Abstract
Дофаминергических нейронов составляют менее 1% от общего количества нейронов в головном мозге. Это низкое количество нейронов регулирует важные функции мозга, такие как управление двигателем, мотивации и рабочей памяти. Нигростриатальных нейроны допаминергические выборочно вырождаются при болезни Паркинсона (PD). Эта прогрессивная потеря нейронов однозначно связаны с моторами симптомов патологии (брадикинезию, отдыхая тремор, и мышечная ригидность). Основной агент отвечает дофаминергической дегенерации нейронов до сих пор неизвестно. Тем не менее, эти нейроны, как представляется, чрезвычайно уязвимы в различных условиях. Первичные культуры представляют собой один из наиболее важных моделей для исследования свойств и характеристик дофаминергических нейронов. Эти культуры могут быть представлены в различных стрессовых агентов, которые имитируют PD патологии и нейропротекторами для того, чтобы остановить или замедлить дегенерации нейронов. Многочисленные трансгенные мышиные модели из PD, которые были Generованные в течение последнего десятилетия еще больше увеличило интерес исследователей для дофаминергических нейронов культур. Вот, протокол видео фокусируется на важных рассечения эмбриональных мозга мышей. Точное удаление вентральной среднего мозга имеет решающее значение для получения культур нейронов достаточно богатые дофаминергических клеток, чтобы позволить последующие исследования. Этот протокол может быть реализован с эмбриональными трансгенных мышей и подходит для иммунофлуоресцентного окрашивания, количественной ПЦР, второй мессенджер количественной оценки, или гибель нейронов / выживания.
Introduction
Допамин, одним из важнейших нейротрансмиттеров мозга 1,2, в основном освобожден от дофаминергических нейронов среднего мозга (DA). Большинство нейронов да находиться в вентральной части среднего мозга 2-6. Схематически среднего мозга нейроны DA можно разделить на три анатомически и функционально различных проекционных систем: mesostriatal, мезолимбической и мезокортикальных пути 2,5. Нигростриатной путь участвует в поведении двигателя, мезолимбическом пути играют важную роль в армирования, мотивации, обучения и, в то время как дофаминергические пути выступающие в префронтальной коры головного мозга вовлечены в познании 2.
DA нейроны участвуют в нескольких неврологических расстройств человека, таких как шизофрения, синдром дефицита внимания, гипер расстройство деятельности, и болезнь Паркинсона (БП) 2,4. PD характеризуется прогрессивным и селективной дегенерации нейронов да соединяющей черной субстанцииPars компакты (SNC) в стриатуме. Потеря Nigro-полосатой да нейронов приводит к серьезному истощению дофамина в полосатом теле, который отвечает из двигательных симптомов БП (брадикинезия, опираясь тремор, и жесткость) 7. Начальное причиной идиопатической БП не было установлено, и в настоящее время лечение только симптоматическое, направленный на восстановление уровня допамина в полосатом теле. Наиболее предписано препарат L-ДОФА (леводопа), естественный предшественник дофамина. Хотя администрация леводопа компенсирует потерю допамина в течение определенного времени, осложнения моторные произойти после длительного лечения (дискинезия и включение / выключение состояния) 8,9.
Исследование дофаминергических нейронов и PD находится в постоянном прогрессии и интенсивные усилия к тому, чтобы развивать процедуры, основанные на трансплантации клеток, генной терапии, или нейропротекторы 10,11. Тем не менее, главной проблемой остается не-выяснено: то, что является причиной крайнего vulnerability из DA нейронов? Часть ответа можно найти в деятельности DA нейронов. Снижение электрической активности и возбудимости нейронов DA-видимому, чтобы увеличить их склонность к вырождению 12. Тем не менее, сложность PD патогенезе требует дальнейших исследований, чтобы определить механизмы, участвующие в DA нейроны дегенерации 13-15.
Первичные культуры особенно актуальны для изучения DA нейронов свойства 16-19 и оспорить эти нейроны в различных напряжений для оценки нейропротекторы 20-24. Модели крысы культуры чаще всего используются, как рассечение эмбриона крысы среднего мозга легче, по сравнению с мышью, и более высокие количества нейронов может быть получена на крысах. Однако поколение трансгенных мышиных моделях болезни 25 значительно возросла заинтересованность невролога сообщества для первичных культур от мыши 26-29. Хотя культур прepared от новорожденных животных можно использовать, лучше подготовить их из эмбрионов на пост-митотического этапе (E13.5 для среднего мозга нейронов), когда нейроны сохранили способности к дифференциации. Следующий протокол представляет изолированные среднего мозга нейроны в первичной культуре от эмбрионов мыши (E13.5), которые наиболее трудно получить. Примечательно, мы предоставляем протокол, используя бессывороточной культуральной среды для лучшего воспроизводимости. Два наиболее важных шагов в подготовке культуры (рассечение и механической диссоциации) будет тщательно описано в соответствующей видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мыши, используемые в этой работе были заботятся и обрабатываются в соответствии с руководящими принципами Совета Европейского союза (86/609 / ЕС) для использования лабораторных животных.
1 Получение нужных решений
- Биржевые Решения
- 10x поли-L-орнитин (ООП) Решение: отвесить 10 мг гидробромида ООП (молекулярная масса = 30,000-70,000) и растворяют в 70 мл стерильной воды. Фильтр решение, используя 0,2 мкм шприцевой фильтр кратный, и хранить при температуре -20 ° C.
- 30% раствора глюкозы: отвесить 30 г D (+) - Глюкоза и растворить в стерильной водой до общего объема 100 мл. Фильтр, аликвоту, и хранят при температуре 4 ° С.
- Модифицированной среде Дульбекко 5x Игла (DMEM) / питательной смеси F-12 Ham: отвесить 6 г DMEM / F-12 Ham порошка и растворить в стерильной водой до общего объема 100 мл. Фильтр, аликвоту, и хранят при температуре 4 ° С.
- 7,5% бикарбонат натрия (NaHCO 3) Solutiна: взвесить 7,5 г NaHCO 3 и растворить в стерильной водой до общего объема 100 мл. Фильтр, аликвоту, и хранят при температуре 4 ° С.
- 1 М HEPES Решение: Взвесить 23,8 г HEPES и растворить в стерильной водой до общего объема 100 мл. Фильтр, аликвоту, и хранят при температуре 4 ° С.
- 70% (об / об) этанола: Развести 70 мл абсолютного этанола с 30 мл стерильной воды.
- Забуференный фосфатом физиологический раствор с глюкозой и антибиотики (PBS-GAB): добавляют 10 мл 30% раствора глюкозы и 5 мл пенициллина-стрептомицина раствора до 500 мл Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором. Хранить при 4 ° С.
- Инактивированной фетальной бычьей сыворотки (IFBS): Оттепель бычьей сыворотки в течение ночи при 4 ° С и инактивируют при 56 ° С в течение 30 мин. Алиготе в 50 мл и хранят при температуре -20 ° C.
- Культуральная среда: в стерильной воде, смешать последовательно 40 мл 5-кратным DMEM / Ham F12-1 мл 1 М HEPES, 2 мл 200 мМ L-глутамина, 2 мл пенициллина-стрептомицина, 4 мл 30% глюкозый 3 мл 7,5% NaHCO 3 до конечного объема 180 мл. Фильтр и использовать в тот же день.
- Гормон Mix
- Приготовьте 180 мл культуральной среды. Растворить 200 мг апо-трансферрина в этой среде.
- Взвесить 50 мг инсулина и растворяют в 2 мл 0,1 М HCl. Добавить медленно 8 мл стерильной воды при перемешивании осторожно. Развести это решение в культуральной среде.
- Взвесить 19,3 мг дигидрохлорида путресцина и растворяют в 10 мл стерильной воды. Добавить раствор 10 мл в смесь гормона.
- Подготовка 3 мМ раствор селенита натрия в стерильной воде и 2 мМ раствор прогестерона в абсолютном этаноле. Добавить 20 мкл каждого раствора в смесь гормонов.
- Фильтр смесь гормона, Алиготе в 10 мл и хранить при температуре -20 ° C.
2 Получение культуры пластин и инструменты
- FBS Покрытие из пластин культуры: За день до вскрытия, подготовки 180 мл культуральной среды. Добавьте 10 млIFBS в 90 мл культуральной среды. Добавить 300 мкл / лунку культуральной среды / 10% IFBS минуте поли-D-лизина вклеивания 24-луночных планшетах. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С. Хранить оставшиеся носители (с и без IFBS) при 4 ° С.
- Стерилизовать инструменты и пипетки Пастера. Соберите оборудование, указанное в материалах таблицы, а также класса II ламинаре и CO 2 инкубаторе.
3 Рассечение Mouse среднего мозга
- Жертвоприношение в E13.5 беременную мышь (в соответствии с ведомственным руководящим принципам). Очистите живот мыши с 70% этанола и открыть брюшную стенку. Соберите рога матки, открыть их с помощью деликатных ножницы, препарировать каждый эмбрион от рогов матки, и удалить амниотической мембраны. Поместите эмбрионов в 100 мм чашки Петри, содержащей стерильную ПБС-ГСЗ и мыть их переводом в 3 последовательных идентичных ванн с помощью щипцов. Для вскрытия, разместить эмбрионов на 3 в 60 мм стерильную чашку Петри.
- Movэлектронной окончательный чашку Петри под стереомикроскопом. Не обезглавить эмбрионов. Использование Vannas ножницы, вырезать мозги.
- Осторожно снимите и выбросьте передних и заднего мозга регионы. Для ростральной стороны, срезаны близко к таламуса области, до хвостового срезом на области перешейка, снимите верхний бугорок.
- После того, как брюшной средний мозг изолирован, тщательно удалить мозговые оболочки, используя ультра тонкий пинцет. Сбор рассеченные сегменты, без мозговых оболочек, в стерильную пробирку, заполненную 13 мл с PBS-GAB.
- Очистите трубку, содержащий mesencephala тщательно с 70% этанола и привести его под капотом.
4 диссоциации клеток
- Вымойте mesencephala 3x стерильной PBS-ГСЗ. Разрешить фрагменты мозга урегулировать между каждой стирки и избежать нарушения ткани. После последней промывки удалить как можно больше тщательно раствор, насколько это возможно, и инкубировать сегментов головного мозга в 3 мл трипсина / EDTA в течение 15 мин при 37 ° С вСО 2 инкубатора.
- Fire-польский Пастера пипетки, чтобы максимизировать выживание нейронов, как в конце не-полированного стекла пипетки остро и может привести к повреждению клеток во время стадий диссоциации. Слегка уменьшить диаметр верхней его части (до 0,5 мм) из пипетки Пастера в то время пожара полировки его.
- Осторожно снимите столько трипсин / ЭДТА решение как можно и добавить 10 мл культуральной среды / 10% IFBS. Вымойте сегменты мозга 3x с культурой средних / 10% IFBS.
- Использование огневой полировкой пипетки Пастера, начинают диссоциации mesencephala в 6 мл культуральной среды / 10% IFBS. Triturate 10x (избежать воздушных пузырей), позволяют куски урегулировать, то собрать среду в новой стерильной 13 мл трубки.
- Добавить 6 мл культуральной среды, повторите предыдущий шаг раз и собрать средства, содержащие разложенных клетки в той же пробирке 13 мл.
- Центрифуга клетки при 160 г в течение 5 мин. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в культуральной среде, содержащей10% гормона микс.
5 Сотовый Покрытие
- Граф клеток в суспензии в ячейку Malassez и регулировки громкости среде до концентрации 600000 клеток / мл. Около 1700000 клетки могут быть получены из одной мыши среднего мозга.
- Удалить ФБС, содержащего покрытия среды из 24-луночных планшетах и добавить в каждую лунку 1 мл клеточной суспензии (600000 клеток / лунку, 2-4% от Th + клеток).
- Инкубируйте планшет при 37 ° С и 5% СО 2/95% воздуха. Нет среднего изменения не являются необходимыми. Дофаминергических нейронов являются зрелыми примерно через 5-7 дней в пробирке (последовательное выражение переносчика дофамина). Держите клеток в культуре до 15 дней без среднего замены.
6 Иммунофлуоресцентное протокол
- Очистка покровные
- За день до вскрытия, добавляют 10 мл 1 М HCl в чашку Петри. Lay на поверхности жидкости покровные стекла 12-15 и ждать 15 мин.
- Раковина крышкупроскользнуть в жидкости и ждать в течение 15 мин.
- Удалить HCl и промыть 3 раза водой.
- Промыть покровные быстро с чистым этанолом один раз, а затем добавить чистый этанол на блюдо и ждать в течение 30 мин.
- Под капотом, удалить очищенные покровные из этанола и добавьте 1 покровное на лунку для культивирования клеток пластины 12-скважины с использованием стерилизованные щипцы.
- Промывочный покровные два раза стерильной водой (1 мл / лунку). Тогда, мыть их раз стерильным PBS.
- Покрытие покровные
- Удалить PBS и добавляют 500 мкл / лунку 2 раза ООП (разбавленный в PBS). Инкубировать в течение 4 ч при 37 ° С в СО 2-инкубаторе.
- Снимите решение ООП и промыть 3 раза стерильной PBS.
- Удалить PBS и добавить 500 мкл / лунку 20% IFBS / 1 г / мл ЛАМИНИНА. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С в СО 2-инкубаторе.
- Покрытие клетки для иммунофлуоресценции
- Удалить покрытия среды из 12-луночных планшетах.
- Добавить 900,000 клеток / лунку в объеме 2 мл и роста клеток при 37 ° С в инкубаторе. Клетки могут быть сохранены в культуре до 15 дней без среднего замены.
- Иммуноокрашивание
- Удалить среды из 12-луночных планшетах и промывают 500 мкл / лунку DMEM, предварительно нагретую при 37 ° С.
- Добавить 500 мкл / лунку DMEM предварительно нагревают при 37 ° С, а затем осторожно добавляют 160 мкл / лунку 8% параформальдегида (PFA, 2% конечная концентрация) и инкубируют в течение 10 мин при 37 ° С.
- Удалить PFA и промыть 3 раза с PBS / 0,1 М глицина в течение 10 мин.
- Удалить PBS, добавляют 300 мкл / лунку PBS / 0,05% Тритона Х-100/20% козьей сывороткой и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Удалить среды, добавляют 300 мкл / лунку первичного антитела разводили в PBS / 0,05% Тритона Х-100/1% козья сыворотка и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. Первичные антитела, которые можно использовать для выявления дофаминергических нейронов и характеристик культуры, указаны в таблице материалов. Держите1 и без первичного антитела на предмет фоне различных вторичных антител.
- Удалить среды и промыть 3 раза с PBS / 0,2% желатина в течение 10 мин.
- Удалить среды, добавляют 300 мкл / лунку вторичное антитело разводили в PBS / 0,05% Тритона Х-100/1% козья сыворотка и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре, в темноте. Вторичные антитела, используемые указаны в таблице материалов.
- Удалить среды и промыть 3 раза с PBS / 0,2% желатина в течение 10 мин.
- Удалить среднего и промыть 3 раза с PBS.
- Установите покровные на стороне стекла горки клеток вниз в капле Vectashield. Держите слайды при комнатной температуре в течение ночи, чтобы монтажную полусухое, хранить их при температуре 4 ° С.
- Получение изображений с помощью конфокальной микроскопии или фаза-контрастного микроскопа оборудованная для эпифлуоресцентной. Типичные изображения были приобретены с конфокальной микроскопии Leica SP2 УФ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Показано блок-схема последовательности этапов культуры среднего мозга показана на рисунке 1. Вкратце, после сбора эмбрионов E13.5 от беременной швейцарской мыши, вентральной среднего мозга иссекают из всего эмбриона. Выделенные фрагменты мозга последовательно представлены ферментативного расщепления и механической диссоциации. Диссоциированные клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в культуральной среде и высевали в предварительно покрытых пластин 12 или 24-луночных. Клетки поддерживают до 15 дней без среднего замены.
Детальный алгоритм брюшной средний мозг вскрытия, соответствующего этапу 3,2, показан на рисунке 2. Красной пунктирной линии показывают 3 основных линии резки на схематического изображения E13.5 мозга мыши (взято из Prestoz соавт. 30) и Режущие шаги показаны.
Фаза контрастные изображения культуре после 1, 4, и 7 дней в витро (DIV), показаны на рисунке 3. Нейроны быстро разрабатывать расширения и прорастания (3А). Ветвей и последствия более расширен в DIV4 и div7 (Цифры 3B-3C).
Дофаминергических нейронов обнаруживаются с использованием анти-антитела (TH Фигура 4А) с помощью иммуногистохимии. Количество TH + клеток выражается в 2,5 см 2 покровного (Рисунок 4B). Мы не выражаем количество TH + клеток на лунку, как плотность клеток значительно выше на границах пластика с покрытием хорошо, чем на покрытой покровного стекла, что находится в центре на хорошо. DA нейроны (TH +-клетки) представляют 2-4% всей популяции клеток на покровное. TH-позитивных клеток (TH +) появляются уже в Div1 и их число быстро увеличивается, чтобы достичь максимума при DIV6.
Относительная доля клеток оценивается иммунофлуоресцентньш маркировки Д.А. клеток остроумияч антитела анти-DAT (5А) или анти-TH антитела (5В) и сопутствующее окрашивание нервных клеток с анти-MAP2 антитела. Представитель иммунное окрашивание из нескольких нейрональных популяций, присутствующих в культуре также показано на рисунке 5. ГАМКергических нейронов окрашивали с использованием антител анти-GAD67 (5С) и составляют около 50% клеток. Серотонинергической нейроны обнаруживаются с анти-антителом серотонина (рисунок 5D) и составляют менее 1% клеток в культуре. Культура среднего мозга клеток также содержит глутаматергические нейронов (40% от культуры), холинергические нейроны, и редкие глиальные клетки (около 2-3%). Доля глиальных клеток определяют с помощью глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) окрашивание (Рисунок 5E). Однозначной идентификации дофаминергических нейронов среднего мозга также может быть достигнуто с использованием специфических маркеров, таких как Pitx3 или Foxa2 31,32.
Более высокое увеличение иммунное окрашивание из нескольких нейрональных популяций, присутствующих в культуре показано на рисунке 6. Дофаминергических нейронов обнаруживаются с использованием антитела анти-DAT (фиг.6А). Окрашивание DAT отражает DA нейрон созревания состояние. DAT выражение начинается в DIV3-4. ГАМКергических нейронов и серотонинергические нейроны окрашивали с использованием антител анти-GAD67 (фиг.6В) или анти-серотонин антитела (фиг.6С), соответственно.
Рис.1 Иллюстрированный блок-схема средний мозг культуры. Основные этапы культуры указаны. () Жертвоприношение беременную швейцарский мышь, собирать эмбрионов E13.5 в чашках Петри и мыть их последовательными ванн PBS. (BC) Под микроскопом рассечение, дissect вентральной среднего мозга от всего эмбрионов и поместите их в пробирку. (D) Добавить трипсин-ЭДТА с рассеченных фрагментов мозга и переварить при 37 ° С в течение 15 мин. (E) Удалить трипсин, добавить сыворотку, содержащую культуральную среду-и выполнить механическая диссоциация клеток (10 движения растирания, повторяется дважды). (F) Гранул ячейку, ресуспендируйте их в среде без сыворотки с добавлением гормонов и пластины их в предварительно покрытых 12-ти или 24-луночных планшетах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию из этой фигуры.
Рисунок 2 детальную блок-схему среднего мозга вскрытия. Основные этапы рассечение указаны. (А) мышиного эмбриона на E13.5 после повторногоMOVAL от рогов матки. (B) Без обезглавливание эмбрион, вырезать мозг. (C) Схематическое представление эмбрионального мозга мыши на E13.5. Красный пунктирная линии показывают, где мозг должны быть сокращены, чтобы изолировать вентральной среднего мозга (R, ростральную разрез; C, хвостовой вырезано; D, вырезать спинной). Головные везикулы конечный мозг, промежуточный мозг, средний мозг, и ромбовидный мозг разделены в синий, фиолетовый, розовый, и серый, соответственно. Ак, водопровод; Hypoth, гипоталамус; LGE, боковая ганглионарный возвышение; LV, бокового желудочка; MFB, медиальная переднего мозга пучок; MGE, медиальная ганглионарный возвышение; подкожно, двухолмия; Таль, таламус; В.М., вентральный средний мозг; 4В, четвертый желудочек (взято из 30). (D) резки линии обозначаются красными пунктирными линиями на мозге E13.5 мыши. (E) Мышь мозга после удаления передних и заднего мозга регионах (т.е. после разреза R). (F) мозга мыши после удаления SUPerior бугорок (то есть после сокращения R и D). (G) Брюшной вид изолированной среднего мозга (то есть после режет R, C, D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3 Фаза контрастные изображения культуре на разных этапах развития. (А) Div1, (В) DIV4, и (с) div7 изображения той же самой культуры показаны. Изображения были получены на живые клетки с помощью инвертированного микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4 Тирозингидроксилаза окрашивание дофаминергических нейронов. () В div8, DA нейроны были обнаружены с помощью анти-TH антитела. Откр проводили с использованием 3,3 '-диаминобензидина (DAB) комплект. Снимок был получен с помощью инвертированного микроскопа. (B) Количество Th + нейронов в среднего мозга культур в зависимости от возраста культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5 Представитель часть нейронов и астроцитов в культуре. В DIV4, DA нейроны (в пурпурный) были обнаружены с использованием анти-DAT (А) или анти-TH антитела (B) и ГАМКергические нейроны, серотонинергические нейроны и астроциты (в пурпурный) были обнаружены с помощью анти-GAD67 (С), анти-серотонин (D), и анти-GFAP (E) антител, соответственно. Нервные клетки (в голубой) окрашивали анти-MAP2 антитела (AE). Изображения были получены с помощью инвертированного микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Представитель окрашивание нескольких клеточных популяций среднего мозга культуры. () Дофаминергический нейрон обнаружены окрашиванием DAT в DIV9 (в красном). (B) ГАМКергические нейроны, визуализированные ГТР-67 окрашивания в DIV9 (зеленым).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол представляет процедуры и реагенты, необходимые для получения первичной культуры нейронов среднего мозга от эмбриональной мыши и процедуры иммунофлюоресценции для выявления дофаминергических нейронов. Критические этапы процедуры являются рассечение эмбрионов и механическая диссоциация собранных фрагментов мозга. Высокие рассечение инструменты качества помогает освоить технику вскрытия. DA нейроны составляют небольшую долю среднего мозга. Соответственно, сбор правую часть брюшной среднего мозга имеет важное значение для получения культуры, которые содержат 2-4% DA нейронов. Механическая диссоциации должна быть выполнена тщательно и аккуратно. Если культура содержит кластеры недиссоциированного нейронов, добавить еще один или два шага растирания.
Этот протокол использует бессывороточной среды для культуры нейронов. Тем не менее, покрытие с сывороткой необходимо, чтобы добавлять прикрепление клеток. Гормон микс, который заменяет сергм, определяется, чтобы рост нейронов и свести к минимуму глиальных клеток выживания и распространения. Следовательно, не-нервных клеток составляют около 2-3% от культуры (количественное используя GFAP-окрашивания). С другой стороны, культуры могут быть выращены в присутствии сыворотки, с добавлением, две дней после посева, цитозина-β-D-арабинофуранозида (Ara-C, 5-8 мкМ), чтобы подавить пролиферацию клеток глии 26. Другой альтернативой смеси гормона является использование определенных средств массовой информации и добавки 29.
Эта техника подходит для выполнения иммунофлюоресценции окрашивание, количественный ПЦР, вторичного мессенджера количественной оценки и различные типы экранов токсикология / выживания. Оно также должно быть возможным проведение электрофизиологических исследований на этих препаратов 33,34. Эти культуры можно выделить предварительных кандидатур нейропротекторное молекулы и помочь характеризовать свойства нейронов DA, при сведении к минимуму количества животных, используемых. Тем не менее, фантастическиенал подтверждения использования в моделях естественных условиях требуется, как культивированный нейроны не получать материалы от других областей мозга, которые могут сильно повлиять на их созревание.
Эта техника широко не используется, по сравнению с моделями крыса культуры, несмотря на его первых описаний в начале восьмидесятых 16,17. Отсутствие изображений, представляющих нежную рассечение может сдерживать исследователей развивать эту модель культуры мыши. Тем не менее, за счет генерации многочисленных трансгенных мышиных моделях нейродегенеративных расстройств 25 с конкретной недействительными гена или маркировки определенных типов нейронов, DA нейронов культур от мыши в настоящее время большой интерес.
Освоение этой техники позволяет изучение DA нейронов, выделенных из различных типов трансгенной мыши и исследовать возмущение, вызванное генной модификации. Кроме того, эти культуры могут быть использованы в качестве эталонные модели в сравнении с DA нейронов, полученных из стебля мышиклетки 35 или от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток 36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-Glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1 M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water - Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1,000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1,000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
References
- Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
- Iversen, S. D., Iversen, L. L.
- Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
- Chinta, S. J., Andersen, J. K.
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
- Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R.
- Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
- Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
- Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
- Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
- Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
- Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. erkerian- Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
- Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S.
- di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
- Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
- Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
- Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
- Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
- Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
- Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
- Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
- Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
- Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
- Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
- Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
- Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
- Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
- Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
- Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
- Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
- Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
- Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).
