Summary
En hög genomströmning analys för in vitro-fenotyp Salmonella eller annan bakteriell förening, invasion, och replikation i fagocyterande celler med hög genomströmningskapacitet utvecklades. Metoden användes för att utvärdera Salmonella gen knockout mutantstammar för deras inblandning i värd-patogen interaktioner.
Abstract
Salmonella arter är zoonotiska patogener och vanliga orsaker till livsmedelsburna sjukdomar hos människor och djur 1. Att förstå mekanismerna bakom Salmonella -host interaktioner är viktigt att belysa den molekylära patogenesen av Salmonella infektion. Den Gentamicin skyddsanalys fenotyp Salmonella förening, invasion och replikering i fagocytceller anpassades för att möjliggöra hög throughput screening för att definiera roller deletionsmutanter av Salmonella enterica serotyp Typhimurium i värdinteraktioner som använder RAW 264.7 makrofager från mus. Enligt detta protokoll, variansen i mätningar reduceras signifikant jämfört med det standardprotokoll, eftersom vildtyp och multipla mutanta stammar kan testas i samma odlingsskål och samtidigt. Användning av multikanalspipetter ökar genomströmningen och förbättrar precisionen. Dessutom farhågor relaterade till att använda mindre host celler per brunn i 96 brunnar odlingsskål behandlades. Här, protokollet av den modifierade in vitro Salmonella invasion analys med användning fagocytceller framgångsrikt används för att fenotypen 38 individuella mutanter Salmonella radering associerings, invasion och intracellulär replikering. De in vitro fenotyper presenteras, av vilka några var därefter bekräftats ha in vivo fenotyper i en djurmodell. Således, för att det modifierade, standardiserade test fenotypen Salmonella förening, invasion och replikation i makrofager med hög genomströmningskapacitet skulle kunna användas mer allmänt för att studera bakterie värd interaktioner.
Introduction
Nontyphoidal Salmonella är viktiga orsaker till tarmsjukdomar i alla ryggradsdjur. Salmonellainfektion hos människor är bland de bakteriella livsmedelsburna sjukdomar 1. Karaktärisering av de molekylära mekanismer som ligger till grund för interaktioner av salmonella med sina djurvärdar uppnås främst genom studier av Salmonella enterica serotyp Typhimurium (STM) i vävnadsodling och djurmodeller av infektion. Att få inblick i STM-värd interaktioner kommer att hjälpa oss att förstå hur Salmonella överleva och växa inuti värdceller. Den första utmaningen i att studera dessa interaktioner är att identifiera så många medverkande faktorer som möjligt från både värd och patogen, men dessa ansträngningar till stor del hindras av de stora svårigheterna med att hantera två oberoende komplexa biologiska system samtidigt, det vill säga, värd och Salmonella, under fysiologiska betingelser. Dessutom, det stora repertoire av salmonella och värdgener potentiellt kodar faktorer som värd interaktioner kräver hög genomströmning biologisk plattform för att ta itu med denna utmaning.
En modifierad, standardiserad analys för att fenotypen Salmonella förening, invasion och replikation i makrofager med hög genomströmningskapacitet utvecklades för att undersöka ett stort antal gener sannolikt bedriver Salmonella -host interaktioner. Den Gentamicin skyddsanalys utvecklades 1973 2, men först grundligt beskriven av Elsinghorst 1994 3,4. Det har nu blivit ett standardverktyg för att studera många intracellulära bakteriella patogener ex vivo, inklusive Salmonella 5,6. Internaliserade bakterier undgå att dödas av vissa antibiotika, såsom gentamicin, som inte kan tränga eukaryota celler 3. Genom att utnyttja detta fenomen, det Gentamicin skyddsanalys mäter överlevnad och tillväxt av intracellulär bacterial patogener. Tre händelser under infektionen, dvs association med eukaryota celler, invasion och replikation, kan utvärderas för intracellulära bakteriella patogener baserat på tidsintervallet mellan infektion, Gentamicin behandling, och ytterligare inkubation (Figur 1). Eukaryota cellinjer ger en fysiologisk miljö som är mindre komplicerad än relevanta djurmodeller för värd-patogen interaktionsstudier.
Den Gentamicin skyddsanalys är en lämplig plattform för att studera STM-värdinteraktioner, men den standardanalys i en 24-brunnars odlingsplatta har låg genomströmningskapacitet. Beräkningsanalys av in vivo datauppsättningar identifierade 149 Salmonella genprodukter som är förutsagda att interagera med ca 300 värd genprodukter (opublicerade data). Standarden Gentamicin skyddsanalys har inte kapacitet att fenotypen detta antal mutanter effektivt.
I addition kan Gentamicin skyddsanalys teoretiskt upptäcka invasionen av en enda bakterie. På grund av denna inneboende känslighet, rådata är känsliga för tekniska avvikelser när upprepades vid olika tidpunkter. Den interna kontrollen och relativ presentation av data efter normalisering är väsentliga för en meningsfull tolkning av resultaten. Mot bakgrund av detta infördes en modifierad, standardiserad Gentamicin skyddsanalys utvecklas för att öka testkapaciteten och ökar precisionen.
Följande protokoll är detaljerade och illustrerade för att fullfölja det ändrade Gentamicin skyddsanalys med användning av 96 brunnar odlingsplattor och murina makrofag RAW264.7 cellinje. Jämfört med standardprotokollet i 24-brunnars odlingsplattor, har det modifierade protokollet följande fördelar: 1) Med hjälp av 96 brunnar odlingsplattor tillåter upp till 10 olika mutantstammar som ska phenotyped inklusive interna positiva och negativa kontroller med tillräcklig statistisk styrka;2) Variansen för resultat är signifikant, eftersom de mutanta stammar testas på samma odlingsskål och på samma gång; 3) Användningen av multikanalspipetter ökar genomströmningen och minskar förarens trötthet. Slutligen, att jämföra med 24 brunnar odlingsplattor, var oro mindre värdceller per brunn i 96-väl odlingsskål hanteras genom protokolloptimering och standardisering.
Sammanfattningsvis modifierade, standardiserade test in vitro fenotyp Salmonella eller annan bakteriell förening, invasion och replikering i fagocytceller ökar precisionen och uppnår hög genomströmningskapacitet och samtidigt minska påfrestningen på föraren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Murina Makrofag RAW264.7 Cell Culture
- Väx lågt passagenummer murina makrofagceller, RAW264.7 (ATCC ® Number TIB-71) i en T-75 cellkultur kolv ventilerad filterlocket i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) , 0,5% NaHCO 3 och 1% 100x icke-essentiella aminosyror (NEAA) vid 37 ° C, i en 5% CO2-inkubator.
- När cellerna når en 60-80% sammanflöde i kolven, använd en cellskrapa för att skörda celler, och räkna cellerna i en hemacytometer och beräkna cellkoncentrationen.
- Resuspendera cellerna och utspädd cellkoncentrationen till 2,5 x 10 5 / ml i färskt DMEM cellodlingsmedium. Använd flerkanalspipetter till plattan 200 | il av DMEM-cellkulturmedium innehållande 5 x 10 4 celler i varje brunn i 96-brunnars cellodlingsplattor.
- Plate fyra brunnar i varje Salmonella-stam. Sätt upp tre separata plattor för en uppsättningav fagocytiska celler invasion analys, och markera dem med "föreningen", "invasion" och "replikering", respektive.
- Placera plattorna i 5% CO2 inkubator vid 37 ° C ON för att tillåta de makrofagceller att fästa till botten av brunnarna.
2. Framställning av Salmonella av vildtyp och mutanter
- Samma dag för att förbereda makrofag RAW264.7 cellerna, plocka enstaka kolonier av vildtyp (WT) Salmonella enterica serotyp Typhimurium 14028s, DinvA mutant, DphoP muterade, och de önskade stammar prov muterade, och kultur dem i Luria-Bertani ( LB) buljong kompletterad med antibiotika så är lämpligt. Använd varje uppsättning av de fagocytiska cellerna invasionsanalyser för att testa upp till 10 mutantstammar (DinvA mutanten och DphoP mutant är defekt i invasion och intracellulär replikation, respektive).
- Odla bakterier för 14 timmar vid 37 ° C med sHaking vid 220 rpm i 5 ml vardera av LB-buljong i löst capped 14 ml polypropen i en rundbottnad röret. LB buljong innehåller lämpliga antibiotika, i vårt fall, de flesta av muterade stammar är resistenta mot kanamycin, 50 mikrogram / ml
- Nästa dag, subkultur varje ON kulturer av Salmonella-stammar i vanlig 5 ml LB buljonger i förhållandet 1:50 för ytterligare 4 timmar med skakning vid 220 rpm.
- Läs OD 600 värden för varje bakteriekultur på en spektrofotometer, och varje läsning bör sträcka sig från 0,6 till 1,2 för att optimera Salmonella patogenicitet island-1 typ III sekretionssystemet (SPI-1 TTS) genuttryck för invasion.
- Använd formeln för en OD 600 = 7,5 x 10 8 CFU / ml för att uppskatta den bakteriella koncentrationen, sedan späd bakterier till en koncentration av 5 x 10 6 CFU / ml i färskt DMEM cellodlingsmedium.
3. Invasion Assay i 96-brunnars Culture Plate
- Avlägsna tre 96-brunnars cell odlingsplattor från CO2 inkubator och tvätta varje brunn en gång med 200 l av 1 x PBS-buffert.
- Efter tvättning och fullständigt avlägsnande av PBS, tillsätt 200 | il bakterier i DMEM-medium (se ovan) i varje brunn. Detta resulterar i en x 10 6 Salmonella cellerna i varje brunn och multiplicitet av infektion (MOI) av 20: 1.
- Centrifugera plattorna vid 1.000 xg i en sluten bärare i 10 minuter, sedan ersätta plattor (tid noll) i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 30 min. För varje stam, installera minst fyra dubbla brunnar.
- Efter 30 minuter, ta bort plattorna från inkubatorn och tvätta tre gånger med 200 ul av 1 x PBS för att avlägsna icke-associerade bakterier.
- Efter tvättning, spara plattan märkt med "förening" för vidare behandling. Lägg 200 | il av DMEM-medium innehållande 100 | ig / ml gentamicin till varje brunn i plattorna som är markerade med "invasion" och "replikering" för to döda den extracellulära salmonella. Återgå plattorna till 37 ° C, 5% CO2 inkubator för en extra timme.
- Spara en väl från varje infekterad stam för inspelning makrofag celltal, behandla resten av brunnarna på "association" plattan med 200 ul av 1 x PBS innehållande 1% Triton X-100 för 10 min. Triton lösning lysera makrofagceller och släpp tillhörande Salmonella.
- Harvest Salmonella från varje brunn och placera dem i 1,5 ml Eppendorf-rör. Utför tre 10-faldiga seriespäd med 900μl 1x PBS på de skördade prover från varje brunn är virvel utförs mellan varje spädning.
- Plate tredje utspädning, 10 -3, på antingen LB (WT) eller LB Kan (mutanter) plattor. Märk plattorna med lämplig Salmonella stamnamn spädnummer, tidpunkt och datum.
- Efter virvelrörelse den tredje utspädningsrör, dosera 10 ul prov på ytan av agar och upprepa fvår tid för totalt 5 droppar. Se till att utrymmet de fem 10 pl droppar jämnt på petriskålen plattorna 7.
- Efter dropparna suga in i ägarn, vända plattorna över och inkubera över natten vid 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Behandla brunnar sparade för räkning av makrofager med 150 | il 1 x PBS innehållande 0,25% trypsin-EDTA under 10 min.
- Efter trypsinization, placera makrofager i 1,5 ml Eppendorf-rör och behandla dem med 50 pl FBS att neutralisera trypsin / EDTA-lösning, färga cellerna med 0,4% Trypanblått och poäng dem genom att använda hemacytometer.
- När en timme inkubation har förflutit, ta bort "invasion" och "replikering" plattor från CO2 inkubator, och tvätta varje brunn som "Step 3.4".
- Spara "invasion" plattan för vidare behandling som "Step 3,6-3,12".
- Lägg 200 | il av DMEM-medium innehållande 10 | ig / ml gentamicin tillden "replikering" plattan för att upprätthålla clearance av extracellulärt Salmonella i mediet. Återför plattan till 37 ° C, 5% CO2 inkubator under ytterligare 22,5 timmar.
- Nästa dag, ta bort "replikering" plattan från 37 ° C, 5% CO2 inkubator, och tvätta varje brunn som "Steg 3.4" och behandla dem som "Step 3,6-3,12".
- Slutligen, ta bort agarplattor efter inkubation över natten i 37 ° C inkubator och poäng antalet bakteriekolonier.
- En bra koloni fördelningen bör vara mellan 10 och 100 kolonier, innehåller varje plats ungefär 2 till 20 kolonier, skulle det vara svårt att göra mål om det fanns mer än 20 kolonier på en plats. Om räkningen är för låg eller för hög, förnyad utbredning av provet med 10-faldigt högre eller lägre utspädningar som behövs.
4. Data Analysis
- Beräkna de CFU (kolonibildningsenheter per ml) av varje platta baserat på pläteringenvolym och utspädningsfaktorn.
- Därefter bestäms antalet Salmonella per makrofag genom den inspelade makrofag kroppar från varje stam.
- Beräkna det geometriska medelvärdet av CFU per makrofag från minst tre oberoende försök för cell förening, invasion eller replikering, respektive och normalisera vidare till WT för det relativa värdet.
- Analysera data för föreningen, invasion och replikering med Students t-test respektive, genom att jämföra varje stam till WT, och bestämma den statistiska signifikansen av det p-värde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Se representativa resultat (Figur 2) efter det att uppgifterna plottas utifrån den modifierade fagocytisk cellinvasion analys. Uppgifterna omfattar fem olika stammar, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutant A och mutant B. Δ Inva, känd för att vara defekt för invasion, och ΔphoP kända för att vara defekt för replikering 8, används som positiva kontroller för att bedöma den experimentella giltighet . Ja, i den modifierade invasionen analysen, är en ΔinvA mutant intern dåligt av RAW264.7 celler och ΔphoP mutant hade minskat replikering efter 24 timmar. Mutants A och B är representativa stammar analyserades med hjälp av detta protokoll. Mutant A visar signifikant minskning av replikation (figur 2), som liknar en ΔphoP mutant; interestingly, mutant B visar en signifikant ökning i replikation (figur 2). Uppgifterna visar tydligt båda dessa mutationernts har förändrat fenotyper för invasion och överlevnad i makrofager.
Sammanfattningsvis var många Salmonella deletionsmutanterna individuellt phenotyped för inblandning i den bakteriella föreningen, invasion, och replikering i RAW264.7 makrofager med den modifierade invasionen analysen. Tjugo av 38 testade mutanter hittills visade rörliga men betydelsefulla brister i bakteriell infektion av makrofager (tabell 1), alltså den modifierade analys för in vitro-fenotyp Salmonella eller annan bakteriell förening, invasion och replikering i fagocytceller ökar precision och hög genomströmning kapacitet samtidigt minskar förarens trötthet.
Figur 1 Arbets system med hög genomströmning analys. Gentamicin skydd analysen är modierad, standardiserad till fenotypen många mutanter Salmonella samtidigt i 96-hålsplattor. De viktigaste stegen utförs enligt ovan för att undersöka sammanslutning, invasion och replikering av salmonella i RAW264.7 makrofagceller.
. Figur 2. Representativa resultat De hög kapacitet analyser utförs för Salmonella-stammar - WT, ΔinvA, ΔphoP, mutant A och mutant B - i RAW264.7 makrofagceller. För varje stam, är det geometriska medelvärdet av CFU per makrofager som erhållits från tre oberoende försök för cell förening, invasion och replikering, respektive, som är ytterligare normaliserad till WT och grafisk representation visas. Felstaplar anger standardfel, och statistisk signifikans av varje stam refereradetill WT bestämdes genom Students t-test. * P <0,05. MOI = 20.
Kandidat Salmonellamutanter Tabell 1 Fenotyper av kandidatgener. Har phenotyped med den modifierade, standardiserade test för association, invasion och replikering i RAW264.7 makrofagceller. 20 mutanter har betydande brister i föreningen, invasion och / eller replikering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Gentamicin skyddsanalys i stor utsträckning används för att studera invasionen och replikering av intracellulära bakteriella patogener inuti värdcellen, och det är särskilt en viktig biologisk verktyg för att studera patogener, som Salmonella, vars invasion är förutsättningen steget för upprättandet infektion 1. Standarden Gentamicin skyddsanalys i Salmonella forskarsamhället genomförs i 24-väl odlingsskål 5. Även om användningen av 48 eller till och med 96-brunnars plattor diskuterades tidigare för hög genomströmning kapacitet 9 har ingen faktisk protokoll visats i detalj och med framgång använts för att testa en samling av bakteriella mutanter. Här, en modifierad och standardiserat protokoll utvecklades för att använda 96 brunnar odlingsskålar fenotyp Salmonella mutanter. Noterbart var detta protokoll endast testas för salmonella och fagocytceller, alltså ändringar och optimering skulle givetvis vara nödvändigt med andras r bakterier eller värdceller.
Det finns flera fördelar med den modifierade Gentamicin skydds analys för att fenotyp Salmonella förening, invasion och replikering i fagocyterande celler. Först låter det 96-håls odlingsskål format med hög genomströmning provning och analys, upp till 10 olika stammar kan testas samtidigt med tillräcklig upprepning statistisk analys och intern kontroll. För det andra, på grund av den höga känsligheten för analysen, kan rådata av den Gentamicin skyddsanalys vara mottagliga för tekniska avvikelser när upprepades vid olika tidpunkter. Enligt detta ändrade protokoll, finns flera stammar phenotyped på samma villkor under hela processen, minska variansen. Slutligen ökar användningen av flerkanalspipetter effektiviteten och minskar påfrestningen på föraren. Det nya protokollet möjliggjort en snabb fenotypning många Salmonellamutanter samtidigt generera stora mängder kvantitativ, reproducerbara data.
ove_content "> Ett bekymmer i att göra invasionsanalyser i 96-brunnars odlingsplattor är att brunnarna innehåller färre eukaryota celler, och på grund av denna kvantifiering kan äventyras. För att lösa detta problem har ett stort antal analyser utförs för att optimera reproducerbarhet. First De RAW264.7 makrofager som används i detta protokoll hade färre än 20 passager, och cellerna såddes i 96-väl odlingsskål över natten innan analysen det andra var MOI minskas till 20:. 1 från regelbundet använt 50: 1 eller 100: 1 A MOI 20:.. 1 ser till att 99% av makrofager kommer att utsättas för smitta med 10 till 30 bakterier beräknade av Poisson fördelning enligt den stokastiska punkten Man tror att, inte begränsad till biologiska faktorer, cellskador kan vara . orsakas av överväldigande bakterier fysiska kontakter 10 Dessutom kan Salmonella invasion inducera apoptos i makrofager, som är positivt är förknippad med hög MOI 11 Använda en MOI på 20:. 1, cellulär damage befanns vara minimal, förmodligen på grund av begränsad bakterie-makrofag fysisk kontakt. För det tredje var inkubationstiden intervallet optimerad för de tre tidpunkter: förening för 30 minuter utan Gentamicin; invasion för ytterligare en timme (totalt 1,5 h efter infektion) med 100 | ig / ml gentamicin; replikering för ytterligare 22,5 timmar (totalt 24 timmar efter infektion) med 10 mikrogram / ml gentamicin. I vårt test, är 5 ^ g / ml Gentamicin är tillräcklig för att döda alla Salmonella i cellfritt DMEM med 10% fetalt bovint serum (opublicerade data), vilket således, 100 | ig / ml gentamicin skulle förväntas att säkerställa ett snabbt dödande och 10 g / ml Gentamicin skulle bibehålla clearance av extracellulära bakterier i cellodlingsmedium för övernattning inkubation in vivo, det tar ca 15 min att upptäcka vävnad associerad Salmonella med kalven tarmen epitelceller 12,13;. in vitro, är 30 min inkubation rapporteras till vara olämpliga av vildtypDetta protokoll använder fagocytceller istället för epitelceller för denna analysi ett mindre 96-brunnsformat. Genom att studera patogenesen av salmonella, är den mest använda epitelcellinje Caco-2, som härrör från heterogena human epitelial kolorektal adenocarcinom. Användning av det vanliga 24-brunnars odlingsskål invasionstest med Caco-2-celler, och det faktiska antalet återvunna bakterier vid varje tidpunkt, i synnerhet 22,5 hr tidpunkt för fenotypning replikering, är mycket lägre än när fagocytiska celler, såsom J774 eller RAW264 .7 makrofager, används (opublicerade data). Således gör detta det svårare att utföra fenotypning med användning av en 96-brunnars odlingsplatta vid var och en har väl färre värdceller. Det är känt att makrofager celler aktivt kunde uppsluka bakterier, som kan leda till fler bakterier som internaliseras, och det kan inte heller uteslutas att Salmonella tydligen replikera långsammare i Caco-2-celler. Förmågan av Salmonella att överleva och replikera inuti makrofagceller är relaterad till nyckelroller i patogenesen avsalmonella, dvs utlöser massiva värd inflammation svar och underlätta systemisk infektion 1. Vi utnyttjas främst ändras och standardiserade Gentamicin skyddsanalys fenotyp ett stort antal beräknings pipeline utvalda gener för deras potentiella engagemang i värdinteraktioner. Det visade sig nästan 50% av de mutanter av Salmonella var phenotyped som gener involverade i intracellulär replikation i fagocytiska celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Projektet stöddes dels av ett bidrag för National Institutes of Health NIAID (för AJB och LGA, R01 AI076246). Den Salmonella mutant samlingen delvis med stöd från National Institutes of Health bidrag (för MM, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 AI039557-11 och R01 AI075093-01), dels av National Institutes of Health bidrag (för HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Vi tackar Steffen Prowollik för replik plätering och bekräfta mutanter i samlingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 Cell culture flask vented filter cap | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100x Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-well Cell culture plate | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH 7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin solution | Sigma | K0254 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 |
References
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
- Elsinghorst, E. A.
- Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).
- Behlau, I., Miller, S. I. A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells. J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).
- Hueck, C. J., et al. Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins. Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).
- Steele-Mortimer, O. Infection of epithelial cells with Salmonella enterica. Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).
- Foster, J. W., Spector, M. P. How Salmonella survive against the odds. Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).
- Molinari, G., et al. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium. Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Lawhon, S. D., et al. Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach. PLoS One. 6, e26869 (2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion. Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).
