylbenzoat og benzylalkohol (BBBA). Bland 2 volumener benzylbenzoat og 1 volumen benzylalkohol. Opbevares i mørke i en glasflaske med en prop eller Teflon top.
ADVARSEL: Brugt BBBA skal håndteres korrekt som organisk affald opløsningsmiddel. Lad ikke BBBA at kontakte plast. - Phosphatbufret saltvand (PBS). Tilføj 4 g PFA til 80 ml vand, der tilsættes 0,1 ml 1 N NaOH, røre på en varmeplade ved ~ 70 ° C i ~ 5 min, indtil PFA er helt opløst, og derefter tilsættes 10 ml 10x PBS og rumfanget bringes op på 100 ml med vand.
ADVARSEL: Indånding af formaldehyd / PFA og BBBA dampe bør væreminimeres ved at holde disse løsninger i overdækkede containere. Formaldehyd / PFA er kræftfremkaldende. - Oil Red O. Forbered en 0,5% bestand i isopropanol. Umiddelbart før brug fortyndes med vand til en slutkoncentration på 0,3% Oil Red O, og filtreres derefter gennem et 0,2 um filter.
- Benzylbenzoat og benzylalkohol (BBBA). Bland 2 volumener benzylbenzoat og 1 volumen benzylalkohol. Opbevares i mørke i en glasflaske med en prop eller Teflon top.
2.. Hud Dissektion, fiksering og Clearing
- Dorsalhud for Immunfarvning og Melanin Imaging
- For meget unge mus (f.eks fostre og postnatal dag (P) 0-P3 unger), aflive mus ved isofluran inhalation. Aflive ældre mus ved isofluran inhalering eller ketamin / xylazin injektion efterfulgt af cervikal dislokation.
- Fjern hår med en elektrisk barbermaskine og hårfjerning gel. For mus yngre end P8, kan dette trin springes over.
- Brug et barberblad til at lave en vandret snit fra bunden af halen langs hver flanke, der passerer på den dorsale side af bunden af hvert ben, fortsætter lateral til ørerne og enderer på næsen.
- Skræl forsigtigt huden fra det underliggende væv proceduren fra posterior til anterior ved at holde huden mellem behandskede fingre, så den ikke bliver klemt af en pincet. Når peeling huden på niveau med ørerne, først skåret ørerne med en saks og fortsæt specielt langsomt som huden kan rive på denne placering.
- Fra dette punkt og fremefter orientere huden med indersiden opad. Pin huden til Sylgard med ~ 20 insekt stifter jævnt fordelt rundt i periferien; ikke over-strække huden (figur 2B). Dække huden med 10-20 ml PBS.
- Dissekere væk hud-associerede fedt og bindevæv bruge vinklede eller buede pincet med den spidse ende af tangen står vandret for at minimere risikoen for at tangen vil trænge ind i huden. Ekstrudere eventuelle luftbobler, der er fanget under huden ved forsigtigt at rulle en bomuld tippes applikator over hudoverfladen.
BEMÆRK: Hvis huden gårskal anvendes til flade mount immunfarvning eller histokemi, fjerne så meget af bindevæv som muligt; hvis huden vil blive anvendt til at visualisere hårsækkene baseret på melanin pigmentering, mindre fuldstændig fjernelse af bindevæv er tilfredsstillende. Prænatal hud kræver minimal "rengøring" af vedhængende bindevæv. - Fastgør pinned huden ved tilsætning af 20 ml frisk fremstillet 4% PFA / PBS eller 10% pufret formalin pr 10 cm Sylgard plade (hvis huden vil blive anvendt til melanin billeddannelse eller alkalisk phosphatase (AP) histokemi) eller 20 ml frisk fremstillet 2% PFA / PBS (hvis huden vil blive anvendt til immunfarvning visualiserer eller transgene Keratin (Krt) 17-GFP 11), og forsigtigt rotere natten over i et koldt rum. Den næste dag vaskes i PBS i> 10 minutter.
BEMÆRK: Standard formalin er 37% formaldehyd; Derfor, "10% formalin" er 3,7% formaldehyd. - For AP farvning og immunfarvning, fortsætter i afsnit 3. For melanin imagmaterialer, dehydrere huden gennem en gradueret ethanolserie (70%, 95%, 100%), en dag for hvert trin med forsigtig vandret rotation ved stuetemperatur. Fjerne resterende bindevæv.
- Med huden i 100% ethanol, fjerne de insekt ben og, om ønsket, trim huden med en saks for at fjerne mest perifere 1-2 mm i huden med små huller.
- Overfør huden til en diameter på 10 cm glasfad, placere to mikroskopobjektglas på huden for at forhindre det curling, og der tilsættes 20 ml BBBA. BBBA hurtigt hærder væv, så det er vigtigt for huden til at blive fladtrykt under vægten af objektglas før tilsætning af BBBA.
- Over de næste par timer, løft glider af huden i et par sekunder for at tillade BBBA at vaske over huden.
BEMÆRK: Brug handsker, når du arbejder med BBBA. Afhængigt af alder og placering af huden kan der være så meget som 30% krympning i BBBA.
- Foot Hud for Analyse af hårsækken Patterning
BEMÆRK: række aldre typisk undersøgte er P1-P8.- Efter dødshjælp, afbrød fødder over ankelleddet og lave en enkelt lige snit langs den ventrale overflade gennem fodsålerne.
- Forsigtigt skræl fra det underliggende væv, forløber i en proximal til distal retning.
- Skær de cifre Slip huden og pin det til Sylgard med indersiden opad (figur 2C). Der er minimal bindevæv på foden huden.
- Transgene Krt17-GFP hud er nu klar til billeddannelse. For melanin billeddannelse fortsætte med fiksering, dehydrering og BBBA clearing, som beskrevet i afsnit 2.1.
- Fod Skin for Visualisering talgkirtler
- Efter dødshjælp, fjerne hår ved at gnide hår remover gel over hudoverfladen med en behandsket finger og tommelfinger; vente i 10 min.
BEMÆRK: Brug ikke en elektrisk barbermaskine, der vil ødelægge den fine fod huden. - Wforaske hudoverfladen med vand fra hanen, dissekere og pin huden til Sylgard som beskrevet i afsnit 2.2.
- Fix med 1% PFA / PBS i 30 minutter ved stuetemperatur og derefter vaske i PBS.
BEMÆRK: For at visualisere talgkirtlerne på fødderne, som udvikles efter de første postnatal uge, den optimale alder for analyse med Oil Red O er P21, fordi det markerer nadir af hår pigmentering under den første hår cyklus 12, og derfor talgkirtler kan ses lettere. Med albino mus denne analyse kunne udføres på alle alderstrin. For at opnå albino afkom tværs pigmenteret mutantmus en tyrosinase mutant linje såsom C57BL/6J-Tyr c-2J.
- Efter dødshjælp, fjerne hår ved at gnide hår remover gel over hudoverfladen med en behandsket finger og tommelfinger; vente i 10 min.
- Tail Hud Forberedelse til Analyse af Melanin Distribution, hårsækken Orientering og Talgkirtel Visualisering
- Efter eutanasi, gør en cirkulær snit omkring haleroden, og derefter en langsgående spalte, der kører længden af halen langs dens ventrale ansigt. <li> Peel halen huden begyndende ved spidsen af fast greb spidsen af halen, knogle-og / eller bindevæv med en tang, og huden med en anden tang. Pin halen huden til Sylgard.
- Til analyse af melanin distribution og hårsækken orientering, fastsætte og behandle huden som beskrevet i afsnit 2.1. Til analyse af talgkirtler, skære halen huden i en række segmenter ~ på 0,5 til 1 cm i længden før fiksering og inkubér skindstykkerne i PBS / 5 mM EDTA natten over ved 37 ° C for at svække dermis-epidermis vedhæftning 13.
- Forsigtigt skrælle epidermis fra dermis, pin epidermis til Sylgard (inderside op), og ordne det i 4% PFA / PBS i 1 time ved stuetemperatur. Vask med PBS og farves med Oil Red O som beskrevet nedenfor.
BEMÆRK: En elektrisk barbermaskine og / eller hårfjerning gel kan bruges før dissekere ældre hale huden (fx P21), men denne behandling er valgfrit, da hår på halen er ikkeså tæt som andre steder på kroppen.
3.. Farvning Reaktioner
- Menneskelige Placental alkalisk phosphatase (AP) Histochemistry at Visualiser Genetisk mærket Axon holdere 10,14,15 (figur 3A, B)
- Efter PFA fiksering på Sylgard placere faste skind i en 10 cm glas fad og dykke under PBS / 1 mM MgCl2. Forsigtigt dreje skålen i et vandbad ved 70 ° C i 90 minutter for at ødelægge endogent phosphataseaktivitet.
- Visualisere AP reporter aktivitet histokemisk med en 4-48 timers inkubation ved stuetemperatur i 0,1 M Tris, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 0,34 ug / ml NBT og 0,175 ug / ml BCIP, typisk under anvendelse af 10-15 ml farveopløsning pr P21 dorsale hud. Overvåg reaktionen under dissektionsmikroskop, pas på ikke at lade det fortsætte ud over det optimale tidspunkt, som bedømt ved visuel inspektion af Axon farvningsintensitet forhold til uspecifik NBT deposition. Reaktionen standses ved vask med tre skift af PBS/0.1% Tween-20 i løbet af 1 time, re-pin skindene til Sylgard, dehydrere skind gennem en ethanol-serien, og derefter overføre skind til en 10 cm skål med BBBA.
BEMÆRK: BBBA langsomt opløses NBT bundfald. I løbet af de første par timer i BBBA vil en fin baggrund af udfældet NBT opløses; som et resultat, vil BBBA løsning mørkere, og huden vil lysne. Skift til frisk BBBA efter et par timer. - Efter billeddannelse AP-farvede hud, overføre det til ethanol for> 1 time ved stuetemperatur og derefter gemme det i frisk ethanol ved -20 ° C. AP-farvede skind kan opbevares på denne måde i mange måneder uden tab af signal.
- Oil Red O Farvning at Visualiser talgkirtler 4 (figur 3C-F)
- Fjern insekt stifter og overføre den let fast fods eller hale skind fra Sylgard pladen til brøndene i en 6-brønds vævskulturplade medop til to hudprøver per brønd. Vask med 60:40 isopropanol: vand i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Stain i 2 ml 0,3% Oil Red O i 60:40 isopropanol: vand (se afsnit 1.2) ved stuetemperatur i 2 timer.
- Vask med 60:40 isopropanol: vand i 5 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af en vask med vand. Omhyggeligt trim væk kanterne af huden, herunder pin huller, med fine saks, således at overfladen af huden kan gøres så flad som muligt.
- Placer huden på et dias med den ydre overflade opad, tilsæt et par dråber vand eller vandige montering medium, dække huden med et dækglas, og derefter forsigtigt tape dækglasset til diaset for yderligere flade huden.
- Flat Mount Immunfarvning 4,16,17 (figur 3G, H)
- Klip et rektangel af PFA fast huden (fx 1 cm x 0,5 cm), der markerer sin orientering med en asymmetrisk snit (fx klippe den forreste højre hjørne). Udfør inkubation ogvasketrin med forsigtig rotation på en roterende horisontal platform. I brøndene af en 6 - eller 12-brønds vævskulturplade, vaskes flere gange med PBS for at fjerne resterende PFA, vaskes med ~ 10 udskiftninger af PBS med 0,3% Triton X-100 (0,3% PBST) mere end 5-8 timer ved stuetemperatur til permeabilisere huden.
- Inkuberes med det primære antistof i 0,3% PBST med 5% gedeserum og 20% DMSO i fem dage ved stuetemperatur. Dæk pladens huller, med klar tape eller lim plast for at eliminere fordampningstab.
- Vask med 10-15 ændringer af 0,3% PBST i 5-8 timer, og der inkuberes med sekundært antistof i 0,3% PBST med 5% gedeserum og 20% DMSO i 3 dage ved stuetemperatur.
- Vask med 10-15 ændringer på 0,3% PBST end 5-8 timer.
- Dehydreres i 25%, 50% og 75% methanol i 5 minutter hver og derefter 3x i 100% methanol i 20 minutter hver.
- Klart i BBBA natten over ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Flad mount immunfarvning af hud yngre end~ P1 kan udføres som beskrevet ovenfor, men med kortere inkubation og vask gange. For eksempel kan P1 hud blive immunfarvet med inkubation natten over i det primære antistof og en flere timers inkubering i sekundært antistof og med mellemliggende vaskninger kun 2-3 timer i 0,3% PBST. Som bemærket ovenfor, yngre skind er også tilstrækkeligt tynde, at de kan afbildes uden BBBA clearing.
- Visualisering Merkel celle Clusters med fluorescerende Nerve Terminal farvestofoptagelse (figur 3I-L)
AMI-43 (grøn) og AM4-65 (rød) fixable fluorescerende farvestoffer, der trænger ind i celler via ikke-selektive kationkanal 18. I de levende hud disse farvestoffer selektivt op og koncentreret i Merkel celler.- Opløs 1 mg AM1-43 eller AM4-65 i 2 ml PBS og opbevares i portioner ved -80 ° C.
- Injicer nyfødte hvalpe subkutant med 2-10 ug farvestof per gram kropsvægt under anvendelse af en 29 G nål.
- En dag senere, aflive de mus og theseCT dorsale skind.
- Fix skind i 4% PFA / PBS ved 4 ° C natten over, vask med PBS, og monter huden som beskrevet i afsnit 3.2.
4.. Imaging og billedanalyse
- Imaging hårsækken Orientering (Figur 4)
- Brug en dissektionsmikroskop til billede ryg-, fod eller hale skind, der er nedsænket i BBBA, fladtrykt under en glasplade, og stadig i glasfad - denne fremgangsmåde minimerer BBBA forurening af mikroskopet.
- Oplys fadet nedefra. For at minimere rumlig variation i lysintensitet over synsfeltet, løfte glasskål til en højde ~ 10 cm over arbejdsstandarden overflade dissektionsmikroskop og placere en spredende plast eller glas plade over lyskilden.
- Retur huden til 100% ethanol til langtidsopbevaring ved -20 ° C.
BEMÆRK: efterlader huden i BBBA for mere end en dag forårsager melanin granulat til at bryde endel. Når huden er blevet BBBA behandlet det vil hærde og forblive flad fra dette punkt og fremefter. Forskellige skind kan være kodet med en serie indhak på deres forreste og / eller bageste ender, så de kan opbevares sammen for at spare plads i fryseren.
- Imaging and Tracing Axon holdere (figur 3A, B)
- Placer AP farvet hud (afsnit 3.1.3) mellem to glasplader af den type bruges til små proteingeler. Undgå at indføre luftbobler mellem pladerne og huden, og derefter forsigtigt væge væk overskydende BBBA med en papirserviet. Placer sandwich plade-hud-plade på et mikroskop etape (figur 2D).
- Brug lyse-felt eller DIC belysning med en 10X objektiv og 2 m eller 5 m Z-trin. Brug en mekaniseret XY scenen for at fange en montage af XY billeder, der er syet sammen for at skabe et enkelt tredimensionelt grå-skala datasæt.
BEMÆRK: For en enkelt stor Axon lysthus, kan dette datasæt være ens stor som 5 Gb. - Udføre manuel, automatiseret eller semi-automatiseret sporing af Axon dorne med nogen af en række software-pakker.
BEMÆRK: Software som Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) er en gratis neuronal rekonstruktion værktøj, der kører i et pc-miljø, og er relativt let at mestre 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brightfield billeddannelse af huden flatmounts kan bruges til billede kutane sensoriske afferente (figur 3A 10) og hårsækken mønstre baseret på melanin pigmentering (Figur 4). Konfokal afbildning af hud flatmounts kan anvendes til at definere geometrien af (1) Merkel celleklynger, visualiseret med anti-cytokeratin-6 eller med AM farvestofoptagelse (fig. 3I-L), (2) arrector pili muskler, synliggjort med anti- glat muskel-actin (figur 3G, H), (3) talgkirtler, visualiseret med Oil Red O (figur 3C-F), og (4) hårsækkene, visualiseret med en Krt17-GFP transgen eller ved farvning med anti-Krt17 antistoffer 4 (figur 3E-G, K, L). Det er ligetil at manuelt at score de retningslinjer og rumlige arrangementer af strukturer i sådanne billeder ved at placere vektorer kendt orientering om de strukturer ved hjælp af Adobe Photoshop eller Illustrator og derefter quantifying den resulterende vektor befolkninger. Mens denne tilgang er tilstrækkelig til en skala på adskillige hundrede vektorer, ville det være uoverkommeligt besværligt på en 10 - eller 100-fold større skala.
Figur 1.. Skematisk af pattedyr behåret hud, der viser de vigtigste strukturer. (Copyright, Terese Winslow.)
Figur 2. Hud dissektion og prøvehåndtering. A) Dissektionsværktøj. B) A P5 dorsalhud fastgjort til en Sylgard plade. C) A P5 dorsal bagben hud fastgjort til en Sylgard plade. D) En ryghuden monteret mellem 2 glas gel plader til billedbehandling wed en 10X objektiv og DIC eller lysfelt belysning.
Figur 3.. Skin strukturer i fladt mount synspunkter. A, B) En enkelt kutant sensorisk lysthus (venstre) og dets spores billede (til højre) fra en P21 dorsalhud af en Brn3a CKOAP / +;. NFL-creer / + mus udsat for lav dosis tamoxifen ved gestationel dag 17 Denne protokol resultater i Cre-medieret rekombination af reporteren i en meget lille brøkdel af dorsal rod ganglion-neuroner, og dermed en lille brøkdel af kutane sensoriske dorne er mærket med human placental alkalisk phosphatase (AP) reporter. De mærkede axoner er visualiseret med NBT / BCIP histokemi. Brn3a Tilsvarende er benævnt Pou4f1. C, D) Tail hud farvet med Oil Red O for at visualisere talgkirtler fraWT (til venstre) og FZ6 - / - (højre) mus ved P21. Den FZ6 - / - strukturer er uorganiseret. P, proksimal; . D, distal E, F) Dorsal fod hud fra WT (til venstre) og FZ6 - / - (højre) mus, der bærer Krt17-GFP. Huden blev høstet ved P21 og farvet med Oil Red O. FZ6 - / - hud har en hår hvirvel i midten. P, proksimal; . D, distal G, H) Dorsal hud fra en WT mus på P21 viser hårsækkene (visualiseret med en Krt17-GFP transgen og anti-GFP immunfarvning, panel G) og arrector Pili muskler [visualiseret med anti-glat muskulatur actin (SMA ) immunfarvning; panel H]. Dybde indenfor konfokal Z-stack billede er farvekodet. En anterior; P, posterior. IL) A Merkel celle klynge (visualiseret med cytokeratin8 immunfarvning eller AM11-43 dye optagelse) og dens centrale hårsækken (visualiseret i paneler K og L med Krt17-GFP). Billeder opnåedes P1 dorsale hud fra de angivne genotyper. Den FZ6 - / - Merkel celle klynge danner en lukket cirkel, mens WT Merkel celle klynge er åben mod den forreste. En anterior; P posterior. Skalapanelerne: A og B, 300 m; C og D, 500 um; E og F, 500 um; G og H, 200 m; IL, 50 um. (Paneler A og B er gengivet fra eLIFE og Proc. Natl. Acad. Sci. USA, med tilladelse 4,10) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4.. Hår og hårsækkene i dorsalhud på P1 og P7 visualiseret med melanin pigmentering. A, B) P1 hud fra WT og FZ6 - / -. mus C, D) P7 hud fra FZ6 - / - mus. Skalapanelerne: A og B, 500 um; C og D, 1 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beherskelse af dissektion ovenfor beskrevne metoder kræver kun tålmodighed, en rolig hånd og et par gode Dissektionsværktøj. Ryghuden dissektion er forholdsvis let, men halen og mund hud dissektioner - især ved tidlig postnatal alder - er mere udfordrende. Ved tidlig prænatal aldre (f.eks før E15), er vanskelig at fjerne uden at rive det i huden. Bekvemt, for mange studier af vækst og mønster af hud strukturer i mus, de begivenheder af interesse opstår efter fødslen, som det for eksempel ses i undersøgelser af væksten i arrector Pili muskler 19.
Imaging dybt ind i huden i en flad mount konfiguration er udfordrende, fordi huden er en forholdsvis lysbrydende væv. Denne udfordring bliver større da huden modnes på grund af den differentiering og øget tykkelse af dets lag. En delvis løsning på dette problem er at adskille dermis og epidermis og analysere epidermer som en separat struktur ("epidermal hele mounts"). Denne fremgangsmåde er nyttig til at visualisere hårsækkene og deres tilknyttede strukturer, især for mus hale hud. Men opnåelse af høj kvalitet epidermale hele underlag fra muse dorsalhud er vanskelig, formentlig på grund af (1) den høje tæthed af hårsække, der strækker sig dybt ind i dermis, og (2) den tynde af interfollicular epidermis 13.
Det er vores erfaring, BBBA behandling er en meget effektiv metode til at gøre huden optisk transparent mens immunfluorescerende signaler bevares uden behov for at adskille de epidermale og dermale lag. Benzyl-benzoat er blevet brugt til at rydde væv i årtier 20, og det er i vid udstrækning anvendes til at rydde frø og fisk embryoner. Men BBBA har den ulempe, at det denaturerer GFP og andre fluorescerende proteiner, det opløser Oil Red O, og det kan forurene udstyr (f.eks, mikroskoper). Det ville være interest til systematisk at sammenligne BBBA behandling af huden med andre afklarende metoder såsom SeeDB 21 ClearT 22 Skala 23 3DISCO 24 og klarhed 25, hvoraf nogle er kompatible med fluorescerende proteiner. Hvis BBBA behandlede prøver, der skal afbildes ved hjælp af et dissektionsmikroskop en konventionel lys / fluorescensmikroskop eller et konfokalt mikroskop, skal prøverne anbringes i en glasskål eller mellem to store glasplader at minimere BBBA forurening.
Vi har ikke diskuteret dataanalyse i detaljer, da dette er mere idiosynkratiske biologiske spørgsmål i henhold til undersøgelsen. Men som nævnt i indledningen, tilstedeværelsen af mange næsten identiske strukturer såsom hårsækkene, Merkel celle klynger, og nerveender, og fuldstændighed, hvormed disse strukturer kan filmede i flade mounts giver mulighed for at måle strukturelle eller morfologiske parametre på en statistisk streng manner, som det ses for eksempel i de seneste undersøgelser af kutane sensoriske Axon morfologier 10 og hårsækkene og follicle-associerede strukturer i vildtype og FZ6 mutant mus 4,8. Med udviklingen af mere avancerede billede analyseværktøjer, kan det være muligt at automatisere eller semi-automatisere nogle af de analyser, der på nuværende tidspunkt udføres manuelt, og derved lette større brug af hud flad montere billeddannelse som en metode til at undersøge de principper, der ligger til grund flercellede organisation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) | Roche | 11383221001 | |
| AM1-43 | Biotium | 70024 | |
| AM4-65 | Biotium | 70039 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B-6630 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cy3-alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | C6198 | 1:400 |
| Cytokeratin-8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-c | 1:500 |
| Dissecting microscope | |||
| Dissection tools | Fine Science Tools | scissors and forceps | |
| Electric razor | |||
| Fluoromount G | EM Sciences | 17984-25 | |
| Formalin | Sigma | HT501320 | |
| Glass dishes | Pyrex | 6 cm and 10 cm diameter | |
| Glass plates | Amersham Biosciences | SE202P-10 | 10 cm x 8 cm x 1 mm |
| Hair remover | Nair | ||
| Horizontal rotating platform | Hoefer | PR250 Orbital shaker | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma | K113 | |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Roche | 11383213001 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | Alexa-dye conjugated | |
| Sylgard-184 | Fisher Scientific | NC9020938 | |
| Tissue culture plastic dishes | 10 cm diameter | ||
| Tissue culture plates | 6- and 12-well |
References
- Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. , Wiley Blackwell. (2010).
- Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
- Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76, 266-280 (2012).
- Chang, H., Nathans, J. Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).
- Wallingford, J. B. Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).
- Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. Frizzled6 controls hair patterning in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).
- Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).
- Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice. Development. 137, 4091-4099 (2010).
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, (2012).
- Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice. Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).
- Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 30, 5241-5255 (2003).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology. PLoS One. 3, (2008).
- Devenport, D., Fuchs, E. Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles. Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, 1615-1627 (2011).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144, 577-589 (2011).
- Orsini, M. W. Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies. J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Aal Ertürk,, et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).
