Abstract
डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स दिमाग में न्यूरॉन्स की कुल संख्या का कम से कम 1% का प्रतिनिधित्व करते हैं. न्यूरॉन्स की यह कम राशि ऐसी मोटर नियंत्रण, प्रेरणा, और काम स्मृति के रूप में महत्वपूर्ण मस्तिष्क कार्यों को नियंत्रित करता है. Nigrostriatal डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स चुनिंदा पार्किंसंस रोग (पीडी) में पतित. यह प्रगतिशील neuronal नुकसान स्पष्ट विकृति की मोटरों लक्षण (bradykinesia, आराम कंपन, और मांसपेशियों कठोरता) के साथ जुड़ा हुआ है. डोपामिनर्जिक न्यूरॉन अध: पतन के जिम्मेदार मुख्य एजेंट अभी भी अज्ञात है. हालांकि, इन न्यूरॉन्स विविध स्थितियों में बेहद कमजोर दिखाई देते हैं. प्राथमिक संस्कृतियों के गुण और डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की विशेषताओं की जांच करने के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक मॉडलों में से एक का गठन. इन संस्कृतियों को रोकने या neuronal अध: पतन को धीमा करने के क्रम में पीडी पैथोलॉजी कि नकल विभिन्न तनाव एजेंटों के लिए और न्यूरोप्रोटेक्टिव यौगिकों को प्रस्तुत किया जा सकता है. gener किया गया है कि पीडी के कई ट्रांसजेनिक माउस मॉडलपिछले दशक के दौरान पैदा आगे डोपामिनर्जिक न्यूरॉन संस्कृतियों के लिए शोधकर्ताओं के हित में वृद्धि हुई. इधर, वीडियो प्रोटोकॉल भ्रूण माउस दिमाग की नाजुक विच्छेदन पर केंद्रित है. उदर mesencephalon की सटीक छांटना बाद के अध्ययन की अनुमति के लिए डोपामिनर्जिक कोशिकाओं में पर्याप्त समृद्ध neuronal संस्कृतियों प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रोटोकॉल भ्रूण ट्रांसजेनिक चूहों के साथ एहसास हुआ और immunofluorescence धुंधला, मात्रात्मक पीसीआर, दूसरा दूत मात्रा का ठहराव, या neuronal मौत / अस्तित्व मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है किया जा सकता है.
Introduction
डोपामाइन, आवश्यक मस्तिष्क न्यूरोट्रांसमीटर 1,2 में से एक, मुख्य रूप से मध्यमस्तिष्क डोपामिनर्जिक (डीए) न्यूरॉन्स द्वारा जारी की है. डीए न्यूरॉन्स के बहुमत mesencephalon 2-6 के उदर भाग में रहते हैं. Mesostriatal, mesolimbic, और mesocortical रास्ते 2,5: रेखाचित्र, मध्यमस्तिष्क डीए न्यूरॉन्स anatomically और कार्यात्मक तीन में अलग प्रक्षेपण प्रणाली विभाजित किया जा सकता है. प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स को पेश डोपामिनर्जिक रास्ते अनुभूति 2 में फंसा रहे हैं जबकि nigrostriatal मार्ग, mesolimbic रास्ते सुदृढीकरण, प्रेरणा, और सीखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, मोटर व्यवहार में शामिल है.
डीए न्यूरॉन्स एक प्रकार का पागलपन, ध्यान की कमी, अति गतिविधि विकार, और पार्किंसंस रोग (पीडी) 2,4 के रूप में कई मानव मस्तिष्क संबंधी बीमारियों में शामिल हैं. पीडी द्रव्य नाइग्रा जोड़ने डीए न्यूरॉन्स की एक प्रगतिशील और चयनात्मक अध: पतन की विशेषता हैस्ट्रिएटम को Pars COMPACTA (एसएनसी). पीडी की मोटर लक्षणों की जिम्मेदार है कि स्ट्रिएटम में गंभीर डोपामाइन रिक्तीकरण में NIGRO-striatal डीए न्यूरॉन्स परिणाम का अंत (bradykinesia, आराम कंपन, और कठोरता) 7. अज्ञातहेतुक पीडी के प्रारंभिक कारण स्थापित नहीं किया गया है और वर्तमान उपचार स्ट्रिएटम में डोपामाइन के स्तर को बहाल करने में लक्ष्य, केवल लक्षण हैं. सबसे निर्धारित दवा एल Dopa (levodopa), डोपामाइन की प्राकृतिक अग्रदूत है. Levodopa के प्रशासन के लिए एक निश्चित समय के लिए डोपामाइन के नुकसान के लिए क्षतिपूर्ति हालांकि, मोटर जटिलताओं के बाद (पर अपगति और बंद / अमेरिका) लंबी अवधि के उपचार 8,9 होते हैं.
डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स और पीडी पर रिसर्च निरंतर प्रगति में है और तीव्र प्रयासों कोशिका प्रत्यारोपण, जीन थेरेपी, या न्यूरोप्रोटेक्टिव एजेंट 10,11 के आधार पर उपचार विकसित करने के प्रयास किए जा रहे हैं. हालांकि, एक प्रमुख मुद्दा गैर elucidated रहता है: चरम vulnerab का कारण है क्याडीए न्यूरॉन्स की ility? जवाब का हिस्सा डीए न्यूरॉन्स की गतिविधियों में पाया जा सकता है. बिजली की गतिविधि में और डीए न्यूरॉन्स के excitability की कमी 12 पतित उनकी प्रवृत्ति को बढ़ाने के लिए लगता है. फिर भी, पीडी रोगजनन की जटिलता डीए में शामिल तंत्र न्यूरॉन्स 13-15 अध: पतन की पहचान करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है.
प्राथमिक संस्कृतियों डीए न्यूरॉन गुण 16-19 अध्ययन करने के लिए और न्यूरोप्रोटेक्टिव एजेंट 20-24 के मूल्यांकन के लिए विभिन्न तनावों को इन न्यूरॉन्स चुनौती देने के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक हैं. चूहा संस्कृति मॉडल सबसे अधिक बार चूहा भ्रूण mesencephalon का विच्छेदन आसान है, के रूप में माउस के साथ तुलना में, और न्यूरॉन्स की अधिक मात्रा चूहे में प्राप्त किया जा सकता है, किया जाता है. हालांकि, इस रोग से 25 के ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की पीढ़ी माउस 26-29 से प्राथमिक संस्कृतियों के लिए न्यूरोसाइंटिस्ट समुदाय के हित में वृद्धि हुई है काफी हो गया है. जनसंपर्क संस्कृतियों हालांकिनवजात पशुओं से epared यह न्यूरॉन्स अंतर करने के लिए अपनी क्षमता को बनाए रखा है, जब बाद mitotic चरण (mesencephalon न्यूरॉन्स के लिए E13.5) में भ्रूण से उन्हें तैयार करने के लिए बेहतर है, इस्तेमाल किया जा सकता है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल तैयार करने के लिए सबसे कठिन हैं जो माउस भ्रूण (E13.5), से प्राथमिक संस्कृति में अलग mesencephalon न्यूरॉन्स प्रस्तुत करता है. विशेष रूप से, हम एक बेहतर reproducibility के लिए सीरम मुक्त संस्कृति के माध्यम का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. संस्कृति तैयारी (विच्छेदन और यांत्रिक हदबंदी) में दो सबसे महत्वपूर्ण कदम सावधानी से जुड़े वीडियो में विस्तृत किया जाएगा.
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Protocol
इस काम में इस्तेमाल चूहों के लिए परवाह है और यूरोपीय संघ परिषद के दिशा निर्देशों प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए (86/609 / ईयू) के अनुसार संभाल रहे थे.
आवश्यक समाधान के 1 तैयारी
- शेयर समाधान
- 10x पाली एल ओर्निथिन (पीएलओ) समाधान: पीएलओ hydrobromide की 10 मिलीग्राम वज़न (आणविक वजन = 30,000-70,000) और बाँझ पानी की 70 मिलीलीटर में भंग. -20 डिग्री सेल्सियस पर 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर, विभाज्य का उपयोग कर समाधान, और दुकान फ़िल्टर.
- 30% ग्लूकोज समाधान: 30 डी (+) के ग्राम वजन - ग्लूकोज और 100 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए बाँझ पानी में भंग. 4 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर, विभाज्य, और दुकान.
- 5x Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) / पोषक तत्व मिश्रण एफ -12 हाम: DMEM / F-12 हाम पाउडर की 6 ग्राम वजन और 100 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए बाँझ पानी में भंग. 4 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर, विभाज्य, और दुकान.
- 7.5% सोडियम बाइकार्बोनेट (3 NaHCO) solutiमें: 3 NaHCO की 7.5 ग्राम वजन और 100 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए बाँझ पानी में भंग. 4 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर, विभाज्य, और दुकान.
- 1 एम HEPES समाधान: HEPES के 23.8 ग्राम वजन और 100 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए बाँझ पानी में भंग. 4 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर, विभाज्य, और दुकान.
- 70% (v / v) इथेनॉल: बाँझ पानी की 30 मिलीलीटर के साथ पूर्ण इथेनॉल के 70 मिलीलीटर पतला.
- ग्लूकोज और एंटीबायोटिक्स (पीबीएस गपशप) के साथ फॉस्फेट बफर खारा: 10 से 30% ग्लूकोज समाधान के मिलीलीटर और Dulbecco फॉस्फेट buffered खारा के 500 मिलीलीटर पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
- निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (iFBS): 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर गोजातीय सीरम पिघलना और 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय. -20 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिलीलीटर में विभाज्य और दुकान.
- संस्कृति मध्यम: बाँझ पानी में, 5x DMEM / F12 हैम का क्रमिक 40 मिलीलीटर, 1 1 एम HEPES की मिलीलीटर, 2 मिलीलीटर 200 मिमी के एल Glutamine, पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के 2 मिलीलीटर, 4 मिलीग्राम% 30 की ग्लूकोज का मिश्रणएन डी 180 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा को 7.5% 3 NaHCO के 3 मिलीलीटर. फ़िल्टर और उसी दिन का उपयोग करें.
- हार्मोन मिक्स
- संस्कृति के माध्यम से 180 मिलीलीटर तैयार करें. इस माध्यम में एपीओ-transferrin की 200 मिलीग्राम भंग.
- इंसुलिन की 50 मिलीग्राम वजन और 0.1 एम एचसीएल के 2 मिलीलीटर में भंग. धीरे मिश्रण जबकि बाँझ पानी के धीरे धीरे 8 मिलीलीटर जोड़ें. संस्कृति के माध्यम में इस समाधान पतला.
- प्यूटर्साइन dihydrochloride के 19.3 मिलीग्राम वजन और बाँझ पानी के 10 एमएल में भंग. हार्मोन मिश्रण करने के लिए 10 मिलीलीटर समाधान जोड़ें.
- बाँझ पानी में एक 3 मिमी सोडियम Selenite समाधान और निरपेक्ष इथेनॉल में एक 2 मिमी प्रोजेस्टेरोन समाधान तैयार है. हार्मोन मिश्रण करने के लिए प्रत्येक समाधान के 20 μl जोड़ें.
- -20 डिग्री सेल्सियस पर हार्मोन मिश्रण, विभाज्य 10 मिलीलीटर में और दुकान फ़िल्टर.
संस्कृति प्लेट्स और साधनों की 2. तैयारी
- संस्कृति प्लेट्स की FBS कोटिंग: विच्छेदन से पहले दिन, संस्कृति के माध्यम से 180 मिलीलीटर तैयार करते हैं. के 10 मिलीलीटर जोड़ेंसंस्कृति के माध्यम से 90 मिलीलीटर iFBS. जोड़ें 300 μl / अच्छी तरह से संस्कृति के माध्यम / पाली डी lysine प्रीकोटेड 24 अच्छी तरह प्लेटें में 10% iFBS. 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं. 4 डिग्री सेल्सियस पर (साथ और iFBS बिना) शेष मीडिया की दुकान.
- यंत्र और पाश्चर pipettes जीवाणुरहित. एक द्वितीय श्रेणी लामिना का प्रवाह हुड और सीओ 2 इनक्यूबेटर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सामग्री तालिका में सूचीबद्ध उपकरण इकट्ठा करो.
माउस Mesencephalon के 3 विच्छेदन
- (संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार) एक E13.5 गर्भवती माउस बलिदान. 70% इथेनॉल के साथ माउस का पेट साफ और पेट की दीवार खुला. , नाजुक कैंची का उपयोग उन्हें खोलने, गर्भाशय सींग लीजिए गर्भाशय सींग से प्रत्येक भ्रूण टुकड़े करना, और एमनियोटिक झिल्ली को हटा दें. बाँझ पीबीएस गपशप युक्त 100 मिमी पेट्री डिश में भ्रूण प्लेस और संदंश का उपयोग 3 लगातार समान स्नान में स्थानांतरण से उन्हें धो लो. विच्छेदन के लिए, एक 60 मिमी बाँझ पेट्री डिश में 3 से भ्रूण जगह है.
- Movstereomicroscope के तहत अंतिम पेट्री डिश ई. भ्रूण सिर काट मत करो. Vannas कैंची का प्रयोग, दिमाग आबकारी.
- ध्यान हटाने और fore- और पश्चमस्तिष्क क्षेत्रों त्यागें. व्याख्यान चबूतरे वाला पक्ष के लिये, isthmus क्षेत्र में दुम पक्ष कटौती करने के लिए, thalamic क्षेत्र के करीब कटौती बेहतर colliculus हटा दें.
- उदर मध्यमस्तिष्क पृथक हो जाने के बाद, ध्यान से अल्ट्रा ठीक संदंश का उपयोग तानिका हटा दें. पीबीएस गपशप से भरा एक बाँझ 13 मिलीलीटर ट्यूब में, तानिका के बिना, विच्छेदित क्षेत्रों लीजिए.
- 70% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से mesencephala युक्त ट्यूब साफ और हुड के नीचे ले आएं.
4 सेल हदबंदी
- धो बाँझ पीबीएस गपशप के साथ 3x mesencephala. मस्तिष्क टुकड़े प्रत्येक धोने के बीच बसा है और ऊतक में खलल न डालें से बचने के लिए अनुमति दें. पिछले धोने के बाद, एक में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए trypsin / EDTA के 3 मिलीलीटर में मस्तिष्क क्षेत्रों के रूप में संभव सावधानी के रूप में ज्यादा समाधान निकालने और सेते2 इनक्यूबेटर सह.
- आग पॉलिश पाश्चर pipettes एक गैर पॉलिश कांच pipet के अंत के रूप में न्यूरॉन्स के अस्तित्व को अधिकतम तेज है और पृथक्करण चरणों के दौरान कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है. यह आग चमकाने थोड़ा सिरा व्यास पाश्चर पिपेट की (0.5 मिमी) को कम.
- ध्यान से जितना संभव trypsin / EDTA समाधान निकालने और संस्कृति के माध्यम से 10 मिलीलीटर / 10% iFBS जोड़ें. धो मस्तिष्क क्षेत्रों संस्कृति मध्यम / 10% iFBS साथ 3x.
- आग पॉलिश पाश्चर विंदुक का प्रयोग, संस्कृति मध्यम / 10% iFBS के 6 मिलीलीटर में mesencephala की हदबंदी शुरू करते हैं. महीन चुर्ण बनाना 10x तो एक नया बाँझ 13 मिलीलीटर ट्यूब में मध्यम इकट्ठा, हिस्सा व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं, (हवाई बुलबुले से बचने).
- , संस्कृति के माध्यम से 6 मिलीलीटर जोड़ें एक बार पिछले चरण दोहराएँ और वही 13 मिलीलीटर ट्यूब में अलग कोशिकाओं से युक्त मध्यम इकट्ठा.
- 5 मिनट के लिए 160 ग्राम पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और साथ पूरक मध्यम संस्कृति में कोशिकाओं resuspend10% हार्मोन मिश्रण.
5 सेल चढ़ाना
- एक Malassez सेल में निलंबन में कोशिकाओं की गणना और 600,000 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता के लिए माध्यम की मात्रा समायोजित करें. चारों ओर 1,700,000 कोशिकाओं एक माउस mesencephalon से प्राप्त किया जा सकता है.
- 24 अच्छी तरह प्लेटें से कोटिंग मध्यम FBS युक्त निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर में जोड़ने (600,000 कोशिकाओं / खैर, गु + कोशिकाओं का 2-4%).
- 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं और 5% सीओ 2/95% हवा. कोई मध्यम परिवर्तन आवश्यक है. डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स इन विट्रो में चारों ओर 5-7 दिनों (डोपामाइन ट्रांसपोर्टर की सुसंगत अभिव्यक्ति) के बाद परिपक्व हो रहे हैं. मध्यम प्रतिस्थापन के बिना 15 दिनों के लिए संस्कृति में कोशिकाओं रखें.
6 इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल
- Coverslips के सफाई
- विच्छेदन से पहले दिन, एक पेट्री डिश में 1 एम एचसीएल की 10 मिलीलीटर जोड़ें. तरल 12-15 कांच coverslips की सतह पर लेट गया और 15 मिनट इंतज़ार करो.
- कवर सिंकतरल में पर्ची और 15 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें.
- एचसीएल निकालें और पानी के साथ 3x धो लो.
- एक बार शुद्ध इथेनॉल के साथ जल्दी से coverslips धो लें, तो डिश शुद्ध इथेनॉल जोड़ने और 30 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें.
- हुड के तहत, इथेनॉल से साफ coverslips निकालें और निष्फल संदंश का उपयोग कर एक 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली की अच्छी तरह से प्रति 1 coverslip जोड़ें.
- धो बाँझ पानी (1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से) के साथ दो बार coverslips. फिर, बाँझ पीबीएस के साथ एक बार उन्हें धोने.
- Coverslips के कोटिंग
- पीबीएस निकालें और 500 μl / 2x पीएलओ की अच्छी तरह से (पीबीएस में पतला) जोड़ने. सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए सेते हैं.
- पीएलओ समाधान निकालें और बाँझ पीबीएस के साथ 3x धो लो.
- पीबीएस निकालें और 500 μl / अच्छी तरह से 20% iFBS / 1 जी / एमएल laminin जोड़ने. सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं.
- इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए कोशिकाओं चढ़ाना
- 12 अच्छी तरह प्लेटें से कोटिंग मध्यम निकालें.
- 900,0 जोड़ें00 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर मात्रा में और इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित. प्रकोष्ठों मध्यम प्रतिस्थापन के बिना 15 दिनों के लिए संस्कृति में रखा जा सकता है.
- Immunostaining
- 12 अच्छी तरह प्लेटें से मध्यम निकालें और अच्छी तरह से DMEM 37 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ देते हैं / 500 μl से धो लें.
- / अच्छी तरह DMEM के 500 μl 37 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ देते जोड़ें, फिर धीरे से 160 μl / अच्छी तरह से 8 की% paraformaldehyde (पीएफए, 2% अंतिम एकाग्रता) जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.
- पीएफए निकालें और पीबीएस के साथ 3x धोने / 0.1 एम ग्लाइसिन 10 मिनट के लिए.
- , पीबीएस निकालें 300 μl / अच्छी तरह से पीबीएस / 0.05% ट्राइटन X-100/20% बकरी सीरम जोड़ने के लिए और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- , मध्यम निकालें 300 μl / अच्छी तरह से पीबीएस में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी / 0.05% ट्राइटन X-100/1% बकरी सीरम जोड़ने के लिए और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते हैं. डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स और संस्कृति की विशेषताओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्राथमिक एंटीबॉडी सामग्री तालिका में संकेत कर रहे हैं. रखें1 अच्छी तरह से प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना विभिन्न माध्यमिक एंटीबॉडी की पृष्ठभूमि के लिए मूल्यांकन करने के लिए.
- मध्यम निकालें और पीबीएस के साथ 3x धोने / 0.2% जिलेटिन 10 मिनट के लिए.
- , मध्यम निकालें 300 μl / अच्छी तरह से पीबीएस में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी / 0.05% ट्राइटन X-100/1% बकरी सीरम जोड़ने के लिए और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं. इस्तेमाल किया माध्यमिक एंटीबॉडी सामग्री तालिका में संकेत कर रहे हैं.
- मध्यम निकालें और पीबीएस के साथ 3x धोने / 0.2% जिलेटिन 10 मिनट के लिए.
- मध्यम निकालें और पीबीएस के साथ 3x धो लो.
- नीचे Vectashield की एक बूंद में कांच स्लाइड सेल पक्ष पर coverslips माउंट. फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें स्टोर, बढ़ते मध्यम सूख जाने के लिए कमरे के तापमान पर रात भर स्लाइड रखें.
- एक confocal खुर्दबीन या epifluorescence के लिए सुसज्जित एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों मोल. प्रतिनिधि छवियाँ एक Leica SP2 यूवी confocal खुर्दबीन के साथ हासिल किया गया.
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Representative Results
Mesencephalon संस्कृति चरणों का एक सचित्र प्रवाह चार्ट चित्र 1 में दिखाया गया है. संक्षेप में, एक गर्भवती स्विस माउस से E13.5 भ्रूण इकट्ठा करने के बाद, उदर mesencephalon पूरे भ्रूण से विच्छेदित है. पृथक मस्तिष्क टुकड़े क्रमिक enzymatic पाचन और यांत्रिक हदबंदी को प्रस्तुत कर रहे हैं. अलग कोशिकाओं पूर्व लेपित 12 या 24 अच्छी तरह प्लेटें में संस्कृति के माध्यम में resuspended और चढ़ाया, centrifugation द्वारा pelleted रहे हैं. प्रकोष्ठों मध्यम प्रतिस्थापन के बिना 15 दिनों के लिए रखा जाता है.
3.2 कदम को इसी उदर mesencephalon विच्छेदन की एक विस्तृत प्रवाह चार्ट, चित्रा 2 में दिखाया गया है. डैश्ड लाल लाइनों E13.5 माउस मस्तिष्क का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व पर 3 मुख्य काटने लाइनों से संकेत मिलता है (. Prestoz एट अल से 30 अनुकूलित) और काटने कदम सचित्र हैं.
वी आई टी में 1, 4, 7 दिनों के बाद संस्कृति के चरण विपरीत छवियोंआरओ (DIV) 3 चित्र में दिखाया जाता है. न्यूरॉन्स जल्दी एक्सटेंशन को विकसित करने और अंकुरण (चित्रा 3A). शाखाओं में बंटी और प्रभाव अधिक Div4 और DIV7 (आंकड़े -3 बी -3 सी) में बढ़ा रहे हैं.
डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स एक विरोधी वें एंटीबॉडी (चित्रा -4 ए) का उपयोग immunocytochemistry से पता चला रहे हैं. गु + कोशिकाओं की संख्या 2.5 सेमी 2 coverslip (4B चित्रा) प्रति व्यक्त किया है. कोशिकाओं का घनत्व लेपित प्लास्टिक की सीमाओं पर अच्छी तरह से लेपित गिलास coverslip पर बहुत अधिक है और साथ ही, उस पर अच्छी तरह से केंद्र पर है प्रति हम वीं + कोशिकाओं की संख्या को व्यक्त नहीं करते. डीए न्यूरॉन्स (वीं + कोशिकाओं) coverslip पर पूरे सेल की आबादी का 2-4% का प्रतिनिधित्व करते हैं. वें पॉजिटिव (वीं +) कोशिकाओं के रूप में जल्दी Div1 के रूप में दिखाई देते हैं और उनकी संख्या DIV6 में एक अधिकतम तक पहुँचने के लिए तेजी से बढ़ जाती है.
कोशिकाओं के सापेक्ष अनुपात डीए कोशिकाओं बुद्धि के immunofluorescence लेबलिंग द्वारा मूल्यांकन किया हैघंटे एक विरोधी डैट एंटीबॉडी (चित्रा 5A) या विरोधी MAP2 एंटीबॉडी के साथ एक विरोधी वें एंटीबॉडी (चित्रा 5 ब) और neuronal कोशिकाओं का सहवर्ती धुंधला. संस्कृति में मौजूद कई neuronal आबादी का प्रतिनिधि immunostaining भी चित्रा 5 में दिखाया गया है. GABAergic न्यूरॉन्स एक विरोधी GAD67 एंटीबॉडी (चित्रा 5C) का उपयोग दाग और कोशिकाओं के चारों ओर 50% का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. Serotonergic न्यूरॉन्स एक विरोधी सेरोटोनिन एंटीबॉडी (चित्रा 5D) के साथ पाया और संस्कृति में कोशिकाओं के कम से कम 1% का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. mesencephalon सेल संस्कृति भी glutamatergic न्यूरॉन्स (संस्कृति का 40%), कोलिनर्जिक न्यूरॉन्स, और दुर्लभ glial कोशिकाओं (लगभग 2-3%) शामिल हैं. Glial कोशिकाओं के अनुपात glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) धुंधला (चित्रा 5E) का उपयोग निर्धारित किया जाता है. Mesencephalon डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की स्पष्ट पहचान भी ऐसी Pitx3 या Foxa2 31,32 के रूप में विशिष्ट मार्कर का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है.
संस्कृति में मौजूद कई neuronal आबादी के हायर बढ़ाई immunostaining चित्रा 6 में दिखाया गया है. डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स एक विरोधी डैट एंटीबॉडी (चित्रा 6A) का उपयोग कर पता चला रहे हैं. डैट धुंधला डीए न्यूरॉन परिपक्वता स्थिति को दर्शाता है. डैट अभिव्यक्ति DIV3-4 में शुरू होता है. GABAergic न्यूरॉन्स और serotonergic न्यूरॉन्स क्रमशः, एक विरोधी GAD67 एंटीबॉडी (चित्रा 6B) या एक विरोधी सेरोटोनिन एंटीबॉडी (चित्रा 6C) का उपयोग दाग रहे हैं.
Mesencephalon संस्कृति की संख्या 1 इलस्ट्रेटेड प्रवाह चार्ट. मुख्य संस्कृति चरणों संकेत कर रहे हैं. (ए), एक गर्भवती स्विस माउस बलिदान पेट्री डिश में E13.5 भ्रूण लीजिए और लगातार पीबीएस स्नान से उन्हें धोने. (ईसा पूर्व) विच्छेदन खुर्दबीन, डी के तहतissect उदर mesencephalon पूरे भ्रूण से और एक ट्यूब में उन्हें जगह है. (डी) विच्छेदित मस्तिष्क टुकड़े को ट्रिप्सिन-EDTA जोड़ें और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पचाने. (ई) से युक्त संस्कृति मध्यम सीरम जोड़ने, trypsin निकालें और प्रदर्शन मैकेनिकल सेल हदबंदी (10 विचूर्णन आंदोलनों, दो बार दोहराया). (एफ), सेल गोली हार्मोन के साथ पूरक सीरम मुक्त माध्यम में उन्हें resuspend और precoated 12 या 24 अच्छी तरह प्लेटें में उन्हें थाली. एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े की.
Mesencephalon विच्छेदन की चित्रा 2 विस्तृत प्रवाह चार्ट. मुख्य विच्छेदन कदम संकेत कर रहे हैं. (ए) पुन बाद E13.5 पर माउस भ्रूणगर्भाशय सींग से moval. (बी) भ्रूण beheading के बिना, मस्तिष्क आबकारी. (सी) E13.5 में भ्रूण माउस मस्तिष्क की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (सी, दुम कटौती, डी, पृष्ठीय कटौती आर, व्याख्यान चबूतरे वाला कटौती) लाल मस्तिष्क उदर mesencephalon अलग करने के लिए कटौती की जानी चाहिए जहां लाइनों का संकेत धराशायी. मस्तक पुटिकाओं telencephalon, diencephalon, mesencephalon, और rhombencephalon क्रमशः, नीले, बैंगनी, गुलाबी में सीमांकित, और ग्रे कर रहे हैं. वायु, जलसेतु; Hypoth, हाइपोथैलेमस; LGE, पार्श्व ganglionic श्रेष्ठता; एल.वी., पार्श्व वेंट्रिकल; MFB, औसत दर्जे का अग्रमस्तिष्क बंडल; MGE, औसत दर्जे का ganglionic श्रेष्ठता; अनुसूचित जाति, बेहतर colliculus; थाल, चेतक; वीएम, उदर mesencephalon; लाल एक E13.5 माउस मस्तिष्क पर लाइनों धराशायी द्वारा 4V, (30 से अनुकूलित) चौथे वेंट्रिकल. (डी) लाइनें काट संकेत कर रहे हैं. (ई) माउस मस्तिष्क fore- और पश्चमस्तिष्क क्षेत्रों को हटाने के बाद (यानी कटौती आर के बाद). समर्थन के हटाने के बाद (एफ) माउस मस्तिष्कerior colliculus (यानी कटौती अनुसंधान और विकास के बाद) एक अलग mesencephalon की. (जी) वेंट्रल दृश्य (यानी के बाद आर, सी, डी में कटौती). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा विकास के विभिन्न चरणों में संस्कृति के 3 चरण विपरीत छवियों. (ए) Div1, (बी) Div4, और एक ही संस्कृति की (सी) DIV7 छवियों दिखाए जाते हैं. छवियाँ एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ जीवित कोशिकाओं पर हासिल किया गया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की चित्रा 4 tyrosine hydroxylase धुंधला. (ए) DIV8 में, डीए न्यूरॉन्स विरोधी वें एंटीबॉडी का उपयोग पाया गया. रहस्योद्घाटन एक 3,3'-diaminobenzidine (थपका) किट का उपयोग किया गया था. छवि. एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ हासिल कर ली संस्कृति की उम्र के एक समारोह के रूप में mesencephalon संस्कृतियों में गु + न्यूरॉन्स (बी) संख्या थी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
संस्कृति में न्यूरॉन्स और astrocytes की चित्रा 5 प्रतिनिधि अनुपात. Div4 में, (मैजंटा में) दा न्यूरॉन्स विरोधी डैट (ए) या विरोधी टी का उपयोग कर पाया गयाएच एंटीबॉडी (बी) और GABAergic न्यूरॉन्स, serotonergic न्यूरॉन्स और astrocytes (मैजंटा में) क्रमशः, विरोधी GAD67 (सी), विरोधी सेरोटोनिन (डी), और विरोधी GFAP (ई) एंटीबॉडी का उपयोग पाया गया. (सियान में) neuronal कोशिकाओं एक विरोधी MAP2 एंटीबॉडी (एई) के साथ दाग रहे थे. छवियाँ एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ हासिल किया गया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Mesencephalon संस्कृति के कई सेल आबादी का 6 प्रतिनिधि धुंधला चित्रा. (लाल रंग में) DIV9 पर डैट धुंधला द्वारा पता लगाया (ए) डोपामिनर्जिक न्यूरॉन. (बी) (हरे रंग में) DIV9 पर जीएडी-67 धुंधला द्वारा कल्पना GABAergic न्यूरॉन्स.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल भ्रूण माउस और डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स का पता लगाने के लिए immunofluorescence प्रक्रिया से mesencephalic न्यूरॉन्स के एक प्राथमिक संस्कृति तैयार करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं और अभिकर्मकों प्रस्तुत करता है. प्रक्रिया के महत्वपूर्ण कदम भ्रूण का विच्छेदन और एकत्र मस्तिष्क टुकड़े के यांत्रिक हदबंदी हैं. उच्च गुणवत्ता विच्छेदन उपकरणों विच्छेदन तकनीक मास्टर करने के लिए मदद करता है. डीए न्यूरॉन्स mesencephalon के एक छोटे से अनुपात का गठन. तदनुसार, उदर mesencephalon की सही हिस्सा एकत्रित डीए न्यूरॉन्स की 2-4% शामिल एक संस्कृति है कि प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. यांत्रिक हदबंदी ध्यान से और धीरे से किया जाना चाहिए. संस्कृति गैर अलग न्यूरॉन्स के समूहों में शामिल है, तो एक या दो अधिक विचूर्णन कदम जोड़ें.
इस प्रोटोकॉल न्यूरॉन संस्कृति के लिए सीरम मुक्त माध्यम का उपयोग करता है. हालांकि, सीरम के साथ कोटिंग कोशिकाओं के लगाव को बढ़ाने के लिए आवश्यक है. सेवा की जगह जो हार्मोन मिश्रण,उम, न्यूरॉन विकास की अनुमति देने और glial कोशिकाओं अस्तित्व और प्रसार को कम करने के लिए परिभाषित किया गया है. नतीजतन, गैर neuronal कोशिकाओं (GFAP धुंधला का उपयोग मात्रा का ठहराव) संस्कृति का लगभग 2-3% का प्रतिनिधित्व करते हैं. वैकल्पिक रूप से, संस्कृतियों इसके साथ सीरम की उपस्थिति में उगाया जा सकता है, दो दिनों बोने के बाद, साइटोसिन-β-D-arabinofuranoside (आरा सी, 5-8 माइक्रोन) के glial कोशिकाओं 26 के प्रसार को दबाने के लिए. हार्मोन मिश्रण करने के लिए एक अन्य विकल्प परिभाषित मीडिया और पूरक 29 का इस्तेमाल होता है.
इस तकनीक immunofluorescence धुंधला, मात्रात्मक पीसीआर, दूसरा दूत मात्रा का ठहराव और विष विज्ञान / अस्तित्व स्क्रीन के विभिन्न प्रकार के प्रदर्शन करने के लिए उपयुक्त है. यह भी इन तैयारियों 33,34 पर electrophysiological अध्ययन का संचालन करने के लिए संभव होना चाहिए. प्रयुक्त जानवर की संख्या को कम करते हुए इन संस्कृतियों, पूर्व उम्मीदवार न्यूरोप्रोटेक्टिव अणुओं की पहचान करने और डीए न्यूरॉन्स गुण चिह्नित करने के लिए कर सकते हैं. हालांकि, फाईसभ्य न्यूरॉन्स जोरदार उनकी परिपक्वता प्रभावित हो सकता है जो अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों से जानकारी प्राप्त नहीं है के रूप में vivo मॉडल में उपयोग कर एनएएल पुष्टि, अनुरोध किया जाता है.
इस तकनीक का व्यापक रूप से जल्दी अस्सी के दशक 16,17 में अपनी पहली वर्णन के बावजूद, चूहे संस्कृति मॉडल के साथ तुलना में उपयोग नहीं किया है. नाजुक विच्छेदन पेश छवियों की कमी इस माउस संस्कृति मॉडल विकसित करने के लिए शोधकर्ताओं को नियंत्रित कर सकते हैं. हालांकि, विशिष्ट जीन रद्द या विशिष्ट न्यूरॉन प्रकार की लेबलिंग के साथ neurodegenerative विकारों 25 के कई ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की पीढ़ी के लिए, माउस से डीए न्यूरॉन संस्कृतियों अब बहुत रुचि के हैं.
ट्रांसजेनिक माउस के किसी भी प्रकार से अलग डीए न्यूरॉन्स का अध्ययन इस तकनीक की अनुमति देता माहिर और जीन संशोधन द्वारा प्रेरित गड़बड़ी का पता लगाने के लिए. इसके अलावा, इन संस्कृतियों संदर्भ मॉडल माउस स्टेम से व्युत्पन्न डीए न्यूरॉन्स के साथ तुलना करने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैकोशिकाओं 35 या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल 36 से.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-Glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1 M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water - Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1,000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1,000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
References
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