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Immunology and Infection

High-throughput Assay per Fenotipo Published: August 11, 2014 doi: 10.3791/51759
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 4, 1
1Department of Veterinary Pathobiology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University, 2Department of Microbial and Molecular Pathogenesis, College of Medicine, Texas A&M University System Health Science Center, 3University of California, Irvine, 4Department of Medical Microbiology & Immunology, School of Medicine, University of California, Davis

Summary

Un test high-throughput per fenotipo Salmonella in vitro o di altra associazione batterica, l'invasione, e la replica in fagociti con capacità high-throughput è stato sviluppato. Il metodo è stato impiegato per valutare Salmonella gene knockout ceppi mutanti per il loro coinvolgimento in interazioni ospite-patogeno.

Abstract

Le specie Salmonella sono agenti patogeni zoonotici e principali cause di malattie di origine alimentare negli esseri umani e bestiame 1. La comprensione dei meccanismi alla base delle interazioni Salmonella -host sono importanti per chiarire la patogenesi molecolare di infezione da Salmonella. Il dosaggio di protezione gentamicina a fenotipo associazione Salmonella, l'invasione e la replica in fagociti è stato adattato per consentire lo screening high-throughput per definire i ruoli dei mutanti di delezione di Salmonella enterica sierotipo Typhimurium nelle interazioni host utilizzando RAW 264.7 macrofagi murini. Nell'ambito di questo protocollo, la varianza nelle misurazioni è significativamente ridotto rispetto al protocollo standard, perché wild-type e più ceppi mutanti possono essere testati nello stesso piatto di cultura e, allo stesso tempo. L'uso di pipette multicanale aumenta la produttività e migliora la precisione. Inoltre, le preoccupazioni relative a usare meno host cellule per pozzetto in 96-ben piatto cultura sono stati affrontati. Qui, il protocollo della vitro Salmonella invasione test modificati utilizzando fagociti è stato impiegato con successo per fenotipo 38 singoli mutanti di delezione Salmonella per l'associazione, l'invasione e la replica intracellulare. I fenotipi in vitro sono presentati, alcuni dei quali sono stati successivamente confermato di avere in fenotipi vivo in un modello animale. Pertanto, la modifica, test standardizzato per fenotipo Salmonella associazione, l'invasione e la replica nei macrofagi con capacità high-throughput potrebbe essere utilizzato più ampiamente per studiare le interazioni batteri-ospite.

Introduction

Salmonella non tifoidi sono importanti cause di malattie enteriche in tutti i vertebrati. Salmonellosi nell'uomo è tra le prime malattie di origine alimentare batterica 1. Caratterizzazione dei meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni di Salmonella con i loro host di origine animale è ottenuta principalmente attraverso lo studio di Salmonella enterica sierotipo Typhimurium (STM) in colture di tessuti e modelli animali di infezione. Guadagnando intuizioni nelle interazioni STM-ospite ci aiuterà a capire come Salmonella sopravvivere e crescere all'interno di cellule ospiti. La prima sfida nello studio di queste interazioni è quello di identificare il maggior numero possibile di fattori che partecipano sia da ospite e patogeno, ma questi sforzi sono in gran parte ostacolato dalle notevoli difficoltà di trattare con due sistemi biologici complessi indipendenti simultaneamente, vale a dire, di accoglienza e di Salmonella, in condizioni fisiologiche. Inoltre, la grande repertoOire di Salmonella e geni ospitanti potenzialmente codificanti fattori coinvolti in interazioni ospite necessitano di high-throughput piattaforma biologico per affrontare questa sfida.

Un modificato, test standardizzato per fenotipo associazione Salmonella, l'invasione e la replica nei macrofagi con capacità high-throughput è stato sviluppato per esaminare un ampio set di geni probabilmente impegnati in interazioni Salmonella -host. Il saggio di protezione gentamicina è stato sviluppato nel 1973 2, ma è stato accuratamente descritto da Elsinghorst nel 1994 3,4. Ora è diventato uno strumento standard per lo studio di molti batteri patogeni intracellulari ex vivo, tra cui Salmonella 5,6. Batteri internalizzati evitare di essere ucciso da alcuni antibiotici, come la gentamicina, che non possono penetrare le cellule eucariotiche 3. Sfruttando questo fenomeno, il saggio protezione Gentamicina misura la sopravvivenza e la crescita di ba intracellularepatogeni cterial. Tre eventi durante l'infezione, cioè, l'associazione con le cellule eucarioti, l'invasione e la replica, possono essere valutati per batteri patogeni intracellulari in base l'intervallo di tempo tra l'infezione, il trattamento Gentamicina, e in seguito di incubazione (Figura 1). Linee di cellule eucariotiche forniscono un ambiente fisiologico che è meno complessa di modelli animali per studi di interazione ospite-patogeno.

Il test di protezione gentamicina è una piattaforma appropriata per studiare le interazioni STM-ospite, ma il test standard in un piatto di coltura 24 pozzetti num bassa velocità. Analisi computazionale dei set di dati in vivo identificato 149 prodotti genici Salmonella che si prevede di interagire con circa 300 prodotti genici ospite (dati non pubblicati). Il test di protezione gentamicina standard non ha la capacità di fenotipo questo numero di mutanti in modo efficiente.

In Additione, il saggio di protezione Gentamicina può teoricamente rilevare l'invasione di anche un singolo batterio. A causa di questa sensibilità intrinseca, i dati grezzi sono suscettibili di variazioni tecniche quando ripetuto in tempi diversi. I controlli interni e la presentazione dei dati relativi dopo la normalizzazione sono essenziali per l'interpretazione significativa dei risultati. Alla luce di queste considerazioni, una versione modificata, standardizzato test di protezione gentamicina è stato sviluppato per migliorare la capacità di test e aumentare la precisione.

Il protocollo seguito è dettagliata e illustrata per eseguire il test di protezione Gentamicina modificato utilizzando 96 pozzetti piatti della cultura e la linea cellulare di macrofagi RAW264.7 murino. Rispetto al protocollo standard a 24 pozzetti piastre di coltura, il protocollo modificato presenta i seguenti vantaggi: 1) Uso di 96 pozzetti piatti della cultura permette fino a 10 diversi ceppi mutanti per essere phenotyped compresi i controlli interni positivi e negativi con potenza statistica sufficiente;2) La varianza dei risultati è notevolmente ridotta, in quanto i ceppi mutanti vengono testate nello stesso piatto cultura e allo stesso tempo; 3) L'uso di pipette multicanale aumenta il throughput riducendo la fatica dell'operatore. Infine, il confronto a 24 pozzetti piastre di coltura, le preoccupazioni di meno cellule ospiti per pozzetto a 96-ben piatto cultura sono state affrontate attraverso l'ottimizzazione e la standardizzazione del protocollo.

In sintesi, la modifica, test standardizzato per vitro fenotipo Salmonella o altra associazione batterica, l'invasione e la replica in fagociti aumenta la precisione e raggiunge la capacità high-throughput riducendo la fatica dell'operatore.

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Protocol

1 murino macrofagi RAW264.7 Colture Cellulari

  1. Crescere basso numero passaggio macrofagi murini, RAW264.7 (Il numero ATCC ®, TIB-71) in una coltura cellulare pallone ventilato cap T-75 filtro Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) , 0,5% NaHCO 3 e 1% 100x non essenziali aminoacidi (NEAA) a 37 ° C, in un incubatore CO 2 5%.
  2. Una volta che le cellule raggiungono una confluenza del 60-80% nel pallone, utilizzare un raschietto cella per raccogliere le cellule, e contare le cellule in un emocitometro e calcolare la concentrazione cellulare.
  3. Risospendere le cellule e diluire la concentrazione cellulare in 2,5 x 10 5 / ml in mezzo di coltura cellulare fresca DMEM. Utilizzare pipette multicanale al piatto 200 ml di mezzo di coltura cellulare DMEM contenente 5 x 10 4 cellule in ciascun pozzetto di 96 pozzetti piastre di coltura cellulare.
  4. Piatto quattro pozzi di ogni ceppo Salmonella. Impostare tre piatti separati per un setdi phagocytic dosaggio cellule invasione, e contrassegnarli con "associazione", "invasione" e "replica", rispettivamente.
  5. Posizionare le piastre del 5% di CO 2 incubatore a 37 ° C ON per consentire alle cellule macrofagi per attaccare al fondo dei pozzetti.

2 Preparazione di Salmonella wild-type e mutanti

  1. Lo stesso giorno della preparazione delle cellule macrofagi RAW264.7, raccogliere singole colonie di wild-type (WT) Salmonella enterica sierotipo Typhimurium 14028s, DinvA mutanti, DphoP mutanti, e ceppi mutanti di prova desiderati, e la cultura li in Luria-Bertani ( LB) brodo integrato con antibiotici come appropriato. Usare ogni set dei fagociti saggi cellule invasione di testare fino a 10 ceppi mutanti (DinvA mutante e DphoP mutanti sono difettosi in invasione e replicazione intracellulare, rispettivamente).
  2. Crescere i batteri per 14 ore a 37 ° C con sHaking a 220 rpm in 5 ml di brodo LB in vagamente 14 ml con tappo in polipropilene in una provetta a fondo tondo. LB brodo contiene antibiotici appropriati, nel nostro caso, la maggior parte dei ceppi mutanti sono resistenti alla kanamicina, 50 mg / ml
  3. Il giorno successivo, Subculture ciascuna delle ON colture di ceppi di Salmonella in pianura 5 ml di brodo LB in un rapporto di 1:50 per un ulteriore 4 ore con agitazione a 220 rpm.
  4. Leggi OD 600 valori di ogni coltura batterica su uno spettrofotometro, e ogni lettura dovrebbe variare 0,6-1,2 per ottimizzare Salmonella patogenicità isola-1 di tipo III, sistema di secrezione (SPI-1 TTSS) l'espressione del gene per l'invasione.
  5. Utilizzare la formula di 1 OD 600 = 7,5 x 10 8 UFC / ml di valutare la concentrazione batterica, poi diluire batteri ad una concentrazione di 5 x 10 6 UFC / ml in mezzo di coltura cellulare fresca DMEM.

3 Invasion Assay in 96 pozzetti Cultura Piatto

  1. Rimuovere le tre cel 96 pozzettipiastre di l di coltura dalla CO 2 incubatore e lavare i pozzetti una volta con 200 ml di 1x tampone PBS.
  2. Dopo il lavaggio e la rimozione completa di PBS, aggiungere 200 microlitri batteri in terreno DMEM (vedi sopra) in ogni pozzetto. Ciò si traduce in 1 x 10 6 cellule di Salmonella in ciascun molteplicità bene e di infezione (MOI) di 20: 1.
  3. Centrifugare le piastre a 1000 xg in un vettore sigillata per 10 minuti, quindi sostituire piastre (tempo zero) a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 30 min. Per ogni ceppo, istituito almeno quattro pozzetti in duplicato.
  4. Dopo 30 minuti, togliere le piastre dal termostato e lavare tre volte con 200 ml di PBS 1x per rimuovere i batteri non associati.
  5. Dopo il lavaggio, salvare la piastra etichettato con "associazione" per un ulteriore trattamento. Aggiungere 200 ml di terreno DMEM contenente 100 mg / ml di gentamicina in ogni pozzetto delle piastre contrassegnati con "invasione" e "replica" per to uccidere la salmonella extracellulare. Riportare le piastre a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per un ora supplementare.
  6. Salvare un bene da ogni ceppo infetto per registrare la conta delle cellule macrofagi, trattare il resto dei pozzi sul piatto "associazione" con 200 ml di 1x PBS contenente 1% Triton X-100 per 10 min. La soluzione Triton lisare cellule macrofagi e rilasciare Salmonella associata.
  7. Harvest Salmonella da ogni pozzetto e metterli in 1,5 ml provette Eppendorf. Eseguire tre 10 diluizioni seriali di piegatura con 900μl 1x PBS sui campioni raccolti da ogni pozzetto, vortice viene eseguita tra ogni diluizione.
  8. Piatto terza diluizione, 10 -3, sia su LB (WT) o LB Kan (mutanti) piatti. Etichettare le piastre con un'adeguata nome Salmonella ceppo, numero di diluizione, il punto ora e la data.
  9. Dopo vortex la terza provetta di diluizione, dispensare campione di 10 microlitri sulla superficie del agar e ripetere fnostri tempi per un totale di 5 gocce. Assicurarsi di spazio cinque 10 microlitri scende in modo uniforme sulle piastre di Petri piatto 7.
  10. Dopo le gocce penetrare nel agar, girare i piatti più e incubare una notte a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
  11. Trattare pozzi salvati per il conteggio dei macrofagi con 150 1XPBS microlitri contenenti 0,25% tripsina-EDTA per 10 min.
  12. Dopo tripsinizzazione, posto macrofagi in 1,5 ml provette Eppendorf e li trattano con 50 ml di FBS per neutralizzare soluzione di tripsina / EDTA, colorano le cellule con 0,4% Trypan blu e punteggio attraverso l'utilizzo emocitometro.
  13. Una volta trascorso il incubazione di un hr, rimuovere il "invasione" e piatti "replica" dal CO 2 incubatore, lavare i pozzetti come "Step 3.4".
  14. Salvare la piastra "invasione" per un ulteriore trattamento come "Step 3,6-3,12".
  15. Aggiungere 200 ml di terreno DMEM contenente 10 mg / ml di gentamicina perla piastra "replica" per mantenere la clearance della Salmonella extracellulare nel mezzo. Riportare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per un ulteriore 22,5 ore.
  16. Il giorno seguente, rimuovere la piastra "replica" di 37 ° C, 5% CO 2 incubatore, lavare i pozzetti come "Step 3.4" e trattarli come "Step 3,6-3,12".
  17. Infine, rimuovere le piastre di agar dopo incubazione overnight a 37 ° C incubatore e segnare il numero di colonie batteriche.
  18. Una buona distribuzione delle colonie deve essere compresa tra 10 e 100 colonie, ogni punto contiene circa 2 a 20 colonie, sarebbe difficile segnare se ci fossero più di 20 colonie su un punto. Se il conteggio è troppo bassa o troppo alta, replate il campione con 10-diluizioni maggiori o minori a seconda delle necessità.

Analisi 4. Dati

  1. Calcolare i (unità di formazione di colonie per ml) CFU di ogni piatto in base alla placcaturavolume e fattore di diluizione.
  2. Accertare il numero di Salmonella per macrofagi attraverso la conta delle cellule macrofagi registrato da ogni ceppo.
  3. Calcolare le medie geometriche della CFU per macrofagi di almeno tre esperimenti indipendenti per associazione cellulare, invasione o la replica rispettivamente, e normalizzare ulteriormente la WT per il valore relativo.
  4. Analizzare i dati per l'associazione, l'invasione, e la replica da parte di Student t-test, rispettivamente, confrontando ogni ceppo di WT, e determinare la significatività statistica del p-value.

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Representative Results

Vedere i risultati rappresentativi (Figura 2) dopo che i dati sono tracciate in base alla fagocitosi test invasione delle cellule modificate. I dati comprendono cinque diversi ceppi, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutante A e B. mutante Δ Inva, noto per essere difettoso per l'invasione, e ΔphoP noti per essere difettoso per la replica 8, sono utilizzati come controlli positivi per valutare la validità sperimentale . Infatti, nel saggio di invasione modificato, un mutante ΔinvA è interiorizzato male da RAW264.7 cellule e un mutante ΔphoP aveva ridotto replica dopo 24 ore. Mutanti A e B sono ceppi rappresentativi analizzati utilizzando questo protocollo. Mutante A mostra significativa riduzione della replicazione (figura 2), simile a un mutante ΔphoP; interessante, mutante B mostra un significativo incremento della replicazione (Figura 2). I dati indicano chiaramente entrambi questi mutanti hanno alterato fenotipi per l'invasione e la sopravvivenza nei macrofagi.

In sintesi, numerosi mutanti di delezione di Salmonella sono stati singolarmente phenotyped per coinvolgimento nel batterica associazione, invasione, e la replica nei macrofagi RAW264.7 con il saggio di invasione modificato. Venti dei 38 mutanti testati finora visualizzato difetti variabili ma significativi infezione batterica dei macrofagi (Tabella 1), quindi il test modificato per fenotipo in vitro Salmonella o altra associazione batterica, l'invasione e la replica in fagociti aumenta la capacità di precisione e ad alta produttività, mentre riducendo la fatica dell'operatore.

Figura 1
Figura 1 Schema di funzionamento di test high-throughput. Assay protezione gentamicina è modicato, standardizzato a fenotipo numerosi mutanti di Salmonella contemporaneamente in piastre da 96 pozzetti. I passaggi chiave vengono eseguite come sopra per esaminare l'associazione, l'invasione e la replica di Salmonella nelle cellule RAW264.7 macrofagi.

Figura 2
. Figura 2. risultati rappresentativi I saggi high-throughput vengono eseguiti per ceppi di Salmonella - WT, ΔinvA, ΔphoP, mutante A, e mutante B - nelle cellule RAW264.7 macrofagi. Per ogni ceppo, le medie geometriche della CFU per macrofagi sono ottenuti da tre esperimenti indipendenti per associazione cellulare, invasione e la replica, rispettivamente, che sono ulteriormente normalizzati al WT e rappresentazione grafica viene mostrato. Le barre di errore indicano l'errore standard, e la significatività statistica di ogni ceppo riferimentodi WT è stato determinato di Student t-test. * P <0,05. MOI = 20.

Tabella 1
Tabella 1 fenotipi di geni candidati. Candidati Salmonella mutanti sono phenotyped dal modificato, test standardizzati per l'associazione, l'invasione e la replicazione nelle cellule macrofagi RAW264.7. 20 mutanti hanno difetti significativi in ​​associazione, invasione e / o la replica.

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Discussion

Il test di protezione gentamicina è ampiamente usato per studiare l'invasione e la replica di batteri patogeni intracellulari all'interno della cellula ospite, ed è soprattutto un importante strumento biologico per lo studio di agenti patogeni, come la Salmonella, la cui invasione è il passo presupposto indispensabile per l'infezione 1. La protezione dosaggio standard di gentamicina nella comunità di ricerca di Salmonella è implementato in 24-ben piatto cultura 5. Anche se l'uso di 48 o anche piastre a 96 pozzetti sono stati discussi prima per capacità high-throughput 9, nessun protocollo attuale è stato dimostrato in dettaglio e impiegato con successo per testare una collezione di mutanti batterici. Qui, una versione modificata e protocollo standardizzato è stato sviluppato per utilizzare piastre di coltura da 96 pozzetti a fenotipo mutanti di Salmonella. In particolare, questo protocollo è stato testato solo per Salmonella e fagociti, quindi modifiche e ottimizzazione sarebbe ovviamente necessario con othe r batteri o cellule ospiti.

Ci sono diversi vantaggi per il test di protezione Gentamicina modificato per fenotipo Salmonella associazione, l'invasione e la replicazione nelle cellule fagocitarie. In primo luogo, il formato piatto di coltura a 96 pozzetti permette test high-throughput e di analisi, fino a 10 diversi ceppi possono essere testati contemporaneamente con la ripetizione sufficiente analisi statistiche e controlli interni. In secondo luogo, a causa della elevata sensibilità del test, i dati grezzi del saggio tutela Gentamicina possono essere soggetti a variazioni tecniche quando ripetuto in tempi diversi. In base a tale protocollo modificato, alcuni ceppi sono phenotyped nelle stesse condizioni durante tutto il processo, riducendo la varianza. Infine, l'uso di pipette multicanale aumenta l'efficienza e riduce l'affaticamento dell'operatore. Il nuovo protocollo ha facilitato la rapida fenotipizzazione numerosi mutanti di Salmonella, mentre la generazione di grandi quantità di dati, riproducibili quantitativi.

ove_content "> Una preoccupazione nel fare saggi di invasione in 96 pozzetti piatti della cultura è che i pozzetti contengono un minor numero di cellule eucariotiche, e per questo quantificazione potrebbero essere compromesse. Per risolvere questo problema, una grande serie di test sono stati eseguiti per ottimizzare la riproducibilità. Prima , i macrofagi RAW264.7 utilizzati in questo protocollo avevano meno di 20 passi, e le cellule sono state seminate in 96 pozzetti piatto di coltura durante la notte prima del dosaggio secondo luogo, la MOI è stato ridotto a 20:. 1 dalla utilizzato regolarmente 50: 1 o 100: 1 A MOI 20:.. 1 assicura che il 99% dei macrofagi sarà esposto a infezioni da 10 a 30 batteri calcolati dalla distribuzione di Poisson in base al punto stocastico Si pensa che, non limitata ai fattori biologici, danno cellulare può essere . causate da batteri schiacciante contatti fisici 10 Inoltre, Salmonella invasione potrebbero indurre apoptosi dei macrofagi, che è positivamente associato con alto MOI 11 Usando una MOI di 20:. 1, damag cellularee è risultato essere minimo, presumibilmente a causa di limitate batteri macrofagi contatto fisico. In terzo luogo, l'intervallo di tempo di incubazione è stata ottimizzata per i tre punti di tempo: associazione per 30 minuti senza gentamicina; invasione di ulteriori 1 ora (totale 1,5 ore post-infezione) con 100 mg / ml di gentamicina; replica per ulteriori 22,5 ore (totale 24 ore dopo l'infezione) con 10 mcg / ml Gentamicina. Nel nostro test, 5 mg / ml di gentamicina è sufficiente per uccidere tutti i Salmonella in DMEM privo di cella con il 10% di siero fetale bovino (dati non pubblicati), in tal modo, 100 mg / ml di gentamicina ci si aspetterebbe per garantire l'uccisione rapida e 10 g / ml gentamicina manterrebbe la clearance dei batteri extracellulari nel mezzo di coltura cellulare per la notte di incubazione In vivo, ci vogliono circa 15 minuti per l'analisi del tessuto Salmonella associata con l'intestino di vitello cellule epiteliali 12,13;. in vitro, 30 min di incubazione è segnalato per adeguati per il wild-type 14. Per il saggio di invasione standard, il carico di lavoro dei primi due punti di tempo è abbastanza intenso dovuto al lavaggio, diluizione seriale e placcatura. L'intervallo di tempo preciso per ogni punto temporale è stato realizzato utilizzando le pipette multicanale, in quanto il dispositivo aumenta notevolmente l'efficienza e la precisione dell'operatore. Inoltre, la tecnica di placcatura campione è stato alterato dopo la diluizione seriale, invece di placcatura 100 microlitri e la diffusione manualmente, 5 gocce separate di 10 ml sono stati placcati per ogni ripetizione bene su piatti che riduce notevolmente il tempo di placcatura e aumenta la precisione, perché il conteggio finale per pozzetto è segnato da 5 campioni placcati. Collettivamente, queste procedure di ottimizzazione e standardizzazione aumentare la riproducibilità del test, diverse volte gli operatori possono ottenere risultati coerenti in tempi diversi.

Questo protocollo utilizza fagociti invece di cellule epiteliali per questo testin un formato a 96 pozzetti più piccoli. Nello studiare la patogenesi della salmonellosi, la linea cellulare epiteliale più utilizzato è Caco-2, derivato dal eterogeneo adenocarcinoma colorettale epiteliale umano. Utilizzando la 24-ben piatto cultura prova invasione regolare con cellule Caco-2, il numero effettivo di batteri recuperati ad ogni tempo, in particolare il punto 22.5 ore di tempo per la replica fenotipizzazione, è molto più bassa rispetto a quando fagociti, come J774 o RAW264 .7 macrofagi, vengono utilizzati (dati non pubblicati). Quindi, questo rende più difficile eseguire la fenotipizzazione con un piatto di coltura a 96 pozzetti quando ciascuno ha ben minor numero di cellule ospiti. E 'noto che le cellule macrofagi possono fagocitare attivamente i batteri, che potrebbero portare a più batteri di essere internalizzati, e inoltre non si può escludere che la Salmonella apparentemente replicano più lentamente in cellule Caco-2. La capacità di Salmonella di sopravvivere e replicarsi all'interno delle cellule macrofagi è legata al ruolo chiave nella patogenesi disalmonellosi, vale a dire, innescando massicce risposte infiammazione ospite e facilitando l'infezione sistemica 1. Abbiamo principalmente impiegato il test di protezione Gentamicina modificato e standardizzato fenotipo di un ampio set di computazione di pipeline geni selezionati per i loro potenziali impegni in interazioni ospite. Si è scoperto quasi il 50% dei mutanti di Salmonella sono stati phenotyped come geni coinvolti nella replicazione intracellulare nei fagociti.

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Acknowledgments

Questo progetto è stato sostenuto in parte da una sovvenzione per i National Institutes of Health NIAID (per AJB e LGA, R01 AI076246). La collezione mutante di Salmonella è stato in parte sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni (per MM, U01 A152237-05, R01, R01 AI07397-01 AI039557-11 e R01 AI075093-01), in parte dal National Institutes of Health sovvenzioni (per HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Ringraziamo Steffen Prowollik per la placcatura replica e confermando i mutanti della collezione.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 11965
Fetal bovine serum HyClone SH30910.03
T-75 Cell culture flask vented filter cap Nest Biotechnology 708003
100x Non-Essential Amino Acids Life Technologies 11140
Cell scraper BD Falcon 353086
96-well Cell culture plate Corning Incorporated 3595
Luria-Bertani (LB) broth MP Biomedicals 3002-075
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube BD Falcon 352059
PBS pH 7.4 (1x) Life Technologies 10010
Triton X-100 Sigma T-8787
Kanamycin solution Sigma K0254
Gentamicin solution Sigma G1272
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200
Trypan blue Sigma T8154

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
  2. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
  3. Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).
  4. Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).
  5. Behlau, I., Miller, S. I. A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells. J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).
  6. Hueck, C. J., et al. Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins. Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).
  7. Steele-Mortimer, O. Infection of epithelial cells with Salmonella enterica. Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).
  8. Foster, J. W., Spector, M. P. How Salmonella survive against the odds. Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).
  9. Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).
  10. Molinari, G., et al. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).
  11. Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium. Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).
  12. Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).
  13. Lawhon, S. D., et al. Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach. PLoS One. 6, e26869 (2011).
  14. Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion. Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).

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Malattie contagiose , associazione invasione la replica fenotipo patogeni intracellulari macrofagi
High-throughput Assay per Fenotipo<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Associazione, Invasion, e replica nei macrofagi
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Wu, J., Pugh, R., Laughlin, R. C.,… More

Wu, J., Pugh, R., Laughlin, R. C., Andrews-Polymenis, H., McClelland, M., Bäumler, A. J., Adams, L. G. High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages. J. Vis. Exp. (90), e51759, doi:10.3791/51759 (2014).

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