Abstract
Dopaminerge neuroner representerer mindre enn 1% av det totale antall av neuroner i hjernen. Dette lav mengde nevroner regulerer viktige hjernefunksjoner som for eksempel motorisk kontroll, motivasjon og arbeidsminne. Nigrostriatale dopaminerge nevroner selektivt degenerere i Parkinsons sykdom (PD). Denne progressive neuronal tap er utvetydig forbundet med motorer symptomer på patologi (bradykinesi, hviler tremor, og muskelstivhet). De viktigste agent ansvarlig for dopaminerge nevroner degenerasjon er fortsatt ukjent. Men disse neuronene ser ut til å være meget sårbare i ulike forhold. Primære kulturer utgjør en av de mest relevante modeller for å undersøke egenskaper og karakteristikker av dopaminerge nevroner. Disse kulturene kan sendes til ulike stress agenter som etterligner PD patologi og til nervecellene forbindelser for å stoppe eller bremse ned neuronal degenerasjon. De mange transgene mus modeller av PD som har vært generrerte i løpet av det siste tiåret ytterligere økt interesse av forskere for dopaminerge nevroner kulturer. Her fokuserer video-protokollen på den delikate disseksjon av embryonale mus hjerner. Presis eksisjon av ventral mesencephalon er avgjørende for å oppnå nevronale kulturer tilstrekkelig rik på dopaminerge celler for å tillate etterfølgende studier. Denne protokollen kan realiseres med embryonale transgene mus og er egnet for immunfluorescens farging, kvantitativ PCR, andre messenger kvantifisering, eller neuronal død / overlevelse vurdering.
Introduction
Dopamin, en av de essensielle hjerne nevrotransmittere 1,2, er hovedsakelig frigjort ved midthjernen dopaminerge neuroner (DA). Flertallet av DA nevroner bor i ventral del av mesencephalon 2-6. Skjematisk kan midthjernen DA nevroner deles i tre anatomisk og funksjonelt distinkte projeksjon systemer: mesostriatal, mesolimbiske og mesocortical veier 2,5. Den nigrostriatal veien er involvert i motorisk adferd, mesolimbic trasé spille en viktig rolle i forsterkning, motivasjon og læring, mens de dopaminerge trasé prosjektering til prefrontal cortex er innblandet i kognisjon to.
DA-nevroner er involvert i flere humane nevrologiske lidelser så som schizofreni, oppmerksomhetssvikt, hyper-aktivitet uorden, og Parkinsons sykdom (PD) 2,4. PD er preget av en progressiv og selektiv degenerasjon av DA nevroner koble substantia nigraPars comp (SNC) til striatum. Tapet av Nigro-striatal DA nevroner resulterer i alvorlig dopamin uttømming i striatum som er ansvarlig for de motoriske symptomer på PD (bradykinesi, hviler tremor, og stivhet) 7. Den opprinnelige årsaken til idiopatisk PD er ikke klarlagt, og de nåværende behandlinger er kun symptomatisk, med sikte på å gjenopprette dopamin nivået i striatum. Den mest legemiddelet er L-dopa (levodopa), den naturlige forløper for dopamin. Selv om administrasjon av Levodopa kompenserer for tapet av dopamin for en viss tid, oppstår motoriske komplikasjoner etter langvarig behandling (dyskinesi og av / på statene) 8,9.
Forskning på dopaminerge nevroner og PD er i konstant progresjon og intens innsats blir gjort for å utvikle behandlinger basert på celletransplantasjon, genterapi, eller neurobeskyttelsesmidler 10,11. Imidlertid gjenstår et stort problem som ikke er belyst: Hva er årsaken til den ekstreme vulnerability av DA nevroner? En del av løsningen kan finnes i aktiviteten av DA-nevroner. En reduksjon i den elektriske aktiviteten og av oppstemthet av DA nevroner ser ut til å utfylle deres tilbøyelighet til å utarte 12. Likevel kompleksiteten i PD patogenesen krever videre studier for å identifisere de mekanismene som er involvert i DA nevroner degenerasjon 13-15.
Primærkulturer er spesielt relevant å studere DA neuron egenskaper 16-19 og å utfordre disse nevronene til ulike påkjenninger for evaluering av neurobeskyttelsesmidler 20-24. Rotte kulturmodeller er oftest benyttet, som disseksjon av rotte embryo mesencephalon er enklere, sammenlignet med mus, og høyere mengder av neuroner kan fås hos rotter. Imidlertid har generasjon av transgene mus modeller av sykdommen 25. betydelig økt interesse av hjerneforsker samfunnet for primærkulturer fra musen 26-29. Selv kulturer prepared fra nyfødte dyr som kan brukes, er det bedre å forberede dem fra embryoer ved post-mitotiske trinn (E13.5 for Mesencephalon neuroner), når neuroner har beholdt sin evne til å differensiere. Følgende protokoll presenterer isolerte mesencephalon nevroner i primærkultur fra mus embryoer (E13.5), som er de vanskeligste å forberede seg. Spesielt gir vi en protokoll ved hjelp av serum-fri kultur medium for en bedre reproduserbarhet. De to mest kritiske trinn i fremstillingen kultur (disseksjon og mekanisk dissosiasjon) vil bli nøye beskrevet i den tilhørende video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Musene som brukes i dette arbeidet var ivaretatt og behandlet i samsvar med retningslinjene i EU Council (86/609 / EU) for bruk av forsøksdyr.
1. Utarbeide nødvendig Solutions
- Aksje Solutions
- 10x Poly-L-Ornitin (PLO) Løsning: veie ut 10 mg av PLO hydrobromid (molekylvekt = 30.000-70.000) og oppløses i 70 ml sterilt vann. Filtrer løsningen ved hjelp av 0,2 mikrometer sprøyte filter, delmengde, og oppbevar ved -20 ° C.
- 30% glukoseoppløsning: veie ut 30 g av D (+) - glukose og oppløses i sterilt vann til et totalt volum på 100 ml. Filter, delmengde, og oppbevar ved 4 ° C.
- 5x Dulbeccos Modified Eagle 's Medium (DMEM) / Nutrient Mixture F-12 Ham: veie ut 6 g av DMEM / Ham F-12 pulver og oppløses i sterilt vann til et totalt volum på 100 ml. Filter, delmengde, og oppbevar ved 4 ° C.
- 7,5% natriumbikarbonat (NaHCO3) Solution: veie ut 7,5 g NaHCO3 og oppløses i sterilt vann til et totalt volum på 100 ml. Filter, delmengde, og oppbevar ved 4 ° C.
- 1 M HEPES Løsning: veie ut 23,8 g HEPES og oppløses i sterilt vann til et totalt volum på 100 ml. Filter, delmengde, og oppbevar ved 4 ° C.
- 70% (v / v) etanol: Fortynn 70 ml absolutt etanol med 30 ml sterilt vann.
- Fosfatbufret saltløsning med glukose og antibiotika (PBS-GAB): tilsett 10 ml 30% glukose-løsning og 5 ml penicillin-streptomycin-løsning til 500 ml Dulbeccos Fosfatbufret saltløsning. Oppbevar ved 4 ° C.
- Inaktivert føtalt bovint serum (iFBS): Tin bovint serum over natten ved 4 ° C, og innaktivere ved 56 ° C i 30 min. Delmengde inn 50 ml og oppbevar ved -20 ° C.
- Kulturmedium: I sterilt vann, bland suksessivt 40 ml av 5x DMEM / Ham F12-1 ml av 1 M HEPES, 2 ml 200 mM L-glutamin, 2 ml penicillin-streptomycin, 4 ml 30% glukose ennd 3 ml 7,5% NaHCO 3 til et sluttvolum på 180 ml. Filtrere og bruke samme dag.
- Hormon Mix
- Forbered 180 ml kulturmedium. Oppløs 200 mg apo-transferrin i dette medium.
- Vei opp 50 mg av insulin og oppløses i 2 ml 0,1 M HCl. Legg langsomt 8 ml sterilt vann mens det blandes forsiktig. Fortynn denne løsningen i dyrkningsmediet.
- Vei opp 19,3 mg Putrescine dihydroklorid og oppløses i 10 ml sterilt vann. Tilsett 10 ml oppløsning for hormonet blanding.
- Tilbered en 3 mM natriumselenitt løsning i sterilt vann og en 2 mM progesteron-løsning i absolutt etanol. Tilsett 20 pl av hver løsning på hormonet blanding.
- Filter hormonet mix, delmengde i 10 ml og oppbevar ved -20 ° C.
2. Utarbeidelse av kulturplater og instrumenter
- FBS Coating av kulturen Plater: Dagen før disseksjon, forberede 180 ml kulturmedium. Tilsett 10 mliFBS til 90 ml kulturmedium. Tilsett 300 ul / brønn av kulturmedium / 10% iFBS til poly-D-lysin på forhånd er dekket 24-brønners plater. Inkuber over natten ved 37 ° C. Oppbevar de resterende medium (med og uten iFBS) ved 4 ° C.
- Sterilisere instrumenter og Pasteur pipetter. Samle utstyret listet i material tabellen, samt en klasse II laminær hette og et CO 2 inkubator.
3. Disseksjon av Mouse Mesencephalon
- Ofre en E13.5 gravid mus (i henhold til institusjonelle retningslinjer). Rengjør magen av musen med 70% etanol og åpne magen veggen. Samle livmor horn, åpne dem ved hjelp av delikate saks, dissekere hvert embryo fra livmor horn, og fjerne foster membraner. Plasser embryoene i en 100 mm petriskål som inneholder sterilt PBS-GAB og vaske dem ved overføring i tre påfølgende identiske bad med tang. For disseksjon, plasserer embryoene av tre i en 60 mm steril petriskål.
- Move det endelige petriskål under stereomikroskop. Ikke halshugge embryoene. Bruke Vännäs saks, avgifter hjernen.
- Fjern forsiktig og kast forgrunn- og hindbrain regioner. Til rostral side, kuttet nær thalamic regionen, til hale innsving på eidet regionen, fjerne den overlegne colliculus.
- Når ventral midthjernen er isolert, forsiktig fjerne hjernehinnene ved hjelp av ultra fin pinsett. Samle dissekert segmenter, uten hjernehinnene, i et sterilt 13 ml rør fylt med PBS-GAB.
- Rengjør røret som inneholder mesencephala grundig med 70% etanol og bringe det under panseret.
4. celledissosieringsmedium
- Vask mesencephala 3x med sterilt PBS-GAB. Tillat hjernen fragmenter å bosette mellom hver vask og unngå å forstyrre vev. Etter den siste vask, fjern forsiktig så mye løsning som mulig og inkuber hjerne segmenter i 3 ml Trypsin / EDTA i 15 min ved 37 ° C i enCO 2 inkubator.
- Brann-polsk Pasteur pipetter for å maksimere overlevelse av nervecellene som slutten av en ikke-polert glass pipette er skarp og kan skade cellene i løpet av dissosiasjon trinn. Litt redusere ekstremitet diameter (opptil 0,5 mm) av Pasteur pipette mens flamme-polering av den.
- Fjern forsiktig så mye Trypsin / EDTA løsning som mulig og legge til 10 ml kultur medium / 10% iFBS. Vask hjernen segmenter 3x med kultur medium / 10% iFBS.
- Ved å bruke bålet polert Pasteur-pipette, begynner dissosiasjon av mesencephala i 6 ml kulturmedium / 10% iFBS. Triturate 10x (unngå luftbobler), la de biter å bosette, og samle det mediet i en ny steril 13 ml tube.
- Tilsett 6 ml kulturmedium, gjentar det foregående trinn en gang og samle mediet inneholdende dissosierte celler i det samme 13 ml rør.
- Sentrifuger cellene ved 160 g i 5 min. Kast supernatanten og resuspender cellene i kulturmedium supplert med10% hormon mix.
5. Cell Plating
- Tell cellene i suspensjon i et Malassez celle og justere volumet av medium til en konsentrasjon på 600.000 celler / ml. Rundt 1,700,000 celler kan hentes fra ett muse mesencephalon.
- Fjern FBS-inneholdende belegg medium fra 24-brønners plater, og legge inn hver brønn 1 ml av cellesuspensjonen (600 000 celler / brønn, 2-4% av TH +-celler).
- Inkuber platen ved 37 ° C og 5% CO 2/95% luft. Ingen mellom forandring er nødvendig. Dopaminerge nevroner er modne etter rundt 5-7 dager in vitro (konsistent uttrykk for dopamin transporter). Hold celler i kultur opp til 15 dager uten medium erstatning.
6. Immunfluorescens Protocol
- Rengjøring av Dekk
- Dagen før disseksjon, tilsett 10 ml 1 M HCl i en petriskål. Lå på overflaten av de flytende 12-15 glass dekkglass og vente 15 min.
- Sink dekseletskli inn i væsken og vente i 15 min.
- Fjern HCl og vaskes 3 ganger med vann.
- Vask Dekk raskt med ren etanol gang, og deretter legge ren etanol til parabolen og vente i 30 min.
- Under panseret, fjerne renset Dekk fra etanol og tilsett 1 dekk per brønn i en 12-brønns cellekultur plate ved hjelp av steriliserte tang.
- Vask Dekk to ganger med sterilt vann (1 ml / brønn). Deretter vaske dem en gang med sterilt PBS.
- Belegg av Dekk
- Fjern PBS og tilsett 500 mL / brønn 2x PLO (fortynnet i PBS). Inkuber i 4 timer ved 37 ° C i CO2-inkubatoren.
- Fjern PLO løsningen og vask 3 ganger med sterilt PBS.
- Fjern PBS og tilsett 500 pl / brønn av 20% iFBS / 1 g / ml Laminin. Inkuberes over natten ved 37 ° C i CO 2 inkubator.
- Plating av celler for Immunfluorescens
- Fjern beleggmedium fra 12-brønners plater.
- Legg 900,000 celler / brønn i 2 ml volum og dyrke cellene ved 37 ° C i inkubatoren. Celler kan holdes i kultur opp til 15 dager uten medium erstatning.
- Farging
- Fjern medium fra 12-brønners plater og vask med 500 pl / brønn DMEM forvarmet ved 37 ° C.
- Legg 500 pl / brønn av DMEM forvarmet ved 37 ° C, og deretter legge forsiktig 160 ul / brønn av 8% paraformaldehyd (PFA, 2% endelig konsentrasjon) og inkuberes i 10 min ved 37 ° C.
- Fjern PFA og vask 3 ganger med PBS / 0,1 M glysin i 10 min.
- Fjern PBS, tilsett 300 ul / brønn av PBS / 0,05% Triton X-100/20% geiteserum og inkuberes i 30 min ved romtemperatur.
- Fjern medium, tilsett 300 ul / brønn av primært antistoff fortynnet i PBS / 0,05% Triton X-100/1% geiteserum og inkuberes i 2 timer ved romtemperatur. Primære antistoffer som kan brukes for påvisning av dopaminerge nevroner og karakterisering av kulturen, er angitt i Materialer tabellen. Hold1 brønnen uten primært antistoff for å vurdere om bakgrunnen for de forskjellige sekundære antistoffer.
- Fjern medium og vask 3 ganger med PBS / 0,2% gelatin i 10 minutter.
- Fjern medium, tilsett 300 ul / brønn av sekundært antistoff fortynnet i PBS / 0,05% Triton X-100/1% geiteserum og inkuberes i 1 time ved romtemperatur, i mørke. Sekundære antistoffer som brukes er angitt i Materials tabellen.
- Fjern medium og vask 3 ganger med PBS / 0,2% gelatin i 10 minutter.
- Fjern medium og vaske 3x med PBS.
- Monter Dekk på glass lysbilder celle siden ned i en dråpe VECTASHIELD. Hold skinnene ved romtemperatur natten over for å la monteringsmedium tørr, og deretter lagre dem ved 4 ° C.
- Hente bilder ved hjelp av en konfokal mikroskop eller en fase kontrast mikroskop utstyrt for epifluorescence. Representative bilder ble kjøpt med en Leica SP2 UV konfokal mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En illustrert flytskjema over de trinn Mesencephalon kultur er vist i figur 1. Kort etter å samle E13.5 embryoer fra en gravid sveitsiske mus, er ventrale mesencephalon dissekert fra hele embryoet. De isolerte hjerne fragmenter suksessivt sendt til enzymatisk fordøyelse og mekanisk dissosiasjon. Dissosierte celler ble pelletisert ved sentrifugering, resuspendert i kulturmedium og plettert i pre-belagte 12-eller 24-brønners plater. Celler blir opprettholdt opp til 15 dager uten mellom utskifting.
En detaljert flytskjema over den ventrale mesencephalon disseksjon, svarende til trinn 3.2, er vist i figur 2. Stiplede røde linjer angir de tre hovedsnittlinjer på en skjematisk fremstilling av E13.5 musehjerne (tilpasset fra Prestoz et al. 30) og skjære trinn er illustrert.
Bilder fasekontrast av kulturen etter 1, 4, og 7 dager i vitRO (DIV) er vist i figur 3. nevroner raskt utvikle utvidelser og spirende (figur 3A). Forgreninger og konsekvenser er mer utvidet ved DIV4 og DIV7 (Tall 3B-3C).
Dopaminerge nevroner detekteres ved immunocytokjemi ved hjelp av en anti-TH-antistoff (figur 4A). Antallet TH + celler er uttrykt pr 2,5 cm to dekkglass (figur 4B). Vi uttrykker ikke antall TH + celler per brønn som tettheten av celler er mye høyere på grensen til den belagte plast godt enn på den belagte glass dekkglass, som er på senteret på brønnen. DA nevroner (TH + celler) representerer 2-4% av hele cellen befolkningen på dekkglass. TH-positive (TH +) celler vises så tidlig som Div1 og antallet øker raskt å nå et maksimum ved DIV6.
Den relative andel av celler blir vurdert ved immunofluorescens merking av DA-celler with et anti-DAT-antistoff (figur 5A) eller et anti-TH-antistoff (figur 5B), og samtidig farging av neuronale celler med anti-MAP2 antistoff. Representative farging av flere neuronale populasjoner som er tilstede i kulturen er også vist i figur 5. Gabaergic neuroner er farget ved hjelp av et anti-GAD67 antistoff (figur 5C), og utgjør ca 50% av cellene. Serotonerge neuroner blir detektert med en anti-serotonin-antistoff (figur 5D), og representerer mindre enn 1% av cellene i kultur. Den mesencephalon cellekultur inneholder også glutamaterge nevroner (40% av kulturen), kolinerge neuroner og gliaceller sjeldne (i størrelsesorden 2-3%). Andel av gliacellene bestemmes ved hjelp glial fibrillary surt protein (GFAP) flekker (figur 5E). Entydig identifikasjon av mesencephalon dopaminerge neuroner kan også oppnås ved hjelp av spesifikke markører som Pitx3 eller Foxa2 31,32.
Høyere forstørrelse farging av flere neuronale populasjoner som er tilstede i kultur er vist i figur 6. Dopaminerge neuroner blir detektert ved hjelp av et anti-DAT-antistoff (figur 6A). DAT farging reflekterer DA neuron modning tilstand. DAT uttrykk begynner på DIV3-4. Gabaergic nevroner og serotonerge neuroner er farget ved hjelp av et anti-GAD67 antistoff (figur 6B), eller en anti-serotonin-antistoff (figur 6C), henholdsvis.
Figur 1. Illustrert flytskjema over mesencephalon kultur. Hoved kultur trinn er indikert. (A) Blot en gravid sveitsiske mus, samle E13.5 embryoer i petriskåler og vaskes med PBS etterfølgende bad. (BC) Under disseksjon mikroskop, dissect ventral mesencephalon fra hele embryoer, og plassere dem i et rør. (D) I Trypsin-EDTA til de dissekert hjerne fragmenter og fordøye ved 37 ° C i 15 min. (E) Fjern trypsin, tilsett-serum som inneholder kulturmedium og utføre (F) mekanisk celledissosieringsmedium (10 Triturerings bevegelser, gjentatt to ganger). Pellet cellen, resuspender dem i serumfritt medium supplert med hormoner og plate dem i på forhånd er dekket 12 eller 24-brønners plater. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Figur 2. Detaljert flytdiagram av mesencephalon disseksjon. Hoved disseksjon trinn er indikert. (A) mus embryo ved E13.5 etter removal fra livmor horn. (B) Uten halshugget embryo, forbruks hjernen. (C) Skjematisk fremstilling av embryonale musehjerne på E13.5. Stiplede røde linjen viser hvor hjernen bør kuttes for å isolere ventral mesencephalon (R, rostral kutt, C, caudal kuttet, D, rygg cut). Cephalica vesikler telencephalon, diencephalon, mesencephalon, og rhombencephalon er avgrenset i blått, lilla, rosa og grå, henholdsvis. Aq, akvedukt; Hypot, hypothalamus; LGE, lateral ganglier eminense; LV, lateral ventrikkel; MFB, medial brain bunt; MGE, medial ganglier eminense; fm, overlegen colliculus; Thal, thalamus; VM, ventral mesencephalon; 4V, fjerde ventrikkel (tilpasset fra 30). (D) Skjære linjer er indikert med stiplede røde linjer på en E13.5 musehjerne. (E) Mus hjernen etter fjerning av de frem- og hindbrain regioner (dvs. etter snitt R). (F) Mus hjernen etter fjerning av superior colliculus (dvs. etter kutt R og D). (G) Ventralt visning av en isolert mesencephalon (dvs. etter kutter R, C, D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. bilder fasekontrast av kulturen på ulike stadier av utviklingen. (A) Div1, (B) DIV4, og (C) DIV7 bilder av samme kultur er vist. Bilder ble kjøpt på levende celler med en invertert mikroskop. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Tyrosin hydroksylase farging av dopaminerge nevroner. (A) På DIV8 ble DA nevroner oppdaget ved hjelp av anti-TH antistoff. Åpenbaringen ble utført ved hjelp av en 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) kit. Bildet ble kjøpt med en invertert mikroskop. (B) Antall TH + nevroner i mesencephalon kulturer som en funksjon av alder av kulturen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Representative andel av neuroner og astrocytter i kultur. På DIV4, DA-nevroner i (magenta) ble påvist ved hjelp av anti-DAT (A) eller anti-TH antistoff (B) og gabaergic nevroner, serotonerge nevroner og astrocytter (i magenta) ble oppdaget ved hjelp av anti-GAD67 (C), anti-serotonin (D), og anti-GFAP (E) antistoffer, henholdsvis. Neuronale celler (i cyan) ble farget med et anti-MAP2 antistoff (AE). Bilder ble kjøpt med en invertert mikroskop. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Representative farging av flere cellepopulasjoner i mesencephalon kultur. (A) dopaminerge nevroner oppdaget av DAT flekker på DIV9 (i rødt). (B) gabaergic nevroner visualisert ved GAD-67 flekker på DIV9 (i grønt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen presenterer de prosedyrer og reagenser som er nødvendige for å forberede en primær kultur mesencephalic nevroner fra embryonale mus og immunfluorescens prosedyre for å oppdage dopaminerge nevroner. Kritiske trinn i fremgangsmåten er de disseksjon av embryoene og mekanisk dissosiasjon av de innsamlede hjerne fragmenter. Høy kvalitet disseksjon instrumenter bidrar til å mestre disseksjon teknikk. DA-nevroner utgjør en liten andel av mesencephalon. Følgelig, samle den høyre delen av ventral mesencephalon er viktig å få en kultur som inneholder 2-4% av DA nevroner. Mekanisk dissosiasjon bør utføres nøye og forsiktig. Hvis kulturen inneholder klynger av ikke-dissosiert nevroner, legge til ett eller to flere Triturerings trinn.
Denne protokollen bruker serumfritt medium for neuron-kultur. Imidlertid belegg med serum som er nødvendig for å forbedre festingen av cellene. Hormon mix, som erstatter serum, er definert for å tillate neuron vekst og for å minimere gliaceller overlevelse og proliferasjon. Følgelig, ikke-neuronale celler utgjør i størrelsesorden 2-3% av kulturen (kvantifisering ved hjelp av GFAP-farging). Alternativt kan kulturene dyrkes i nærvær av serum med tillegg, to dager etter såing, av cytosin-β-D-arabinofuranoside (ara-C, 5-8 uM) for å undertrykke proliferasjon av gliaceller 26. Et annet alternativ til hormonet blanding er bruk av definerte medier og kosttilskudd 29.
Denne teknikken er egnet for å utføre fargingen immunfluorescens, kvantitativ PCR, second messenger kvantifisering og ulike typer av toksikologi / overlevelse-skjermer. Det bør også være mulig å gjennomføre elektrofysiologiske studier på disse preparatene 33,34. Disse kulturene kan identifisere pre-kandidat nevroprotektive molekyler og bidra til å karakterisere DA nevroner egenskaper, samtidig som antall dyr som brukes. Men final bekreftelse ved hjelp in vivo-modeller er forespurt, som kultiverte nevroner ikke mottar innspill fra andre områder av hjernen, noe som kan sterkt påvirke deres modning.
Denne teknikken er ikke mye brukt, sammenlignet med rotte kultur modeller, til tross for sin første beskrivelsene i begynnelsen av åttitallet 16,17. Mangelen på bilder som presenterer den delikat disseksjon kan begrense forskere til å utvikle denne musen kulturmodell. Imidlertid, på grunn av genereringen av en rekke transgene musemodeller av neurodegenerative lidelser 25 med bestemt gen invalide eller merking av spesifikke typer nevroner, DA neuron kulturer fra mus er nå av stor interesse.
Mestre denne teknikken gjør studiet av DA nevroner isolert fra alle typer transgen mus og å utforske forstyrrelse indusert av genmodifisering. Videre kan disse kulturene bli brukt som referansemodeller for å bli sammenlignet med DA neuroner avledet fra musestammenceller 35 eller fra induserte pluripotente stamceller 36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-Glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1 M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water - Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1,000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1,000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
References
- Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
- Iversen, S. D., Iversen, L. L.
- Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
- Chinta, S. J., Andersen, J. K.
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
- Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R.
- Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
- Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
- Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
- Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
- Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
- Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. erkerian- Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
- Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S.
- di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
- Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
- Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
- Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
- Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
- Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
- Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
- Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
- Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
- Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
- Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
- Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
- Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
- Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
- Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
- Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
- Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
- Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
- Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).
