Summary
وتم إعداد مقايسة الإنتاجية العالية لفي المختبر النمط الظاهري السالمونيلا أو جمعية البكتيرية الأخرى، والغزو، وتكرارها في الخلايا البلعمية مع القدرة الإنتاجية العالية. وقد استخدمت طريقة لتقييم السالمونيلا خروج المغلوب الجينات سلالات متحولة للتدخلات في التفاعلات المضيف الممرض.
Abstract
أنواع السالمونيلا ومسببات الأمراض الحيوانية المنشأ والأسباب الرئيسية للأمراض التي تنقلها الأغذية في البشر والماشية 1. فهم الآليات الكامنة وراء التفاعلات السالمونيلا -host تعتبر مهمة لتوضيح المرضية الجزيئي للعدوى السالمونيلا. حماية فحص جنتاميسين إلى النمط الظاهري جمعية السالمونيلا، والغزو وتكرارها في الخلايا البلعمية تم تكييفها للسماح الفرز الفائق الإنتاجية لتحديد أدوار المسوخ حذف السالمونيلا التيفية الفأرية الملهبة للالمصلي في التفاعلات المضيف باستخدام RAW 264.7 الضامة الفئران. بموجب هذا البروتوكول، التباين في القياسات وانخفاض كبير مقارنة مع بروتوكول قياسي، لأنه من النوع البري وسلالات متحولة متعددة يمكن اختبارها في صحن الثقافة ونفس في نفس الوقت. استخدام ماصات متعددة يزيد من الإنتاجية ويحسن الدقة. وعلاوة على ذلك، المخاوف المتعلقة باستخدام أقل حوتمت معالجة خلايا الحادي لكل بئر في صحن الثقافة 96 أيضا. هنا، كان يعمل بروتوكول لتعديل في المختبر باستخدام فحص السالمونيلا غزو الخلايا البلعمية بنجاح إلى النمط الظاهري 38 الفردية المسوخ السالمونيلا الحذف للجمعية، والغزو والتكرار داخل الخلايا. يتم عرض الظواهر في المختبر، وقد أكد بعض منها في وقت لاحق أن يكون في الظواهر الحية في نموذج حيواني. وهكذا، فإن تعديل، فحص موحد لجمعية النمط الظاهري السالمونيلا، والغزو وتكرارها في الضامة يمكن استخدامها مع القدرة الإنتاجية العالية على نطاق أوسع لدراسة التفاعلات البكتيرية المضيفة.
Introduction
Nontyphoidal السالمونيلا هي الأسباب الهامة للأمراض المعوية في جميع الفقاريات. السالمونيلا في البشر هو من بين أكبر الأمراض التي تنقلها الأغذية البكتيرية 1. ويتحقق توصيف الآليات الجزيئية التي تدعم تفاعلات السالمونيلا مع المضيفين الحيوان بشكل رئيسي من خلال دراسة السالمونيلا التيفية الفأرية الملهبة للالمصلي (STM) في نماذج زراعة الأنسجة الحيوانية والعدوى. سوف اكتساب رؤى في التفاعلات STM-المضيف تساعدنا على فهم كيفية السالمونيلا البقاء والنمو داخل الخلايا المضيفة. التحدي الأول في دراسة هذه التفاعلات هو تحديد العديد من العوامل المشاركة ممكن من كل من المضيف والممرض، ولكن يتم عرقلة هذه المساعي إلى حد كبير من قبل صعوبات كبيرة في التعامل مع اثنين من النظم البيولوجية المعقدة المستقلة في وقت واحد، أي المضيف والسالمونيلا، تحت الظروف الفسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، repert كبيرoire من السالمونيلا والجينات المضيف المحتمل ترميز العوامل التي تدخل في التفاعلات البيولوجية المضيفة تتطلب منصة عالية الإنتاجية لمواجهة هذا التحدي.
وتعديل، فحص موحد لجمعية النمط الظاهري السالمونيلا، والغزو وتكرارها في الضامة مع القدرة الإنتاجية العالية وضعت لدراسة مجموعة كبيرة من الجينات المرجح الانخراط في التفاعلات السالمونيلا -host. وقد وضعت حماية فحص جنتاميسين في عام 1973 2، ولكن لأول مرة وصف دقيق من قبل Elsinghorst في عام 1994 3،4. أصبح الآن هو أداة موحدة لدراسة العديد من مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا خارج الجسم، بما في ذلك السالمونيلا 5،6. تجنب البكتيريا المنضوية التعرض للقتل من قبل بعض المضادات الحيوية، مثل جنتاميسين، التي لا يمكن ان تخترق الخلايا حقيقية النواة 3. من خلال الاستفادة من هذه الظاهرة، وحماية جنتاميسين فحص يقيس بقاء ونمو الخلايا باcterial مسببات الأمراض. ثلاثة أحداث أثناء العدوى، أي ارتباط مع الخلايا حقيقية النواة، والغزو والتكرار، يمكن تقييم لمسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا استنادا إلى الفاصل الزمني بين الإصابة والعلاج جنتاميسين، ومزيد من الحضانة (الشكل 1). خطوط الخلايا حقيقية النواة توفر بيئة الفسيولوجية التي هي أقل تعقيدا من النماذج الحيوانية ذات الصلة للدراسات التفاعل المضيف الممرض.
حماية فحص جنتاميسين هو منصة مناسبة لدراسة التفاعلات STM-المضيف، ولكن الفحص القياسية في صحن الثقافة 24 جيدا لديه قدرة منخفضة الإنتاجية. وحدد التحليل الحسابي في الجسم الحي من مجموعات البيانات 149 منتجات السالمونيلا الجين الذي من المتوقع أن تتفاعل مع ما يقرب من 300 منتج الجين المضيف (بيانات غير منشورة). ليس لديها معيار جنتاميسين الحماية فحص القدرة على النمط الظاهري هذا العدد من المسوخ بكفاءة.
في additأيون، وحماية فحص جنتاميسين يمكن كشف نظريا غزو حتى بكتيريا واحد. بسبب هذه الحساسية المتأصلة، البيانات الخام عرضة للالفروق الفنية عندما كرر في أوقات مختلفة. الضوابط الداخلية وعرض البيانات النسبي بعد تطبيع ضرورية لتفسير مغزى النتائج. ونظرا لهذه الاعتبارات، تم وضع تعديل، موحد جنتاميسين الحماية فحص لتعزيز قدرة الاختبار وزيادة الدقة.
بروتوكول التالية هي مفصلة وموضحة لإجراء تعديل مقايسة حماية الجنتاميسين باستخدام أطباق ثقافة 96 جيدا والبلاعم RAW264.7 خط الخلية الفئران. مقارنة بروتوكول قياسي في أطباق ثقافة 24 جيدا، وبروتوكول تعديل والمزايا التالية: 1) عن طريق أطباق ثقافة 96 جيد يسمح ما يصل الى 10 سلالات متحولة مختلفة ليتم phenotyped بما في ذلك الضوابط الإيجابية والسلبية الداخلية مع قوة إحصائية كافية.2) يتم تخفيض التباين في النتائج بشكل كبير، لأنه يتم اختبار سلالات متحولة في صحن الثقافة نفسها وفي نفس الوقت؛ 3) استخدام ماصات متعددة القنوات يزيد الإنتاجية مع تقليل عامل التعب. وأخيرا، مقارنة مع 24 أطباق ثقافة جيدا، والتعامل مع مخاوف من خلايا أقل المضيفة لكل بئر في صحن الثقافة 96 جيدا من خلال تحسين وتوحيد بروتوكول.
وباختصار، فإن تعديل، فحص موحد لفي المختبر النمط الظاهري السالمونيلا أو جمعية البكتيرية الأخرى، والغزو وتكرارها في الخلايا البلعمية يزيد الدقة ويحقق القدرة الإنتاجية العالية مع خفض عامل التعب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الفئران بلعم RAW264.7 خلية ثقافة
- النمو المنخفض مرور عدد خلايا البلاعم الفئران، RAW264.7 (و® عدد ATCC، TIB-71) في T-75 خلية قارورة الثقافة تنفيس غطاء المرشح في Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 0.5٪ NaHCO 3، و 1٪ 100X الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) عند 37 درجة مئوية، في 5٪ CO 2 الحاضنة.
- خلايا مرة واحدة تصل إلى نقطة التقاء 60-80٪ في قارورة، واستخدام مكشطة خلية لحصاد الخلايا، وعدد الخلايا في عدادة الكريات وحساب تركيز الخلية.
- resuspend الخلايا ويخفف من تركيز الخلية إلى 2.5 × 10 5 / مل الطازجة DMEM في خلية ثقافة المتوسط. استخدام ماصات متعددة لوحة 200 ميكرولتر من DMEM خلية ثقافة المتوسط تحتوي على 5 × 10 4 الخلايا في كل بئر من 96 لوحات جيدا ثقافة الخلية.
- لوحة أربعة آبار من كل سلالة السالمونيلا. تشكيل ثلاث لوحات منفصلة لمجموعة واحدةمن أكلة خلايا الغزو الفحص، ووضع علامة عليها مع "جمعية"، "الغزو" و "تكرار"، على التوالي.
- وضع لوحات في 5٪ CO 2 الحاضنة عند 37 درجة مئوية على السماح للخلايا البلاعم لنعلق على الجزء السفلي من الآبار.
2. إعداد السالمونيلا من نوع البرية والمسوخ
- في نفس اليوم من إعداد خلايا البلاعم RAW264.7، واختيار واحدة من المستعمرات البرية من نوع (WT) الملهبة السالمونيلا التيفية الفأرية المصلي 14028s، DinvA متحولة، DphoP متحولة، واختبار سلالات متحولة المطلوب، والثقافة لها في لوريا، Bertani ( LB) مرق تستكمل مع المضادات الحيوية حسب الاقتضاء. استخدام كل مجموعة من الخلايا البلعمية المقايسات الغزو لاختبار ما يصل إلى 10 سلالات متحولة (DinvA متحولة وDphoP متحولة لا عيب في غزو الخلايا وتكرارها، على التوالي).
- تنمو البكتيريا لمدة 14 ساعة عند 37 درجة مئوية مع لياليhaking في 220 دورة في الدقيقة في كل 5 مل من مرق LB في توج فضفاضة 14 مل البولي بروبلين في أنبوب أسفل مستديرة. LB مرق يحتوي على المضادات الحيوية المناسبة، في حالتنا، فإن معظم سلالات متحولة مقاومة لكاناميسين، 50 ميكروغرام / مل
- في اليوم التالي، ثقافة فرعية لكل من على ثقافات سلالات السالمونيلا في سهل 5 مل من مرق LB في نسبة 01:50 ل4 ساعة إضافية مع اهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة.
- قراءة OD 600 قيم كل ثقافة البكتيرية على طيفي، وكل قراءة أن يتراوح 0،6-1،2 لتحسين السالمونيلا جزيرة المرضية-1 النوع الثالث إفراز نظام (SPI-1 TTSS) التعبير الجيني للغزو.
- استخدام الصيغة من 1 OD 600 = 7.5 × 10 8 خلية / مل لتقدير تركيز البكتيريا، ثم تمييع البكتيريا إلى تركيز 5 × 10 6 خلية / مل في DMEM الطازجة خلية ثقافة المتوسط.
3. الغزو الفحص في 96 لوحة جيدا الثقافة
- إزالة ثلاثة سل 96 جيدلوحات ثقافة لتر من الحاضنة CO 2 ويغسل مرة واحدة كل جيدا مع 200 ميكرولتر من العازلة 1X PBS.
- بعد غسل وإزالة كاملة من برنامج تلفزيوني، إضافة 200 ميكرولتر البكتيريا في DMEM المتوسطة (انظر أعلاه) في كل بئر. هذه النتائج في 1 × 10 6 خلايا السالمونيلا في كل جيدا وتعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 20: 1.
- أجهزة الطرد المركزي لوحات في 1،000 x ج في الناقل مغلق لمدة 10 دقيقة، ثم استبدال لوحات (الساعة صفر) في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 30 دقيقة. لكل سلالة، وإنشاء ما لا يقل عن أربعة آبار مكررة.
- بعد 30 دقيقة، وإزالة لوحات من الحاضنة ويغسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من 1X PBS لإزالة البكتيريا غير المصاحب.
- بعد الغسيل، حفظ لوحة المسمى مع "جمعية" لمزيد من العلاج. إضافة 200 ميكرولتر من DMEM المتوسط تحتوي على 100 ميكروغرام / مل جنتاميسين إلى كل بئر من لوحات تحمل علامة "الغزو" و "النسخ" من أجل رس قتل السالمونيلا خارج الخلية. العودة لوحات إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة لساعة إضافية.
- حفظ بئر واحدة من كل سلالة المصاب لتسجيل عدد خلايا البلاعم، علاج بقية الآبار على لوحة "جمعية" مع 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة. فإن الحل تريتون ليز خلايا البلاعم والافراج عن السالمونيلا المرتبطة بها.
- حصاد السالمونيلا من كل بئر ووضعها في أنابيب 1.5 مل إيبندورف. أداء ثلاث التخفيفات المسلسل 10 أضعاف مع 900μl 1X PBS على عينات تحصد من كل بئر، يتم تنفيذ دوامة بين كل التخفيف.
- لوحة التخفيف الثالث، 10 -3، على أي LB (WT) أو LB اساسه (المسوخ) لوحات. تسمية لوحات مع السالمونيلا الاسم المناسب سلالة، عدد التخفيف، وأشر الوقت والتاريخ.
- بعد vortexing لأنبوب تخفيف الثالث، الاستغناء عينة 10 ميكرولتر على سطح آغار وتكرار وعصرنا لما مجموعه 5 قطرات. تأكد من مساحة قطرات ميكرولتر 10 بالتساوي على خمس لوحات طبق بيتري 7.
- بعد قطرات نقع في آغار، وتحويل لوحات مرارا واحتضان ليلا 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة.
- علاج الآبار حفظها لفرز الضامة مع 150 ميكرولتر 1XPBS تحتوي على 0.25٪ التربسين-EDTA لمدة 10 دقيقة.
- بعد trypsinization، الضامة المكان إلى 1.5 مل أنابيب إيبندورف وتعاملهم مع 50 ميكرولتر من FBS لتحييد الحل التربسين / EDTA، وصمة عار الخلايا مع 0.4٪ التريبان الأزرق ويسجل لهم من خلال استخدام عدادة الكريات.
- عندما انقضت حضانة ساعة واحدة، وإزالة "الغزو" وألواح "التكرار" من حاضنة CO 2، وغسل كل جانب "الخطوة 3.4".
- حفظ وحة "الغزو" لمزيد من العلاج "الخطوة 3،6-3،12".
- إضافة 200 ميكرولتر من DMEM المتوسط تحتوي على جنتاميسين 10 ميكروغرام / مل لو"تكرار" لوحة للحفاظ على إزالة السالمونيلا خارج الخلية في المتوسط. العودة لوحة إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 حاضنة ل22.5 ساعة إضافية.
- في اليوم التالي، وإزالة "تكرار" لوحة من 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 الحاضنة، ويغسل كل جانب "الخطوة 3.4" ويعاملهم "الخطوة 3،6-3،12".
- أخيرا، وإزالة لوحات أجار بعد الحضانة بين عشية وضحاها في الحاضنة 37 درجة مئوية ويسجل عدد من المستعمرات البكتيرية.
- وينبغي أن يكون توزيع مستعمرة جيد بين 10 و 100 المستعمرات، كل بقعة يحتوي على ما يقرب من 2 إلى 20 المستعمرات، سيكون من الصعب أن يسجل إذا كان هناك أكثر من 20 مستعمرات في بقعة واحدة. إذا كان عدد منخفضة جدا أو مرتفعة جدا، replate العينة مع 10 أضعاف التخفيفات أعلى أو أقل حسب الحاجة.
تحليل البيانات 4.
- حساب (وحدات تشكيل مستعمرة لكل مل) كفو من كل لوحة على أساس الطلاءحجم وعامل التخفيف.
- التأكد من عدد السالمونيلا في البلاعم من خلال عدد خلايا البلاعم المسجلة من كل سلالة.
- حساب سيلة هندسية من كفو في البلاعم من ثلاثة على الأقل من تجارب مستقلة لجمعية الخلايا، والغزو أو تكرار، على التوالي، وتطبيع أبعد إلى WT للقيمة النسبية.
- تحليل البيانات للجمعية، والغزو، والتكرار من قبل الطالب ر -test على التوالي، وذلك بمقارنة كل سلالة لWT، وتحديد الدلالة الإحصائية من قبل القيمة ص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
رؤية النتائج تمثيلية (الشكل 2) بعد يتم رسم البيانات على أساس تعديل أكلة غزو الخلايا الفحص. وتشمل البيانات خمس سلالات مختلفة، WT، ΔinvA، ΔphoP، متحولة A، B. ومتحولة Δ invA، والمعروف ليكون معيبا للغزو، وΔphoP المعروف أن تكون معيبة للنسخ المتماثل 8، وتستخدم والضوابط الإيجابية لتقييم صلاحية التجريبية . في الواقع، في مقايسة تعديل الغزو، والمنضوية المسخ ΔinvA سيئة من قبل RAW264.7 كما أن خلايا متحولة ΔphoP تخفيض النسخ المتماثل بعد 24 ساعة. المسوخ A و B هي سلالات تمثيلية يعاير باستخدام هذا البروتوكول. متحولة ويظهر انخفاض كبير في التكرار (الشكل 2)، على غرار متحولة ΔphoP. ومن المثير للاهتمام، ويظهر متحولة B زيادة كبيرة في النسخ المتماثل (الشكل 2). تشير البيانات بوضوح كلا من تلك مؤتةغيرت اليلة الظواهر عن الغزو والبقاء على قيد الحياة في الضامة.
باختصار، كانت العديد من المسوخ الحذف السالمونيلا phenotyped فردي لتورطهم في جمعية البكتيرية، والغزو، وتكرارها في الضامة RAW264.7 باستخدام مقايسة الغزو تعديل. عشرين من 38 المسوخ اختبار حتى الآن ظهور عيوب كبيرة في متغير ولكن العدوى البكتيرية الضامة (الجدول 1)، وبالتالي فإن فحص في المختبر لتعديل النمط الظاهري السالمونيلا أو جمعية البكتيرية الأخرى، والغزو وتكرارها في الخلايا البلعمية يزيد من الدقة والقدرة الإنتاجية العالية في حين الحد من عامل التعب.
الرقم 1. مخطط العامل الإنتاجية العالية الفحص. فحص حماية جنتاميسين هو موديأدارت أذنا صماء، موحدة إلى النمط الظاهري العديد من المسوخ السالمونيلا في وقت واحد في لوحات 96 جيدا. يتم تنفيذ الخطوات الرئيسية على النحو الوارد أعلاه لدراسة تكوين الجمعيات، والغزو وتكرار السالمونيلا في الخلايا RAW264.7 البلاعم.
. الشكل 2. ممثل النتائج يتم إجراء فحوصات عالية الإنتاجية للسلالات السالمونيلا - WT، ΔinvA، ΔphoP، متحولة A، B ومتحولة - في خلايا البلاعم RAW264.7. لكل سلالة، ويتم الحصول على وسائل هندسية كفو في البلاعم من ثلاث تجارب مستقلة لجمعية الخلايا، والغزو والتكرار، على التوالي، والتي هي أبعد تطبيع للWT والتمثيل البياني يظهر. أشرطة الخطأ دلالة على الخطأ المعياري، ودلالة إحصائية من كل سلالة الإشارةلWT كان يحددها الطالب ر -test. * P <0.05. وزارة الداخلية = 20.
وphenotyped الجدول 1. الظواهر الجينات مرشح. المرشح المسوخ السالمونيلا من تعديل، فحص موحد للجمعية، والغزو والتكرار في خلايا البلاعم RAW264.7. 20 المسوخ جود عيوب كبيرة في تكوين الجمعيات، الغزو و / أو النسخ المتماثل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم استخدام الحماية فحص جنتاميسين على نطاق واسع لدراسة الغزو وتكرار مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا داخل الخلية المضيفة، ومن خصوصا أداة البيولوجية الهامة لدراسة مسببات الأمراض مثل السالمونيلا، التي الغزو هي الخطوة شرطا مسبقا لإقامة العدوى 1. يتم تطبيق معيار فحص السالمونيلا في حماية جنتاميسين مجتمع البحوث في 24 طبق جيدا الثقافة 5. على الرغم من أن استخدام 48 أو حتى 96 لوحات جيدا نوقشت قبل للقدرة الإنتاجية العالية 9، وقد تجلى أي بروتوكول الفعلي بالتفصيل ويعمل بنجاح لاختبار مجموعة من المسوخ البكتيرية. هنا، تم تطوير وتعديل بروتوكول موحد لاستخدام أطباق ثقافة 96 جيدا إلى النمط الظاهري المسوخ السالمونيلا. والجدير بالذكر، تم اختبار فقط هذا البروتوكول لالسالمونيلا والخلايا البلعمية، وبالتالي فإن التعديلات والأمثل أن يكون من الواضح الضروري مع آلات موسيقية أخرى ص البكتيريا أو خلايا المضيف.
هناك العديد من المزايا لتعديل جنتاميسين الحماية لفحص النمط الظاهري السالمونيلا الجمعيات، وتكرار الغزو في الخلايا البلعمية. أولا، يتيح ال 96 جيدا شكل صحن الثقافة الاختبار عالية الإنتاجية والتحليل، يمكن اختبار ما يصل إلى 10 سلالة مختلفة في وقت واحد مع تكرار كافية التحليل الإحصائي والضوابط الداخلية. ثانيا، بسبب حساسية عالية من الفحص، قد تكون البيانات الخام من حماية الفحص عرضة للجنتاميسين الفروق الفنية عندما كرر في أوقات مختلفة. بموجب هذا البروتوكول المعدل، وphenotyped عدة سلالات في ظل نفس الظروف طوال العملية، والحد من التباين. وأخيرا، استخدام ماصات متعددة يزيد من الكفاءة ويقلل من عامل التعب. البروتوكول الجديد يسر phenotyping السريع العديد من المسوخ السالمونيلا في حين توليد كميات كبيرة من الكمية والبيانات استنساخه.
ove_content "> أحد الشواغل في عمل المقايسات الغزو في أطباق ثقافة 96 جيدا هو أن الآبار تحتوي على عدد أقل من خلايا حقيقية النواة، وبسبب هذه الكميات يمكن أن يتعرض للخطر. ولمعالجة هذا القلق، تم تنفيذ سلسلة كبيرة من المقايسات لتحسين التكاثر. الأولى ، كانت الضامة RAW264.7 المستخدمة في هذا البروتوكول أقل من 20 مقاطع، وكانت المصنفة الخلايا في صحن الثقافة 96 جيدا بين عشية وضحاها قبل الفحص ثانيا، تم تخفيض وزارة الداخلية إلى 20: 1 من تستخدم بانتظام أو 50: 1 100: 1 وزارة الداخلية 20: 1 يضمن أن 99٪ من الضامة سوف يتعرض للإصابة قبل 10 إلى 30 البكتيريا وتحسب على توزيع بواسون وفقا لنقطة مؤشر ستوكاستيك ويعتقد أنه لا يقتصر على العوامل البيولوجية والضرر الخلوي يمكن أن يكون هتفت من البكتيريا الساحقة الاتصالات المادية 10 بالإضافة إلى ذلك، الغزو السالمونيلا يمكن أن تحفز الخلايا الضامة، الذي يرتبط بشكل إيجابي مع وزارة الداخلية ارتفاع 11 باستخدام وزارة الداخلية من 20: 1، damag الخلويتم العثور الإلكترونية ليكون ضئيلا للغاية، ويفترض بسبب محدودية البكتيريا بلعم الاتصال الجسدي. ثالثا، تم تحسين الفاصل الزمني حضانة للنقاط زمنية ثلاث: جمعية لمدة 30 دقيقة مع أي جنتاميسين. الغزو لمدة 1 ساعة إضافية (المجموع 1.5 ساعة بعد العدوى) مع 100 ميكروغرام / مل جنتاميسين. النسخ المتماثل ل22.5 ساعة إضافية (المجموع 24 ساعة بعد الإصابة) مع 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين. في اختبار لدينا، 5 ميكروغرام / مل جنتاميسين يكفي لقتل جميع السالمونيلا في DMEM خالية من الخلايا مع 10٪ مصل بقري جنيني (بيانات غير منشورة)، وبالتالي، 100 ميكروغرام / مل يتوقع جنتاميسين لضمان القتل السريع و10 ز / مل جنتاميسين شأنه الحفاظ على إزالة البكتيريا خارج الخلية في خلية ثقافة المتوسط لحضانة بين عشية وضحاها في الجسم الحي، يستغرق حوالي 15 دقيقة للكشف عن الأنسجة السالمونيلا المرتبطة العجل الأمعاء الخلايا الظهارية 12،13؛ في المختبر، ويقال 30 دقيقة الحضانة ل تكون كافية لمن النوع البريهذا البروتوكول يستخدم الخلايا البلعمية بدلا من الخلايا الظهارية لهذا الاختبارفي شكل أصغر 96 جيدا. في دراسة المرضية من السالمونيلا، خط الخلايا الظهارية الأكثر استخداما هو كاتشو-2، والمستمدة من غير متجانسة الإنسان غدية القولون الظهارية. باستخدام المنتظم 24 طبق جيدا الثقافة اختبار الغزو مع كاتشو-2 الخلايا، والعدد الفعلي للبكتيريا تعافى في كل نقطة زمنية، وخاصة نقطة زمنية 22.5 ساعة للنسخ المتماثل phenotyping، هو أقل بكثير مما كانت عليه عندما الخلايا البلعمية، مثل J774 أو RAW264 0.7 الضامة، وتستخدم (بيانات غير منشورة). وهكذا، وهذا يجعل الأمر أكثر صعوبة لأداء phenotyping باستخدام صحن الثقافة 96 بشكل جيد عند كل لديه أيضا عدد أقل من الخلايا المضيفة. ومن المعروف أن خلايا البلاعم يمكن أن يزج بنشاط البكتيريا، مما قد يؤدي إلى المزيد من الجراثيم التي يجري المنضوية، وأيضا لا يمكن أن يحكم بها على ما يبدو أن تكرار السالمونيلا أكثر ببطء في كاتشو-2 الخلايا. وترتبط قدرة السالمونيلا البقاء على قيد الحياة وتكرارها داخل خلايا البلاعم إلى الأدوار الرئيسية في التسبب فيالسالمونيلا، أي مما اثار ردود التهاب المضيف ضخمة وتسهيل العدوى النظامية 1. نحن العاملين أساسا حماية جنتاميسين فحص تعديل والنمط الظاهري موحد لمجموعة كبيرة من أنابيب حساب الجينات التي اختيرت لالتعاقدات المحتملة في التفاعلات المضيف. اتضح تم phenotyped ما يقرب من 50٪ من المسوخ السالمونيلا والجينات المتضمنة في النسخ المتماثل بين الخلايا في الخلايا البلعمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وقد أيد هذا المشروع جزئيا من خلال منحة للمعاهد الوطنية للصحة NIAID (لAJB وLGA، R01 AI076246). وأيد جمع متحولة السالمونيلا جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح (لMM، U01 A152237-05، AI07397-01 R01، R01 R01 AI039557-11 وAI075093-01)، وذلك جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح (لHAP، R21 AI083964-01، 1R0 1AI083646-01، 1R56AI077645، R01 AI075093). نشكر ستيفن Prowollik لطلاء طبق الأصل، والتأكيد على المسوخ في المجموعة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 Cell culture flask vented filter cap | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100x Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-well Cell culture plate | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH 7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin solution | Sigma | K0254 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 |
References
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
- Elsinghorst, E. A.
- Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).
- Behlau, I., Miller, S. I. A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells. J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).
- Hueck, C. J., et al. Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins. Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).
- Steele-Mortimer, O. Infection of epithelial cells with Salmonella enterica. Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).
- Foster, J. W., Spector, M. P. How Salmonella survive against the odds. Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).
- Molinari, G., et al. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium. Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Lawhon, S. D., et al. Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach. PLoS One. 6, e26869 (2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion. Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).
