Abstract
Dopaminerge neuronen van minder dan 1% van het totale aantal neuronen in de hersenen. Deze lage hoeveelheid neuronen regelt belangrijke hersenfuncties zoals motorische controle, motivatie, en het werkgeheugen. Nigrostriatale dopaminerge neuronen selectief degenereren bij de ziekte van Parkinson (PD). Deze progressieve neuronale verlies wordt ondubbelzinnig verband met de motoren symptomen van de pathologie (bradykinesia, rust tremor, en spierstijfheid). De belangrijkste agent die verantwoordelijk is van dopaminerge neuronen degeneratie is nog onbekend. Echter, deze neuronen lijken uiterst kwetsbaar in diverse omstandigheden. Primaire kweken vormen een van de meest relevante modellen eigenschappen en kenmerken van dopaminerge neuronen te onderzoeken. Deze culturen kunnen om te stoppen of te vertragen neuronale degeneratie aan verschillende stress-agenten die PD pathologie nabootsen en neuroprotectieve verbindingen worden ingediend. De talrijke transgene muismodellen van PD die gener zijn geweesteerde in het laatste decennium van de belangstelling van onderzoekers voor dopaminerge neuronen culturen verder toegenomen. Hier, de video protocol staat de delicate dissectie van embryonale muizenhersenen. Precieze excisie van ventrale mesencephalon cruciaal is voor neuronale kweken voldoende rijk aan dopaminerge cellen te verkrijgen latere studies laten. Dit protocol kan worden gerealiseerd met embryonale transgene muizen en is geschikt voor immunofluorescentie kleuring, kwantitatieve PCR, tweede messenger kwantificering of neuronale dood / overleving assessment.
Introduction
Dopamine, een van de belangrijkste neurotransmitters 1,2, wordt vooral vrij door dopaminerge (DA) neuronen. De meeste DA neuronen bevinden zich in het ventrale gedeelte van het mesencephalon 2-6. Schematisch kunnen middenhersenen DA neuronen worden onderverdeeld in drie anatomisch en functioneel verschillende projectiesystemen: mesostriatal, mesolimbic en mesocorticale paden 2,5. De nigrostriatale route is betrokken bij motorische gedrag, de mesolimbic wegen spelen een belangrijke rol bij versterking, motivatie en leren, dat de dopaminergische paden projecteert de prefrontale cortex worden betrokken bij cognitie 2.
DA neuronen betrokken zijn bij verschillende menselijke neurologische aandoeningen zoals schizofrenie, aandacht tekort, hyperactiviteit stoornis en de ziekte van Parkinson (PD) 2,4. PD wordt gekenmerkt door een progressieve en selectieve degeneratie van DA neuronen verbinden substantia nigrapars compacta (SNc) het striatum. Het verlies van de nigro-striatale DA neuronen leidt tot ernstige depletie van dopamine in het striatum die verantwoordelijk van de motorische symptomen van PD (bradykinesie, rust tremor, rigiditeit en) 7. De eerste oorzaak van de idiopathische PD is niet vastgesteld en de huidige behandelingen zijn alleen symptomatisch, gericht op het herstellen van dopamine-niveau in het striatum. De meest voorgeschreven geneesmiddel L-Dopa (Levodopa), de natuurlijke voorloper van dopamine. Hoewel de toediening van Levodopa compenseert het verlies van dopamine voor een bepaalde tijd, motorische complicaties optreden na langdurige behandelingen (dyskinesie en on / off toestanden) 8,9.
Onderzoek naar dopaminerge neuronen en PD is in constante progressie en intense inspanningen worden gedaan om behandelingen op basis van stamceltransplantatie, gentherapie, of neuroprotectieve agenten 10,11 ontwikkelen. Echter, een groot probleem nog niet opgehelderd: wat is de oorzaak van de extreme vulnerabiliteit van DA neuronen? Een deel van het antwoord is te vinden in de activiteit van de DA neuronen. Een verlaging van de elektrische activiteit en de prikkelbaarheid van DA neuronen lijkt hun neiging te degenereren 12 vergroten. Toch is de complexiteit van de PD pathogenese vereist verdere studies aan de bij DA mechanismen neuronen degeneratie 13-15 identificeren.
Primaire culturen zijn vooral relevant voor DA neuron eigenschappen 16-19 te bestuderen en deze neuronen aan verschillende spanningen uitdaging voor de evaluatie van neuroprotectieve agenten 20-24. Rat kweekmodellen worden meestal gebruikt als de ontleding van rat embryo mesencephalon is eenvoudiger in vergelijking met de muis en grotere hoeveelheden neuronen kan worden verkregen in de rat. Echter, generatie van transgene muismodellen van de ziekte 25 aanzienlijk het belang van de neurowetenschapper community voor primaire culturen van de muis 26-29 toegenomen. Hoewel culturen prepared van pasgeboren dieren kunnen worden gebruikt, is het beter om te bereiden uit embryo op post-mitotische fase (E13.5 voor mesencephalon neuronen), wanneer neuronen hun vermogen om onderscheid te hebben behouden. Het volgende protocol toont geïsoleerd mesencephalon neuronen in primaire kweek van muizenembryo's (E13.5), die het meest moeilijk te bereiden. Name, bieden we een protocol met behulp van serum-vrij kweekmedium voor een betere reproduceerbaarheid. De twee meest kritische stappen in de cultuur voorbereiding (dissectie en mechanische dissociatie) zal zorgvuldig worden uitgewerkt in de bijbehorende video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De muizen die in dit werk werden verzorgd en behandeld in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese Unie Raad (86/609 / EU) voor het gebruik van proefdieren.
1 Voorbereiding van Verplicht Solutions
- Voorraadoplossingen
- 10x Poly-L-Ornithine (PLO) Oplossing: Weeg 10 mg van de PLO bromide (moleculair gewicht = 30,000-70,000) en los op in 70 ml steriel water. Filtreer de oplossing met 0,2 urn spuitfilter, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C.
- 30% Glucose Oplossing: Weeg 30 g D (+) - glucose en lossen in steriel water tot een totaal volume van 100 ml. Filter, hoeveelheid, en bewaar bij 4 ° C.
- 5x Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) / Nutrient Mixture F-12 Ham: afgewogen 6 g DMEM / Ham F-12 poeder en lossen in steriel water tot een totaal volume van 100 ml. Filter, hoeveelheid, en bewaar bij 4 ° C.
- 7,5% natriumbicarbonaat (NaHCO3) Solution: Weeg 7,5 g NaHCO3 en lossen in steriel water tot een totaal volume van 100 ml. Filter, hoeveelheid, en bewaar bij 4 ° C.
- 1 M HEPES oplossing: Weeg 23,8 g HEPES en opgelost in steriel water tot een totaal volume van 100 ml. Filter, hoeveelheid, en bewaar bij 4 ° C.
- 70% (v / v) ethanol: Verdun 70 ml absolute ethanol met 30 ml steriel water.
- Fosfaat gebufferde zoutoplossing met glucose en antibiotica (PBS-GAB): voeg 10 ml 30% glucose-oplossing en 5 ml penicilline-streptomycine oplossing tot 500 ml Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing. Bewaren bij 4 ° C.
- Geïnactiveerd foetaal runderserum (IFB): Ontdooi runderserum overnacht bij 4 ° C en inactiveren bij 56 ° C gedurende 30 minuten. Aliquot in 50 ml en bewaar bij -20 ° C.
- Cultuur Medium: In steriel water, meng achtereenvolgens 40 ml 5x DMEM / Ham F12-, 1 ml 1 M HEPES, 2 ml van 200 mM L-glutamine, 2 ml penicilline-streptomycine, 4 ml 30% glucose eennd 3 ml 7,5% NaHCO3 tot een eindvolume van 180 ml. Filteren en maken gebruik van dezelfde dag.
- Hormoon Mix
- Bereid 180 ml kweekmedium. Los 200 mg van apo-transferrine in dit medium.
- Weeg 50 mg insuline en los op in 2 ml 0,1 M HCl. Voeg langzaam 8 ml steriel water onder zacht mengen. Verdun deze oplossing in het kweekmedium.
- Weeg 19,3 mg Putrescine dihydrochloride en los op in 10 ml steriel water. Voeg 10 ml oplossing van het hormoon mix.
- Bereid een 3 mM natrium-seleniet opgelost in steriel water en 2 mM progesteron opgelost in absolute ethanol. Voeg 20 ul van elke oplossing op het hormoon mix.
- Filter het hormoon mix, aliquot in 10 ml en bewaar bij -20 ° C.
2 Voorbereiding van Cultuur Platen en Instrumenten
- FBS Coating van de cultuur platen: De dag voor de dissectie, bereiden 180 ml kweekmedium. Voeg 10 mlIFB 90 ml kweekmedium. Voeg 300 ul / putje cultuurmedium / 10% ifbs in poly-D-lysine vooraf beklede platen met 24 putjes. Incubeer overnacht bij 37 ° C. Bewaar de resterende media (met en zonder IFB) bij 4 ° C.
- Steriliseren van de instrumenten en pasteurpipetten. Verzamel de in Materials tabel vermeld, evenals een klasse II laminaire stroming kap en een CO 2 incubator apparatuur.
3 Dissectie van Muis Middenhersenen
- Offeren een E13.5 zwangere muis (volgens de institutionele richtlijnen). Reinig de buik van de muis met 70% ethanol en opent de buik muur. Verzamel de baarmoederhoorns, opent ze met behulp van fijne schaar, ontleden elk embryo uit de baarmoeder horens, en verwijder de vliezen. Plaats de embryo's in een 100 mm petrischaal met steriele PBS-GAB en was ze door overschrijving in 3 opeenvolgende identieke baden met behulp van een tang. Voor dissectie, leg de embryo's door 3 in een 60 mm steriele petrischaal.
- Move de laatste petrischaal onder de stereomicroscoop. Niet onthoofden de embryo's. Met behulp Vannas schaar, accijnzen de hersenen.
- Verwijder en gooi de voorgrond en achterhersenen regio's zorgvuldig. Om de rostrale zijde, gesneden dicht bij de thalamus regio, aan de caudale zijde gesneden op de landengte regio, verwijder de superieure colliculus.
- Zodra de ventrale middenhersenen is geïsoleerd, zorgvuldig hersenvliezen met behulp van ultra fijne pincet te verwijderen. Verzamel de uitgesneden segmenten zonder de hersenvliezen, in een steriele 13 ml buis gevuld met PBS-GAB.
- Het reinigen van de buis met de mesencephala grondig met 70% ethanol en breng het onder de motorkap.
4. Cel Dissociatie
- Was mesencephala 3x met steriel PBS-GAB. Laat hersenen fragmenten te vestigen tussen elke wasbeurt en niet te verstoren het weefsel. Na de laatste wasbeurt, verwijder voorzichtig zoveel oplossing mogelijk en incubeer hersenen segmenten in 3 ml trypsine / EDTA gedurende 15 minuten bij 37 ° C in eenCO 2 incubator.
- Fire-polish het Pasteur pipetten om de overleving van de neuronen als het einde van een niet-gepolijst glas pipet maximaliseren is scherp en kunnen de cellen beschadigen tijdens de stappen dissociatie. Een geringe reductie van de extremiteit diameter (tot 0,5 mm) van het Pasteur pipet, terwijl brand-polijsten.
- Verwijder voorzichtig zoveel trypsine / EDTA-oplossing mogelijk en voeg 10 ml kweekmedium / 10% ifbs. Was de hersenen segmenten 3x met kweekmedium / 10% ifbs.
- Met behulp van de brand gepolijst Pasteur pipet, beginnen dissociatie van mesencephala in 6 ml kweekmedium / 10% ifbs. Vermaal 10x (vermijd luchtbellen), laat de brokken te vestigen, verzamel dan het medium in een nieuwe steriele 13 ml buis.
- Voeg 6 ml kweekmedium, herhaalt u de vorige stap een keer en het verzamelen van het medium met gescheiden cellen in dezelfde 13 ml tube.
- Centrifugeer cellen bij 160 g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in kweekmedium aangevuld met10% hormoonmengsel.
5 Cell Plating
- Tellen cellen in suspensie in een Malassez cel en het volume drager celconcentratie van 600.000 cellen / ml. Ongeveer 1.700.000 cellen kan worden verkregen van de ene muis mesencephalon.
- Verwijder FBS-bevattend medium coating van 24-well platen en voeg in elk putje 1 ml celsuspensie (600.000 cellen / putje, 2-4% van de TH + cellen).
- Incubeer de plaat bij 37 ° C en 5% CO2 / 95% lucht. En geen wijziging noodzakelijk. Dopaminerge neuronen zijn volwassen na ongeveer 5-7 dagen in vitro (consequente uitdrukking van de dopamine transporter). Houd cellen in kweek tot 15 dagen zonder medium vervangen.
6 Immuunfluorescentie Protocol
- Reiniging van de Coverslips
- De dag voor de dissectie, voeg 10 ml van 1 M HCl in een petrischaal. Leg aan het oppervlak van de vloeistof 12-15 dekglaasjes en wacht 15 minuten.
- Zinken de coverglijden in de vloeistof en wacht 15 minuten.
- Verwijder HCl en was 3x met water.
- Snel Was de dekglaasjes met zuivere ethanol keer, voeg dan pure ethanol om de schaal en wacht 30 minuten.
- Onder de motorkap, verwijder gereinigd dekglaasjes van ethanol en voeg 1 dekglaasje per putje van een 12-well celkweek plaat met een gesteriliseerde pincet.
- Wassen dekglaasjes tweemaal met steriel water (1 ml / putje). Daarna was ze een keer met steriel PBS.
- Coating van de dekglaasjes
- Verwijder de PBS en voeg 500 ul / putje van 2x PLO (verdund in PBS). Incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C in de CO2 incubator.
- Verwijder de PLO-oplossing en was 3x met steriele PBS.
- Verwijder PBS en voeg 500 ul / putje van 20% IFB / 1 g / ml laminine. Incubeer overnacht bij 37 ° C in de CO2 incubator.
- Plating de Cellen voor Immuunfluorescentie
- Verwijder coating medium van 12-well platen.
- Voeg 900,000 cellen / putje in 2 ml volume en groeien de cellen bij 37 ° C in de incubator. Cellen kunnen in kweek tot 15 dagen zonder medium vervangen worden gehouden.
- Immunostaining
- Verwijder medium van 12-well platen en wassen met 500 ul / putje DMEM voorverwarmd tot 37 ° C.
- Voeg 500 ul / putje van DMEM voorverwarmd tot 37 ° C, voeg vervolgens voorzichtig 160 ul / putje van 8% paraformaldehyde (PFA, 2% eindconcentratie) en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
- Verwijder PFA en was 3x met PBS / 0,1 M glycine gedurende 10 minuten.
- Verwijder PBS, voeg 300 ul / putje van PBS / 0,05% Triton X-100/20% geit serum en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Verwijder medium, voeg 300 ul / putje primair antilichaam verdund in PBS / 0,05% Triton X-100/1% geit serum en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Primaire antilichamen die gebruikt kunnen worden voor de detectie van dopaminerge neuronen en karakterisering van de cultuur in de tabel Materials. Houd1 goed zonder primaire antilichaam te beoordelen voor de achtergrond van de verschillende secundaire antilichamen.
- Verwijder medium en 3x wassen met PBS / 0,2% gelatine gedurende 10 minuten.
- Verwijder medium, voeg 300 ul / putje tweede antilichaam verdund in PBS / 0,05% Triton X-100/1% geit serum en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. Secundaire antilichamen die zijn aangegeven in de tabel Materials.
- Verwijder medium en 3x wassen met PBS / 0,2% gelatine gedurende 10 minuten.
- Verwijder medium en was 3x met PBS.
- Monteer de dekglaasjes op glasplaatjes cel naar beneden in een druppel Vectashield. Houd de slides bij kamertemperatuur gedurende de nacht het fixeermiddel laten drogen en bewaar ze bij 4 ° C.
- Verwerven van beelden met behulp van een confocale microscoop of een fase-contrast microscoop uitgerust voor epifluorescentie. Representatieve beelden werden verkregen met een Leica SP2 UV confocale microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een geïllustreerde stroomschema van het mesencephalon kweek stappen is weergegeven in figuur 1. Kort na het verzamelen E13.5 embryo van een zwangere Zwitserse muis wordt ventrale mesencephalon ontleed uit het gehele embryo. De geïsoleerde hersenen fragmenten worden achtereenvolgens aan enzymatische vertering en mechanische dissociatie ingediend. Gedissocieerde cellen gepelleteerd door centrifugeren, opnieuw gesuspendeerd in kweekmedium en uitgeplaat in pre-gecoate 12 of 24-well platen. Cellen worden gehandhaafd tot 15 dagen zonder medium vervangen.
Een gedetailleerd stroomschema van de ventrale mesencephalon dissectie, overeenkomend met stap 3.2, wordt weergegeven in figuur 2. Binnen de rode lijnen geven de 3 belangrijkste snijlijnen op een schematische weergave van E13.5 muizenhersenen (aangepast van Prestoz et al. 30) en snijstappen geïllustreerd.
Fasecontrastbeelden van de kweek na 1, 4 en 7 dagen in vitro (DIV) getoond in figuur 3. Neuronen snel ontwikkelen extensies en kiemen (Figuur 3A). Vertakking en vertakkingen zijn meer uitgebreid op DIV4 en DIV7 (Figuren 3B-3C).
Dopaminerge neuronen worden gedetecteerd door immunocytochemie behulp van een anti-TH-antilichaam (Figuur 4A). Het aantal TH + cellen wordt uitgedrukt per 2,5 cm2 dekglaasje (Figuur 4B). We drukken niet het aantal TH + cellen per putje en de dichtheid van de cellen veel hoger op de randen van de beklede plastic en dan op de beklede glazen dekglaasje, dat ligt op het midden van de put. DA neuronen (TH + cellen) vertegenwoordigen 2-4% van de gehele celpopulatie op het dekglaasje. TH-positieve (TH +) cellen blijken al DIV1 en hun aantal neemt snel toe tot een maximum bij DIV6 bereiken.
Het relatieve aandeel van de cellen wordt bepaald door immunofluorescentie etikettering van DA cellen with een anti-DAT antilichaam (figuur 5A) of een anti-TH-antilichaam (figuur 5B) en gelijktijdige kleuring van neuronale cellen met anti-MAP2 antilichaam. Representatieve immunokleuring van verschillende neuronale populaties in de kweek is ook getoond in figuur 5. GABAerge neuronen gekleurd met een anti-GAD67 antilichaam (figuur 5C) en vertegenwoordigen ongeveer 50% van de cellen. Serotonerge neuronen worden gedetecteerd met een anti-serotonine-antilichaam (Figuur 5D) en minder dan 1% van de cellen in de kweek. De mesencephalon celkweek bevat ook glutamaterge neuronen (40% van de kweek), cholinerge neuronen en gliale zeldzame cellen (ongeveer 2-3%). Aandeel van de van gliacellen wordt bepaald met behulp van gliale fibrillaire zure eiwit (GFAP) kleuring (figuur 5E). Ondubbelzinnige identificatie van mesencephalon dopaminerge neuronen kunnen ook worden bereikt met behulp van specifieke merkers zoals Pitx3 of FOXA2 31,32.
Hogere vergroting immunokleuring van verschillende neuronale populaties in de kweek is getoond in figuur 6. Dopaminerge neuronen gedetecteerd met een anti-DAT antilichaam (Figuur 6A). DAT vlekken weerspiegelt DA neuron rijping staat. DAT expressie begint bij DIV3-4. GABAerge neuronen en serotonerge neuronen gekleurd met een anti-GAD67 antilichaam (Figuur 6B) of een anti-serotonine-antilichaam (Figuur 6C), respectievelijk.
Figuur 1 Geïllustreerde stroomschema van het mesencephalon cultuur. Belangrijkste stappen cultuur worden aangegeven. (A) Offer een zwangere Zwitserse muis, verzamel E13.5 embryo's in petrischaaltjes en was ze door opeenvolgende PBS baden. (BC) Onder dissectie microscoop, dissect ventrale mesencephalon van de hele embryo en plaats ze in een rol. (D) Add trypsine-EDTA op de hersenen uitgesneden fragmenten en verteren bij 37 ° C gedurende 15 minuten. (E) verwijderen trypsine, commentaar serum-bevattend kweekmedium en voer mechanische cel dissociatie (10 wrijven bewegingen, tweemaal herhaald). (F) Pellet de cel, mengen ze in serum-vrij medium aangevuld met hormonen en plaat ze in voorgelakt 12 of 24-well platen. Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.
Figuur 2 Gedetailleerde stroomschema van het mesencephalon dissectie. Hoofd dissectie stappen worden aangegeven. (A) Muis embryo in E13.5 na reUitbouwen van de baarmoeder horens. (B) Zonder onthoofding het embryo, accijnzen de hersenen. (C) Schematische weergave van de embryonale hersenen van muizen op E13.5. Rode gestippelde lijnen geven aan waar de hersenen moeten worden gesneden om ventrale mesencephalon isoleren (R, rostral gesneden; C, caudale gesneden; D, dorsale cut). De Cephalic blaasjes telencephalon, diencephalon, mesencephalon en rhombencephalon worden afgebakend in blauw, paars, roze en grijs, respectievelijk. Aq, aquaduct; Hypoth, hypothalamus; LGE, laterale ganglion eminentie; LV, laterale ventrikel; MFB, mediale voorhersenbundel; MGE, mediale ganglion eminentie; sc, superieure colliculus; Thal, thalamus; VM, ventrale mesencephalon; 4V, vierde ventrikel (naar 30). (D) snijden lijnen aangeduid door rode stippellijnen op E13.5 muizenhersenen. (E) muizenhersenen na verwijdering van de voorgrond en achterhersenen regio (dus na Uiterste R). (F) muizenhersenen na verwijdering van de superior colliculus (dwz na bezuinigingen R en D). (G) Ventral weergave van een geïsoleerde mesencephalon (dwz na snijdt R, C, D). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3 Fase contrast beelden van de kweek in verschillende stadia van ontwikkeling. (A) DIV1, (B) DIV4, en (C) DIV7 beelden van dezelfde cultuur zijn vertegenwoordigd. Beelden werden verworven op levende cellen met een omgekeerde microscoop. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4 Tyrosine hydroxylase kleuring van dopaminerge neuronen. (A) Voor DIV8, DA neuronen werden gedetecteerd met behulp van anti-TH antilichaam. Openbaring werd uitgevoerd met een 3,3 '-diaminobenzidine (DAB) kit. Het beeld werd verworven met een omgekeerde microscoop. (B) Aantal TH + neuronen in mesencephalon culturen als functie van de leeftijd van de cultuur. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5 representatief deel van neuronen en astrocyten in de kweek. Bij DIV4, DA neuronen (in magenta) werden gedetecteerd met behulp van anti-DAT (A) of anti-TH-antilichaam (B) en GABA-erge neuronen, serotonerge neuronen en astrocyten (in magenta) werden gedetecteerd met behulp van anti-GAD67 (C), anti-serotonine (D) en anti-GFAP (E) antilichamen, respectievelijk. Neuronale cellen (Cyaan) werden gekleurd met anti-MAP2 antilichaam (AE). Beelden werden verworven met een omgekeerde microscoop. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6 Representatieve kleuring van verschillende celpopulaties van het mesencephalon cultuur. (A) dopaminerge neuronen gedetecteerd door DAT-vlekken op div9 (in het rood). (B) GABAergic neuronen gevisualiseerd door GAD-67 vlekken op div9 (in het groen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol geeft de procedures en reagentia die nodig zijn om een primaire kweek van mesencefale neuronen Uitgaande van de embryonale muis en immunofluorescentie procedure dopaminerge neuronen detecteren. Kritische stappen van de procedure zijn de dissectie van de embryo's en de mechanische dissociatie van de verzamelde hersenen fragmenten. Hoge kwaliteit dissectie instrumenten helpt om de dissectie techniek onder de knie. DA neuronen vormen een klein deel van mesencephalon. Dienovereenkomstig verzamelt het rechterdeel van de ventrale mesencephalon is essentieel voor een cultuur die 2-4% van DA neuronen bevat verkrijgen. Mechanische dissociatie moet zorgvuldig en voorzichtig worden uitgevoerd. Als de kweek bevat clusters van niet gedissocieerde neuronen, voeg een of twee tritureren stappen.
Dit protocol maakt gebruik van serumvrij medium voor neuron cultuur. Echter, coaten met serum moet hechting van de cellen te verbeteren. Hormoon mix, die de ser vervangtum, wordt gedefinieerd neuron groei mogelijk te maken en gliacellen overleving en proliferatie minimaliseren. Dientengevolge niet-neuronale cellen vertegenwoordigen ongeveer 2-3% van de kweek (kwantificering middels GFAP-kleuring). Alternatief kan het kweken worden gekweekt in aanwezigheid van serum met de toevoeging van twee dagen na zaaien, of cytosine-β-D-arabinofuranoside (ara-C, 5-8 uM) om de proliferatie van gliacellen 26 onderdrukken. Een ander alternatief voor het hormoon mix is het gebruik van gedefinieerde media en supplementen 29.
Deze techniek is geschikt voor immunofluorescentie kleuring, kwantitatieve PCR, tweede messenger kwantificering en verschillende soorten toxicologie / survival schermen voeren. Het moet ook mogelijk zijn om elektrofysiologische studies uit te voeren op deze voorbereidingen 33,34. Deze culturen kunnen pre-kandidaat neuroprotectieve moleculen te identificeren en te helpen bij het DA neuronen eigenschappen karakteriseren, terwijl het minimaliseren van het aantal gebruikte dieren. Echter, final bevestiging met behulp van in vivo modellen wordt aangevraagd, als gekweekte neuronen niet de input van andere gebieden van de hersenen, die sterk van invloed kunnen hun rijping te ontvangen.
Deze techniek wordt niet veel gebruikt, tegenover cultuur ratmodellen, ondanks de eerste beschrijvingen begin jaren tachtig 16,17. Het gebrek afbeeldingen presenteren de delicate dissectie kunnen onderzoekers beperken deze muis cultuurmodel ontwikkeld. Vanwege de vorming van talrijke transgene muismodellen van neurodegeneratieve aandoeningen 25 specifieke genen ongeldig of etikettering van specifieke neuron, DA neuron culturen van muis nu van groot belang.
Mastering deze techniek kan de studie van DA neuronen geïsoleerd uit elk type transgene muis en de verstoring veroorzaakt door genetische modificatie staand. Bovendien kunnen deze culturen gebruikt als referentiemodellen worden vergeleken met DA neuronen afkomstig uit muizen stamcellen 35 of van geïnduceerde pluripotente stamcellen 36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-Glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1 M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water - Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1,000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1,000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
References
- Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
- Iversen, S. D., Iversen, L. L.
- Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
- Chinta, S. J., Andersen, J. K.
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
- Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R.
- Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
- Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
- Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
- Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
- Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
- Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. erkerian- Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
- Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S.
- di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
- Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
- Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
- Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
- Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
- Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
- Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
- Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
- Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
- Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
- Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
- Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
- Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
- Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
- Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
- Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
- Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
- Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
- Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).
