Abstract
Dopaminergen Neuronen weniger als 1% der gesamten Anzahl von Neuronen im Gehirn. Diese geringe Menge an Neuronen regelt wichtige Hirnfunktionen wie Motorsteuerung, Motivation und Arbeitsgedächtnis. Nigrostriatalen dopaminergen Neuronen selektiv degenerieren bei Parkinson-Krankheit (PD). Diese fortschreitende Verlust von Nervenzellen ist eindeutig mit den Motoren Symptome der Pathologie (Bradykinesie, Ruhetremor und Muskelstarre) assoziiert. Die wichtigsten Vertreter der dopaminergen Neuronen verantwortlich Degeneration ist noch unbekannt. Allerdings scheinen diese Neuronen extrem anfällig in unterschiedlichen Bedingungen zu sein. Primärkulturen stellen eine der wichtigsten Modelle Eigenschaften und Merkmale von dopaminergen Neuronen zu untersuchen. Diese Kulturen können auf verschiedene Stressmittel, die PD Pathologie imitieren und zu neuroprotektiven Verbindungen, um zu stoppen oder zu verlangsamen neuronale Degeneration vorgelegt werden. Die zahlreichen transgenen Mausmodellen der PD, die Gener habenergaben sich im letzten Jahrzehnt weiter erhöht das Interesse der Forscher für dopaminerge Neuronenkulturen. Hier konzentriert sich das Video-Protokoll auf den empfindlichen Dissektion der embryonalen Gehirn der Maus. Präzise Exzision der ventralen Mittelhirn ist entscheidend für die neuronalen Kulturen ausreichend reich an dopaminergen Zellen zu erhalten, um nachfolgende Studien zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann mit embryonalen transgenen Mäusen realisiert werden und ist für die Immunfluoreszenzfärbung, quantitative PCR, second messenger Quantifizierung oder zum neuronalen Tod / Überleben Beurteilung.
Introduction
Dopamin, eine der wesentlichen Neurotransmitter im Gehirn 1,2, wird hauptsächlich von dopaminergen Mittelhirn (DA) Neuronen freigesetzt. Die Mehrheit der DA Neuronen befinden sich in der ventralen Teil des Mittelhirns 2-6. Mesostriatal, mesolimbischen und mesocorticalen Wege 2,5: schematisch, Mittelhirn-Neuronen DA kann in drei anatomisch und funktionell verschiedene Projektionssysteme aufgeteilt werden. Der Weg wird in nigrostriatale Motorik beteiligt, die mesolimbischen Bahnen spielen eine wichtige Rolle in der Verstärkung, Motivation und Lernen, während die dopaminergen Bahnen zum präfrontalen Kortex vorstehen, sind in Erkenntnis 2 beteiligt.
DA-Neuronen in mehreren neurologischen Störungen menschlichen wie Schizophrenie, Aufmerksamkeitsdefizit, Hyperaktivität Erkrankung und Parkinson-Krankheit (PD) 2,4 beteiligt. PD wird durch eine progressive Degeneration der selektiven und DA Neuronen verbinden Substantia nigra gekennzeichnetpars compacta (SNC) zum Striatum. Der Verlust der nigrostriatalen DA Neuronen führt zu einer starken Verarmung Dopamin im Striatum, die verantwortlich für die motorischen Symptome der PD (Bradykinesie, Ruhetremor, und Steifigkeit) 7. Die ursprüngliche Ursache der idiopathischen PD ist nicht nachgewiesen und die aktuellen Behandlungen sind nur symptomatisch, mit dem Ziel der Wiederherstellung Dopaminspiegel im Striatum. Das verschriebene Medikament ist L-Dopa (Levodopa), das natürliche Vorläufer von Dopamin. Obwohl Verabreichung von Levodopa kompensiert den Verlust von Dopamin zu einer bestimmten Zeit auftreten Motor Komplikationen nach einer Langzeitbehandlung (Dyskinesie und / AUS-Zustände) 8,9.
Forschung auf dopaminerge Neuronen und PD ist in ständiger Progression und intensive Anstrengungen unternommen werden, um Behandlungen auf Zelltransplantation, Gentherapie, oder neuroprotektive Mittel 10,11 zu entwickeln. Allerdings bleibt ein wichtiges Thema nicht geklärt: Was ist die Ursache für die extreme vulnerability von DA Neuronen? Ein Teil der Antwort kann in der Aktivität von Neuronen DA gefunden werden. Eine Reduktion der elektrischen Aktivität und der Erregbarkeit von DA-Neuronen scheint die Neigung zu degenerieren 12 zu erhöhen. Dennoch ist die Komplexität der PD Pathogenese erfordert weitere Studien, um die Mechanismen in DA Neuronen beteiligt Degeneration 13-15 identifizieren.
Primärkulturen sind besonders relevant für die DA Neuron Eigenschaften 16-19 studieren und diese Neuronen auf verschiedene Belastungen für die Bewertung der neuroprotektive Mittel 20-24 herauszufordern. Ratte Kulturmodelle werden häufig verwendet, da die Präparation der Rattenembryohirn ist einfacher, verglichen mit der Maus, und höhere Mengen von Neuronen bei Ratten erhalten werden. Allerdings hat von transgenen Mausmodellen der Krankheit 25 deutlich erhöht das Interesse der Neurowissenschaftler Community für Primärkulturen von der Maus 26-29. Obwohl Kulturen prvon neugeborenen Tieren epared verwendet werden kann, ist es besser, sie von Embryonen im post-mitotischen Stadium (E13.5 für Mesencephalon-Neuronen) herzustellen, wenn Neuronen haben ihre Fähigkeit zur Differenzierung beibehalten. Das folgende Protokoll stellt isoliert Hirn-Neuronen in Primärkultur von Maus-Embryonen (E13.5), die am schwierigsten zu vorzubereiten. Insbesondere stellen wir ein Protokoll mit serumfreiem Kulturmedium für eine bessere Reproduzierbarkeit. Die beiden wichtigsten Schritte in der Kultur-Präparat (Dissektion und mechanische Dissoziation) wird vorsichtig in den zugehörigen Video detailliert werden.
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Protocol
Die in dieser Arbeit verwendeten Mäuse wurden gepflegt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Rates der Europäischen Union (86/609 / EU) für den Einsatz von Labortieren behandelt.
1. Herstellung der erforderlichen Lösungen
- Stammlösungen
- 10x Poly-L-Ornithin (PLO) Lösung: wiegen 10 mg PLO Hydrobromid (Molekulargewicht = 30,000-70,000) und in 70 ml sterilem Wasser auflösen. Die Lösung wird mit 0,2 um Spritzenfilter, aliquoten, und bei -20 ° C.
- 30% Glucose-Lösung: wiegen 30 g D (+) - Glucose und Auflösen in sterilem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml. Filter, aliquoten, und bei 4 ° C.
- 5x Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) / Nährstoff-Mischung F-12 Ham: abwiegen 6 g DMEM / F-12 Ham Pulver und lösen sich in sterilem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml. Filter, aliquoten, und bei 4 ° C.
- 7,5% Natriumbicarbonat (NaHCO 3) Solutiauf: wiegen 7,5 g NaHCO 3 und lösen sich in sterilem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml. Filter, aliquoten, und bei 4 ° C.
- 1 M HEPES-Lösung: Man wiegt 23,8 g HEPES und Auflösen in sterilem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml. Filter, aliquoten, und bei 4 ° C.
- 70% (v / v) Ethanol: Verdünnen mit 70 ml absolutem Ethanol mit 30 ml sterilem Wasser.
- Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Glucose und Antibiotika (PBS-GAB): 10 ml 30% ige Glucoselösung und 5 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung zu 500 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Lagerung bei 4 ° C.
- Inaktiviertes fötales Rinderserum (IFB) auftauen Rinderserum über Nacht bei 4 ° C inaktiviert bei 56 ° C für 30 min. Aliquot in 50 ml und bei -20 ° C.
- Kulturmedium: in sterilem Wasser, Mischung nacheinander mit 40 ml 5x DMEM / F12-Ham, 1 ml 1 M HEPES, 2 ml von 200 mM L-Glutamin, 2 ml Penicillin-Streptomycin, 4 ml 30% Glucose einnd 3 ml 7,5% iger NaHCO 3 auf ein Endvolumen von 180 ml. Zu filtern und verwenden am selben Tag.
- Hormon-Mix
- Planen 180 ml Kulturmedium. Man löst 200 mg des apo-Transferrin in diesem Medium.
- Man wiegt 50 mg Insulin und in 2 ml 0,1 M HCl zu lösen. Fügen Sie langsam 8 ml sterilem Wasser unter Mischen sanft. Verdünne die Lösung in dem Kulturmedium.
- Wiegen 19,3 mg Putrescin-dihydrochlorid und in 10 ml sterilem Wasser auflösen. Fügen Sie die 10 ml-Lösung auf das Hormon-Mix.
- Bereiten Sie eine 3 mM Natriumselenit-Lösung in sterilem Wasser und 2 mM Progesteron-Lösung in absolutem Ethanol. Mit 20 ul jeder Lösung auf das Hormon-Mix.
- Filtern Sie die Hormon-Mix, Aliquot in 10 ml und bei -20 ° C.
2. Herstellung von Kulturplatten und Instrumente
- FBS Beschichtung der Kulturplatten: Der Tag vor der Dissektion, bereiten 180 ml Kulturmedium. 10 mlIFB auf 90 ml Kulturmedium. Geben Sie 300 ul / Kulturmedium / 10% IFBS in Poly-D-Lysin-Fertig 24-Well-Platten. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C aufweist. Bewahren Sie die übrigen Medien (mit und ohne IFBS) bei 4 ° C.
- Sterilisieren die Instrumente und Pasteur-Pipetten. Sammeln Sie die in der Materialliste aufgeführt als Class II Laminarströmungshaube und einem CO 2-Inkubator Ausrüstung.
3. Präparation der Maus Mesencephalon
- Opfern eine E13.5 schwangere Maus (gemäß gültiger Richtlinien). Reinigen Sie den Bauch der Maus mit 70% Ethanol und öffnen Sie die Bauchdecke. Sammeln Sie die Gebärmutterhörner, öffnen Sie sie mit zarten Schere, sezieren jedem Embryo von der Gebärmutterhörner, und entfernen Sie das Frucht Membranen. Legen Sie die Embryonen in einer 100 mm Petrischale mit sterilem PBS-GAB und waschen Sie sie durch Übertragung in 3 aufeinanderfolgenden gleichen Bäder mit einer Pinzette. Für die Präparation, legen Sie die Embryonen von 3 in einer 60 mm sterilen Petrischale.
- Move die letzten Petrischale unter dem Stereomikroskop. Enthaupten nicht die Embryonen. Verwendung Vannas Schere, die Gehirne herauszuschneiden.
- Entfernen und entsorgen den Vordergrund und Hinterhirn Regionen. Um rostralen Seite, schneiden in der Nähe des Thalamus-Region, an der Schwanzseite Schnitt an der Landenge Region, entfernen Sie den Colliculus superior.
- Sobald der ventralen Mittelhirn isoliert ist, sorgfältig Hirnhäute mit ultra feinen Pinzette entfernen. Sammeln Sie die Segmente zerlegt, ohne die Hirnhäute, in einer sterilen 13-ml-Tube mit PBS-GAB gefüllt.
- Reinigen Sie das Rohr mit dem mesencephala gründlich mit 70% Ethanol und bringen sie unter der Haube.
4. Zelldissoziation
- Wasch mesencephala mit sterilem PBS-GAB 3x. Erlauben Gehirn Fragmente zwischen jedem Wasch absetzen und vermeiden das Gewebe zu beeinträchtigen. Nach dem letzten Wasch, entfernen Sie sorgfältig, wie viel Lösung wie möglich und Inkubation Gehirn Segmente in 3 ml Trypsin / EDTA für 15 min bei 37 ° C in eineCO 2-Inkubator.
- Feuer-Politur die Pasteur-Pipetten, um das Überleben der Neuronen als das Ende eines nicht-polierten Glaspipette zu maximieren ist scharf und kann die Zellen während der Dissoziation Schritte beschädigen. Reduzieren Sie die Extremität Durchmesser (bis 0,5 mm) des Pasteur-Pipette, während Feuer-polieren.
- So viel Trypsin / EDTA-Lösung entfernen Sie vorsichtig wie möglich und mit 10 ml Kulturmedium / 10% IFBS. Wasch Gehirn Segmente 3x mit Kulturmedium / 10% IFBS.
- Verwendung der feuerpolierten Pasteurpipette beginnen Dissoziation mesencephala in 6 ml Kulturmedium / 10% IFBS. Man reibt 10x (Luftblasen vermeiden), lassen die Stücke zu regeln, dann sammeln das Medium in ein neues steriles 13-ml-Tube.
- 6 ml Kulturmedium, wiederholen Sie den vorherigen Schritt einmal zu sammeln und das Medium mit dissoziierten Zellen in der gleichen 13-ml-Tube.
- Zentrifuge Zellen bei 160 g für 5 min. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in Kulturmedium, ergänzt mit10% Hormon-Mix.
5. Handy-Überzug
- Zählen von Zellen in Suspension in einem Malassez Zelle und die Lautstärke von mittleren bis zu einer Konzentration von 600.000 Zellen / ml. Rund 1.700.000 Zellen können aus einer Maus Hirn gewonnen werden.
- Entfernen FBS-haltigen Beschichtungsmedium von 24-Well-Platten und fügen Sie in jede Vertiefung 1 ml Zellsuspension (600.000 Zellen / Well, 2-4% der TH + Zellen).
- Inkubieren der Platte bei 37 ° C und 5% CO 2/95% Luft. Kein Medium Veränderung ist notwendig. Dopaminergen Neuronen sind ausgereift nach etwa 5-7 Tagen in vitro (in Übereinstimmung Ausdruck der Dopamin-Transporter). Zellen in Kultur zu halten bis zu 15 Tage ohne Mediumwechsel.
6. Immunfluoreszenz-Protokoll
- Reinigung der Deckgläser
- Am Tag vor der Präparation, 10 ml 1 M HCl in eine Petrischale. Lag an der Oberfläche der Flüssigkeit 12-15 Deckgläser und warten Sie 15 min.
- Sinken die Abdeckungschlüpfen in die Flüssigkeit und warten Sie 15 min.
- HCl zu entfernen und waschen 3x mit Wasser.
- Schnell waschen Sie die Deckgläser mit reinem Ethanol einmal, dann fügen reinem Ethanol in die Schale und warten Sie 30 min.
- Unter der Haube entfernen gereinigt Deckgläser aus Ethanol und fügen Sie ein Deckglas pro Vertiefung einer 12-Well-Zellkulturplatte mit sterilisierten Pinzette.
- Waschdeckgläser zweimal mit sterilem Wasser (1 ml / Vertiefung). Dann waschen Sie einmal mit sterilem PBS.
- Beschichtung der Deckgläser
- PBS zu entfernen und fügen Sie 500 ul / 2x PLO (verdünnt in PBS). Inkubation für 4 Stunden bei 37 ° C im CO 2-Inkubator.
- Entfernen Sie die PLO-Lösung und waschen 3x mit sterilem PBS.
- PBS zu entfernen und fügen Sie 500 ul / 20% IFBS / 1 g / ml Laminin. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C im CO 2-Inkubator.
- Ausplattieren der Zellen für Immunfluoreszenz
- Entfernen Beschichtungsmedium von 12-Well-Platten.
- Fügen 900,000 Zellen / Vertiefung in 2 ml Volumen und Wachstum der Zellen bei 37 ° C im Brutschrank. Zellen können in Kultur bis zu 15 Tage ohne Mediumwechsel gehalten werden.
- Immunfärbung
- Entfernen Medium von 12-Well-Platten und Waschen mit 500 ul / well DMEM vorgewärmt auf 37 ° C.
- Gib 500 ul / Vertiefung DMEM vorgewärmt auf 37 ° C, dann fügen vorsichtig 160 ul / Vertiefung von 8% Paraformaldehyd (PFA, 2% Endkonzentration) und Inkubation für 10 min bei 37 ° C aufweist.
- PFA entfernen und waschen 3x mit PBS / 0,1 M Glycin für 10 min.
- PBS zu entfernen, fügen Sie 300 ul / PBS / 0,05% Triton X-100/20% Ziegenserum und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Medium entfernen, werden 300 ul / Vertiefung von primärem Antikörper, verdünnt in PBS / 0,05% Triton X-100/1% Ziegenserum und Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Primäre Antikörper, die zum Nachweis von dopaminergen Neuronen und Charakterisierung der Kultur verwendet werden können, sind in der Tabelle angegebenen Materialien. Halten1 auch ohne primären Antikörper für Hintergrund der verschiedenen Sekundärantikörper zu bewerten.
- Medium entfernen und waschen 3x mit PBS / 0,2% Gelatine für 10 min.
- Medium entfernen, werden 300 ul / Vertiefung des sekundären Antikörpers, verdünnt in PBS / 0,05% Triton X-100/1% Ziegenserum und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. Sekundärantikörper verwendet werden, in der Tabelle angegebenen Materialien.
- Medium entfernen und waschen 3x mit PBS / 0,2% Gelatine für 10 min.
- Medium entfernen und waschen 3x mit PBS.
- Montieren Sie die Deckgläser auf Glasobjektträgern Zellseite nach unten in einem Tropfen Vectashield. Halten Sie die Folien bei Raumtemperatur über Nacht, um die Montage Medium trocknen lassen, dann speichern Sie sie bei 4 ° C.
- Erwerben Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop oder einem Phasenkontrast Epifluoreszenz ausgestattet. Repräsentative Bilder wurden mit einem Leica SP2 UV konfokalen Mikroskop erfasst.
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Representative Results
Eine illustrierte Flussdiagramm der Mittelhirn-Kultur Schritte ist in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, nach dem Sammeln von E13.5 Embryonen von einer schwangeren Schweizer Maus, Ventralmesenzephalons von der gesamten Embryo seziert. Die isolierten Gehirnfragmente werden nacheinander auf die enzymatische Verdauung und mechanische Dissoziation eingereicht. Dissoziierten Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert, in Kulturmedium resuspendiert und in vorbeschichteten 12 oder 24-Well-Platten ausplattiert. Die Zellen werden bis zu 15 Tage ohne Mediumwechsel beibehalten.
Ein detailliertes Flussdiagramm des ventralen Mesencephalon Präparation entsprechend dem Schritt 3.2 wird in 2 gezeigt. Gestrichelte rote Linien zeigen die 3 Hauptschneidlinien auf einer schematischen Darstellung von E13.5 Mäusehirn (von Prestoz et al angepasst. 30) und Schneiden Schritte veranschaulicht.
Phasenkontrast-Aufnahmen der Kultur nach 1, 4 und 7 Tagen in vitro (DIV) in Abbildung 3 dargestellt. Neuronen schnell entwickeln Erweiterungen und sprießen (3A). Verzweigungen und Verästelungen sind mehr bei DIV4 und DIV7 (3B-3C) erweitert.
Dopaminergen Neuronen durch Immunzytochemie unter Verwendung eines Anti-TH-Antikörper (4A) detektiert. Die Anzahl der TH +-Zellen pro 2,5 cm 2 Deckglas (4B) ausgedrückt. Wir haben nicht die Zahl der TH +-Zellen exprimieren pro sowie die Dichte der Zellen an den Rändern des beschichteten Kunststoff als auch auf der beschichteten Glasdeck viel höher ist, ist, dass in der Mitte auf dem gut. DA-Neuronen (TH +-Zellen) stellen 2-4% des gesamten Zellpopulation auf dem Deckglas. TH-positiven (TH +-Zellen) erscheinen bereits DIV1 und ihre Anzahl steigt schnell auf ein Maximum bei DIV6 erreichen.
Der relative Anteil der Zellen durch Immunfluoreszenzfärbung von Zellen, nämlich DA beurteilth ein Anti-Antikörper-DAT (5A) oder ein Anti-TH-Antikörper (5B) und die gleichzeitige Färbung von neuronalen Zellen, die mit anti-MAP2-Antikörper. Repräsentative Immunfärbung von mehreren in der Kultur vorhandenen neuronalen Populationen ist ebenfalls in 5 gezeigt. GABAergen Neuronen werden unter Verwendung eines Anti-GAD 67-Antikörper (5C) gefärbt und für etwa 50% der Zellen. Serotonergen Neuronen werden mit einem Anti-Serotonin-Antikörper (Figur 5D) erfaßt und weniger als 1% der Zellen in der Kultur. Mesencephalon-Zellkultur enthält auch glutamatergen Neuronen (40% der Kultur) cholinergen Neuronen und Gliazellen selten (etwa 2-3%). Anteil von Gliazellen wird mit saurem Gliafaserprotein (GFAP)-Färbung (5E) bestimmt. Eindeutige Identifizierung Hirn dopaminergen Neuronen kann auch mit spezifischen Markern wie PITX3 oder Foxa2 31,32 erreicht werden.
Höhere Vergrößerung Immunfärbung von mehreren in der Kultur vorhandenen Neuronenpopulationen ist in 6 gezeigt. Dopaminergen Neuronen werden unter Verwendung eines Anti-DAT-Antikörper (6A) festgestellt. DAT-Färbung reflektiert DA Neuron Reifung Staat. DAT Ausdruck beginnt bei DIV3-4. GABAerge Neuronen und serotonergen Neuronen werden unter Verwendung eines Anti-GAD 67-Antikörper (Figur 6B) oder ein Anti-Serotonin-Antikörper (6C) gefärbt sind.
Abbildung 1 veranschaulicht Flussdiagramm des Mittelhirns Kultur. Hauptkultur Schritte werden angezeigt. (A) opfere eine schwangere Schweizer Maus, sammeln E13.5 Embryonen in Petrischalen und waschen Sie sie durch aufeinanderfolgende PBS Bäder. (BC) Unter Dissektionsmikroskop, dissect Ventralmesenzephalons aus dem gesamten Embryonen und legen Sie sie in einem Rohr. (D) Trypsin-EDTA zu den sezierten Gehirn Fragmente und verdauen bei 37 ° C für 15 min. (E) entfernen Trypsin, enthalten-Kulturmedium hinzufügen, Serum und durchzuführen, mechanischen Zell Dissoziation (10 Verreiben Bewegungen, zweimal wiederholt). (F) die Zelle Pellet resuspendieren sie in Serum-freiem Medium mit Hormonen ergänzt und Platte sie in schwemmt 12 oder 24-Well-Platten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen dieser Figur.
Abbildung 2. Detaillierte Ablaufdiagramm des Mittelhirns Dissektion. Dissektion Hauptschritte werden angezeigt. (A) Maus-Embryo an E13.5 nach WiederMoval aus den Uterushörnern. (B) Ohne Enthauptung des Embryos, die Verbrauchs das Gehirn. (C) Schematische Darstellung der embryonalen Gehirn der Maus an E13.5. Rot gestrichelten Linien zeigen an, wo das Gehirn sollten geschnitten werden, um Ventralmesenzephalons isolieren (R, rostral Schnitt; C, Schwanz Schnitt; D, dorsalen Schnitt). Die Kopf Vesikel Telenzephalon, Zwischenhirn, Mittelhirn und Rautenhirn sind in blau, lila, rosa begrenzt, und grau. Aq, Aquädukt; Hypoth, Hypothalamus; LGE, seitlichen Ganglienhügel; LV, lateralen Ventrikel; MFB, mediale Vorderhirnbündel; MGE, medialen Ganglienhügel; sc, Colliculus superior; Thal, Thalamus; VM, ventralen Mittelhirn; 4V vierten Ventrikels (30 angepasst). (D) Schnittlinien angedeutet durch gestrichelte Linien rot auf einem E13.5 Mäusegehirn. (E) Maushirn nach Entfernung der Vordergrund und Hinterhirn Regionen (dh nach der Schnitt R). (F) Gehirn der Maus nach der Entfernung des superior Colliculus (dh nach Kürzungen R und D). (G) Ventrale Ansicht eines isolierten Hirn (dh nach schneidet R, C, D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 3. Phasenkontrast-Aufnahmen der Kultur in verschiedenen Stadien der Entwicklung. (A) DIV1, (B) DIV4, und (C) DIV7 Bilder der gleichen Kultur gezeigt. Die Bilder wurden auf lebende Zellen mit einem inversen Mikroskop erworben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Tyrosinhydroxylase Färbung von dopaminergen Neuronen. (A) DIV8 wurden DA-Neuronen unter Verwendung von Anti-TH-Antikörper nachgewiesen. Offenbarung wurde mit einem 3,3-Diaminobenzidin (DAB)-Kit. Das Bild wurde mit einem inversen Mikroskop erworben. (B) Zahl der TH +-Neuronen in Hirn Kulturen in Abhängigkeit von dem Alter der Kultur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 5 repräsentativer Anteil der Neurone und Astrozyten in der Kultur. Bei DIV4, DA-Neuronen (in Magenta) wurden unter Verwendung von Anti-DAT (A) oder Anti-T erkanntH-Antikörper (B) und GABA-erge Neuronen, die serotonerge Neuronen und Astrozyten (Magenta) wurden unter Verwendung von Anti-GAD 67 (C), Anti-Serotonin-(D) und Anti-GFAP (E)-Antikörpern nachgewiesen. Neuronale Zellen (cyan) wurden mit einem anti-MAP2-Antikörper (AE) angefärbt. Bilder wurden mit einem inversen Mikroskop erworben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Repräsentative Färbung von mehreren Zellpopulationen des Mittelhirns Kultur. Von DAT-Färbung bei DIV9 erkannt (in rot) (A) dopaminergen Neuronen. (B) GABAergen Neuronen durch GAD-67-Färbung bei DIV9 visualisiert (in grün).
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Discussion
Dieses Protokoll stellt die Verfahren und Reagenzien notwendig, eine Primärkultur von Mittelhirnneuronen von der embryonalen Maus und der Immunfluoreszenz-Verfahren zu dopaminergen Neuronen zu erkennen vorzubereiten. Kritische Schritte des Verfahrens sind die Dissektion der Embryonen und die mechanische Dissoziation der Fragmente gesammelt Gehirn. Hochwertige Dissektionsinstrumente hilft, die Technik zu beherrschen Dissektion. DA-Neuronen bilden einen kleinen Teil des Mittelhirns. Dementsprechend sammelt den rechten Teil des ventralen Mesencephalon ist wichtig, um eine Kultur, die 2-4% der DA-Neuronen enthält, zu erhalten. Mechanische Dissoziation sollte sorgfältig und schonend durchgeführt werden. Wenn die Kultur enthält Cluster von nicht getrennten Neuronen, fügen Sie ein oder zwei weitere Schritte Verreiben.
Dieses Protokoll verwendet serumfreien Medium für Neuronenkultur. Beschichtung mit Serum ist jedoch notwendig, um die Befestigung der Zellen zu verbessern. Hormon-Mix, der die ser ersetztähm, ist so definiert, Neuron Wachstum zu ermöglichen und Gliazellen Überleben und die Proliferation zu minimieren. Folglich nicht-neuronalen Zellen repräsentieren etwa 2-3% der Kultur (Quantifizierung mittels GFAP-Färbung). Alternativ können die Kulturen in Gegenwart von Serum mit Zusatz gezüchtet werden, zwei Tage nach dem Aussäen von Cytosin-β-D-arabinofuranosid (ara-C, 5-8 uM), um die Proliferation von Gliazellen 26 zu unterdrücken. Eine weitere Alternative zu der Hormon-Mix ist die Verwendung definierter Medien und Ergänzungen 29.
Diese Technik ist geeignet, um die Immunfluoreszenzfärbung quantitative PCR, second messenger Quantifizierung und verschiedene Arten der Toxikologie / Überleben Seiten ausführen. Es sollte auch möglich sein, elektrophysiologische Untersuchungen an diesen Präparaten 33,34 durchzuführen. Diese Kulturen können Pre-Kandidat neuroprotektive Moleküle zu identifizieren und helfen, DA Neuronen Eigenschaften charakterisieren, während die Minimierung der Anzahl der verwendeten Tiere. Allerdings final Bestätigung, die mit in-vivo-Modelle verlangt wird, als kultivierten Neuronen erhalten keine Eingaben von anderen Hirnregionen, die ihre Reifung stark beeinflussen könnten.
Diese Technik ist nicht weit verbreitet, verglichen mit Ratten-Kulturmodellen trotz seiner ersten Beschreibungen in den frühen achtziger Jahren 16,17. Das Fehlen der Bilder präsentieren die empfindliche Dissektion können Forscher zurückhalten, diese Maus Kultur-Modell zu entwickeln. Jedoch aufgrund der Erzeugung zahlreicher transgene Mausmodelle für neurodegenerative Erkrankungen 25 mit spezifischen Gens oder Ungültig Kennzeichnung bestimmter Neuronentypen sind jetzt von großem Interesse DA Neuronenkulturen aus Maus.
Die Beherrschung dieser Technik ermöglicht die Untersuchung von DA Neuronen von jeder Art von transgenen Maus isoliert und die Störung durch Veränderung der Gene induziert erkunden. Darüber hinaus können diese Kulturen verwendet als Referenzmodelle mit DA-Neuronen aus Stammzellen der Maus abgeleiteten verglichen werdenZellen 35 oder aus induzierten pluripotenten Stammzellen 36.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-Glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1 M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water - Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1,000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1,000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
References
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