Summary
Muhabir hücre çizgileri, görselleştirmek etiket ve heterojen popülasyonlar ilgi hücreleri izole etmek için bir araç sunmaktadır. Bununla birlikte, hedef gen, insan embriyonik kök hücreleri alışılmış homolog rekombinasyon kullanılarak son derece verimsizdir. Bu yazıda, çinko-parmak nukleaz gelişmiş homolog rekombinasyon kullanarak EGFP ile CNS Ortabeyin özel transkripsiyon faktörü PITX3 odağı hedefleme açıklar.
Abstract
Mevcut insan embriyonik kök hücre (ESC) farklılaşma protokolleri ile bir büyük sınırlama heterojen hücre popülasyonlarının nesil. Bu kültürler, ilgi hücreleri içerir, fakat aynı zamanda farklılaşmamış EKH, nöral olmayan türevleri ve diğer alt-tipler ile nöronal kirlenir. Bu, in vitro olarak ve bu ilaç keşfi ya da hücre replasman tedavisi için, in vitro modelleme gibi in vivo uygulamalarda, kullanımlarını kısıtlar. Bu aşabilmesi için, görselleştirmek parça ve ilgi hücreleri izole etmek için bir araç sunuyoruz muhabiri hücre hatları, mühendislik olabilir. Geleneksel homolog rekombinasyon son derece verimsiz cihaz aracılığıyla Ancak, insan embriyonik kök hücreleri bunu başarmak için. Bu protokol ile birlikte, Hipofiz homeobox insan embriyonik kök hücreleri 3 (PITX3) lokus site-spesifik çift iplikli DNA kopmalarını tanıtmak özel olarak tasarlanmış, çinko-parmak nükleazlar kullanılarak hedeflenmesi tarifPITX3 - EGFP -spesifik DNA donör vektörü. PITX3 raportör hücre çizgisinin üretilmesi sonrasında, daha sonra, in vitro olarak, Parkinson hastalığı, modelleme ya da hücre tedavisi gibi değiştirme çalışmalarında kullanılmak için yayınlanmış protokoller kullanılarak ayırt edilebilir.
Introduction
Mevcut embriyonik kök hücre (ESC) diferansiyasyon protokolleri, özellikle spesifik sinir hücresi fenotipleri türetme ile ilgili olarak, heterojen hücre popülasyonlarının neden olur. Kültürler, arzu edilen hücresel fenotipi, diğer nöronal içeren rağmen bunlar, nöronal olmayan ve BM-farklılaşmış hücre türleri genellikle 1 bulunmaktadır. Bu özellikler ESC uygulama hücre replasman tedavisinde kullanım için ve in vitro hastalık modelleme hücre kaynaklardan elde edilen sınırlar.
Genetik raportör hücre çizgileri, görselleştirmek izlemek ve ilgili hücreleri izole etmek için bir araç sunar, raportör protein (RP) ifadesi, endojen ekspresyonu üretir şartıyla. Bir gen kodlama bölgesinin hemen üst promoterlerin kullanımı ham genetik muhabir elde etmek için kullanılabilir, ancak bu gibi yapılar, endojen gen ekspresyonunu kontrol hassas düzenleyici elemanları yoksundur. Bunun aksine, homolog rekombinasyon sunarfırsat RP yüksek sadakat ifade sağlamak. Geçmişte, ilgi konusu özel konumlara homolog yeniden birleştirme için tasarlanmış hedefleme vektörleri DNA aktarımından 1,2 için bir araç olarak, elektroporasyon kullanılarak fare ESCs (mESCs) olarak RPs hedeflemek üzere kullanılmıştır. Bununla birlikte, homolog rekombinasyon yoluyla, geleneksel raportör hücre çizgilerinin nesil insan EKH (HESC) son derece yetersiz olduğu ve bu nedenle (3 gözden geçirilmiştir) durumlarda bir avuç belgelenmiştir. Çinko-parmak nükleazlar (ZFNs) gibi yaygın olarak bilinen siteye spesifik çinko-parmak motifleri, bir Fok I nükleaz füzyonunu ihtiva eden bir yapılandırılmış, kimerik proteini kullanarak, DNA çift iplikli sonları önceden belirlenmiş genomik lokusları sokulabilir. DNA çift iplik arası her iki taraf için homolojisi olan bir DNA vektörü eklendiğinde, genomik DNA sitesi, donör sekansının bir girişe izin verir, homolog rekombinasyon ile tamir edilebilir. Bu teknik kullanışlı f kanıtlanmıştırveya insan primer hücre 4,5 ve 6,7 HESC hem de genomik düzenleme. Son çalışmalar kullanmıştır transkripsiyon faaliyete geçirme gibi efektör nükleazlar (TALENS), bitki kopyalama faktörleri ile ikinci site-spesifik nükleazlara 9 tasarımında yardımcı olmak için, 8 patojenleri.
Aşağıdaki protokolde, insan hipofiz homeoboks 3 (PITX3) lokusu için ZFNs birlikte homolog hedefleme vektörü ihtiva eden bir 6 EGFP elektroporasyon ile HESC raportör hücre hattının üretilmesini göstermektedir. 2-3 hafta boyunca antibiyotik seçimi takiben, doğru entegre DNA ile HESC elle aldı genişletilmiş ve PCR ile başlangıçta ekranlı ve daha sonra Southern lekeleme tarafından onaylanmış olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm işlemler steril bir laminer akış başlığı içinde yapılır. Aksi belirtilmediği sürece tüm ortam ve solüsyonlar 37 ° C'de dengelenir.
Transfaksiyon için (bu Protokolde kullanılan HESC ve hiPSCs, WA-09) İnsan ÖGŞ 1. Genişleme
Not: Matrigel veya Geltrex üzerinde HESC genişletmek için gerekli değildir. fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) genişletilmiş HESC MEF giderme aşaması aşağıdaki elektroporasyon veya nucleofection için kullanılabilir (bakınız bölüm 2.8 bakınız).
- 1 x 100 mm tabak ve MEF medya cm2 başına 2.0 x 10 hücre 4 DR4 MEF'lerin 1 x 75cm2 balon içinde Hazırlama / hac% 0.1 a jelatin ile ön-kaplı kaplar üzerinde (Tablo 1 e bakınız).
Not: CF1, BLK6 veya MF1 MEF'ler kullanılabilir, ancak, örneğin, DR410, antibiyotik dirençli MEF hatları kullanılır önerilir. - Ertesi gün, 100 mm tabak üzerine geçiş HESC bölüm 1.1 'de hazırlanan MEF'ler ile ön-kaplama. Bu ASPI'yi yapmakkültür kaplarından oranı ESC medya, Ca2 + / Mg2 + içermeyen Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile HESC yıkama, 37 ° C /% 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde dispaz (uygun miktarlar için bkz Tablo 2) ve yerde ekleyin. MEFS kaldırmak için HBSS ile 2 kez - 3-5 dk inkübasyonu takiben, yavaşça aspire Dispase ve 1 yıkayın. Yavaşça kültür çanak yüzeyinden koloniler kazımak, HESC medya (Tablo 3) ve bir hücre kazıyıcı kullanarak veya 5 ml pipet ekleyin.
- 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içine kültürü çanak süspansiyon içinde koloni parçalarını toplamak. HESC medya ve 15 ml tüp transferi ile durulayın kültür çanak. Tek hücreler veya küçük parçalar halinde öbekler kırmak için dikkatli olun.
- Koloni fragmanları pelet haline getirmek için 160 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj.
- Aspire süpernatant. Koloni fragmanı pelet gevşetmek için parmak ile 15 ml tüp alt dokunun. Bölünmüş oranına göre HESC medyada yavaşça tekrar süspansiyon koloni fragmanları (normall4 ve 1: 8 uygun) ya 1 arasındaki oranı bölünmüş. Verimliliğini şarjı etkiler, bu gibi tek hücreler veya küçük parçalar halinde kümeleri işlemek için değil, son derece dikkatli olun.
- MEF'ler HBSS ile 1x yıkayın üzerine HESC fragmanlarını replating önce. Yavaş yavaş yemekleri MEF'ler ile ön kaplama HESC ortam içinde HESC fragmanlarını ihtiva eden hücre süspansiyonunun uygun bir miktarı (bakınız Tablo 2) ekleyin.
- Inkübatör rafa kültür yemekleri yerleştirin ve eşit koloni parçaları dağıtmak için iki ileri ve geri ve yan yavaş hareket.
- Günlük HESC ortamı değiştirin.
- MEF'ler (MEF-CM) şartlandırılmış ortam hazırlamak için yıkamak 75 cm 2 şişe MEF'ler HBSS 1 x ile ön kaplama. HESC ortam ekleyin. 24 saat sonra, ortamla ve taze hESC medya ile değiştirin toplamak. 12 gün en fazla günlük tekrarlayın. , Gerekli olana kadar, 4 ° C'de, MEF-CM saklayın.
Transfeksiyon İnsan EKH 2. Hazırlık
- HESC büyümesini dikkate, günde bir mikroskop altında. Koloniler% 40-50 konfluent, plaka cm 2 başına 2.0 x 10 5 MEF'ler 3 x 100 mm yemekleri olunca.
- Koloniler 60 olunca -% 70 birleşik transfekte hazırdır. Farklı koloniler veya koloni çekirdekleri çıkartarak 'damat kolonileri.
Not: Biz daha yüksek transfeksiyonunu inanıyoruz ve hücreler log fazı büyüme olduğunda hedefleme verimleri meydana gelince, HESC ≥ 70% confluency ulaşmadan elektroporasyon yapılan önerilmektedir. - HBSS HESC koloniler yıkayın ve Accutase ekleyin.
Not: Bu ROCK inhibitörü ile önceden tedavi HESC gerekli değildir Y-27632 adım 2.7 sırasında Y-27632 ile kuluçkaya olduğu gibi yeterli engelleme meydana gelecek - 37 ° C / 5, bir mikroskop altında bakıldığında, koloniler tek hücreler hale kadar% CO2 'de 20 dakika için 10 - inkübe edin. 1 ml'lik bir pipet ile öğütmek hücreleri.
- 40 mikron hücre straine kullanarak 15 ml konik tüp içine HESC medya ve filtre eklehücre kümeleri kaldırmak için r.
- 5 dakika boyunca 160 x g'de santrifüjleyin. Taze hESC medya yeniden süspanse hücre pelet ve kalan Accutase kaldırmak için çözüm tekrarlayın.
- 10 uM Y-27632 ve 100 mm tabak için toplam hücre süspansiyonu transfer jelatin ile kaplı önceden ihtiva eden HESC ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- 30 dakika içinde en az 37 ° C /% 5 CO2 ile inkübe edin.
- Bu süre zarfında MEF'ler jelatin kaplı çanak uyacaktır. Yeni bir 15 ml'lik santrifüj tüpüne 1 mi pipet kullanılarak yapışmayan HESC toplamak ve bir hemositometre kullanılarak hücre yoğunluğu belirlemek.
HESC 3. Elektroporasyon
- 0.22 um bir filtre ve ekleme 10 ng / ml yeniden birleştirici insana ait fibroblast büyüme faktörü 2 (rhFGF2) ile filtre CM-MEF ortam.
- 5 dakika boyunca 160 xg'de yeni bir 15 ml konik tüp ve santrifüj bölümünde 2,9 7,5 x 106 HESC aktarın.
- Üstel Elektronik endüstri için programı seçiniz: elektrogözenekleme kurmak bu süre zarfında250 V, Sığa: ctroporation ve aşağıdaki parametreler, Gerilim set 500 uF ve Direnç: ∞-.
- Süpernatan aspire ve buz soğukluğunda, 0.22 um'den filtre edildi HBSS 0.8 ml hücre pelet yeniden askıya. Steril bir 0.4 cm elektroporasyon küvetine çözeltisini.
- TV-hPITX3-ileri hedefleme yapı (30 mg DNA) ekleyin ve 200 ul pipet ile hafifçe karıştırın. 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bu süre boyunca PITX3 ZFN mRNA'nın tek numuneyi çıkarın ve buz üzerinde defrost. Elektroporasyon küvetine DNA / hücre karışımına aktarımı ZFN mRNA 7.5 ul buzu zaman. 200 ul pipet ile hafifçe karıştırın.
Not: hedefleniyor odağı verimlilik hedefiyle katkıda ana faktör. Böyle PITX3 gibi sessiz genler, EKH ifade değil genler, zor loci kodlama geleneksel homolog rekombinasyon 6 kullanarak hedef. Böylece, bu protokol özel bir DNA çift iplik b uyarılması için insan PITX3 lokusu için tasarlanmış ZFNs kullanmaktadırreak. - Elektroporatörü üzerindeki ekrandaki talimatları izleyerek electroporate.
- 200 ul pipet, 10 ml HESC ortamı içeren 15 ml tüp elektroporasyon küvetine içindekileri aktarmak kullanma. HESC ortam 200 ul bir 15 ml tüp her zaman ve transferi ile iki kez küvet yıkayın. Orada olacak "mukoza gibi" enkaz olumsuz hücre yaşamını etkileyecek lizlenmiş hücrelerden DNA ve protein içeren. Bu artığın ayrılması için 5 dakika boyunca 160 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatantı aspire ve yavaşça gevşetin hücre pelet dokunun. 10 uM Y-27632 içeren MEF-CM desteklenmiş 30 ml yeniden askıya ve MEF'ler ile preplated 3 x 100 mm yemekleri üzerine Replate.
- Günlük medya değiştirin. 2. günde,-Y-27632 çekilebilir ve hücreler HESC ortam sadece büyütülür.
- 2-3 gün sonra,% 50-70 konfluent HESC olmalıdır. Bu noktada antibiyotik seçim (örneğin, 0.5 ug / ml puromisin) başlar.
- Sel koruyungünlük taze HESC / puromycin medya ekleyerek ection. ~ 7 gün sonra küçük koloniler görünür olmalıdır. Antibiyotiğe dirençli MEF'ler alışık değilseniz, MEF'ler cm 2 başına ek 1.0 x 10 4 hücreler ekleyerek takviye edilebilir.
4. Toplama Transgenik HESC Klonlar
- Yaklaşık 14 - (koloniler ~ 1 mm çapa ulaşmış) seçimi 21 gün sonra genişleme ve tarama için plakaları hazırlamak. 5 saat arasında, en az 4 ° C'de Matrigel veya Geltrex bir kısım buz çözme başlayın. Üreticinin talimatlarına uygun olarak seyreltilir ve 3 x 96-çukurlu levhaların her çukuruna 75 ul ekle. Cm2 başına 2.0 x 10 hücre 4 MEFS kaplama ile 3 x 48 oyuklu plakalar hazırlamak. 37 ° C /% 5 CO2 ile iki tabak göre O / N inkübe edin.
- Ertesi gün, bir örgü kesilerek 2 ml'lik bir pipet ucunda, bir 21 G iğne kullanılarak 16-25 parçaya kolonileri keser.
- Aspire 96 oyuklu plakalar Matrigel ve supplem ile değiştirintasyonlu CM-MEF medya. 48 oyuklu plakalar 1 HBSS x ve HESC ortam eklemek yıkayın MEF'ler.
- 200 ul bir pipet kullanarak yavaşça yayılması için bir 48 oyuklu bir plakaya kesilmiştir koloninin 1/3 aktarın. Takviye edilmiş CM-MEF ortamı ihtiva eden ilgili bir 96-yuvalı plaka içine kesilmiş koloninin diğer 2/3 aktarın.
- Her gün ortam değiştirilerek iki tabak muhafaza (MEFS ihtiva eden 48 oyuklu plakalar boyunca 96 oyuklu Matrigel kaplı plakalar ve HESC ortam CM-MEF ortamı eklenmiş ve her ikisi de 0.5 ug / ml puromisin ile desteklenmiş).
- 96 oyuklu plakalar,% 100 konfluent ve daha sonra ilk olarak PCR yoluyla taranması kadar aç.
5. Tarama ve pozitif klonların Genişletilmesi
- Genomik DNA (11 dayanan bir yöntem) hazırlamak tersini plakalar tüm ortamları kaldırmak için, sonra kağıt havlu üzerine kurulayın.
- RT, PBS (100 ul / oyuk her bir yıkama) Aşama 5.1 olarak invert ve blot, her oyuk iki kez yıkayın. -80 ° C f Yeri plakalarya da 1-2 saat hücre lizizi yardımcı olmak için (levhalar böyle süresiz olarak saklanabilir).
- Hücreler sarkosil Lizis Tampon olmak C -80 ° C'de iken (bakınız Tablo 4) (50 ul / kuyucuk). Her kuyuya 5 sonra oda sıcaklığında dakika pipet lizis tamponu için hücreleri, sıcak tabaklar lyse. Nem oluşturmak için, nemli kağıt havlu içeren kapatılabilir bir kap içinde bant, yer her plakanın kenarlarını kapatırlar ve 60 ° C sıcaklıkta O / N inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, -20 ° C mutlak etanol içinde, 10 ml 5M NaCl, 150 ul, iyice karıştırılmakta ve her bir göze 100 ul (Not: NaCI ilave edildiğinde etanol bulutlanmayarak mi?). Dokunun levhalar hafifçe karıştırın (Pipeti yapmak) ve oda sıcaklığında 30 dakika en az bırakmak. Bu süre zarfında çözelti, temiz bir sayfa ve DNA neden olacaktır.
- Daha sonra her bir göze% 70 etanol içinde 150 ul 5.1 adım olarak çözeltisini çıkarın. Yavaşça plaka ters çevirin ve daha önce olduğu gibi kurulayın. Bu adımı bir başka 2x tekrarlayın.
Not: Çökelen DNA, doğal Adhedoku kültürü plastik çözünürlük bu yıkama adımları sırasında yerinden olmaz.) - Son yıkamadan sonra, en yüksek hızda kısa bir süre için santrifüj plakalar en az 30 dakika boyunca, oda sıcaklığında her bir göze daha sonra kurumaya tabanı (veya 37 ° C), DNA'nın konsantre edilmesi için.
- Ekle 40 - 50 ul T0.1E (pH 8.0) ile 1 saat boyunca 65 ° C 'de ve her bir göze bir yer plakalarına ya da TE (pH 8.0) (Tablo 5) ya da 4 ° de CO / K PCR kullanılarak yapılmıştır. Yavaşça, plakanın kenarlarına hafifçe vurarak DNA yeniden süspanse edin. Yeniden süspansiyon haline getirildi, DNA / 10 | il PCR reaksiyonu, 1-2 ul kullanın.
- HPITX3 L kol gen Uzun Şablon PCR Sistemi genişletin kullanma. F ve hPITX3 L kol GFP R astarlar 58 ° C tavlama, 45 saniye uzatma, 35 döngü klonların ilk taramasını gerçekleştirmek.
- Bir% 1 agaroz jeli içinde Hyperladder 1kb ile Electrophorese numuneler, 45 dakika boyunca 100 V'ta GelRed ve UV ışıması suretiyle, pozitif klonları tespit içeren.
- Expa genomik DNA'sını sindirerek PCR pozitif klonların doğrulamaSouthern lekeleme için, bir vektör homoloji kollarının Hindlll ve hibritleşen sondalar 5 've 3' ile birlikte nded klon (aşağıya bakınız) (daha önce tarif edildiği gibi, 1). Problar primer çiftleri hPITX3 5 'prob F, ve Rı ve hPITX3 3' probu F ve R, EcoRI ile sindirilmiş ve genel bir klonlama vektörüne lige kullanılarak PCR ile üretilmiştir.
- Pozitif klonların sayısına bağlı olarak, MEF'ler (cm2 başına 2.0 x 10 hücre 4) ile ön kaplama ile, 6 gözlü bir plakanın 2 kuyu hazırlar.
- Ertesi gün, 1 saat arasında, en az 10 uM-Y-27632 ile, 48 oyuklu bir plaka içerisinde, pozitif klonları ön muamele.
- HBSS pozitif klonlar yıkayın ve Accutase 300 ul ekleyin.
- Koloniler tek hücreler işlendiğinde HESC ortam 1 ml ilave edilir ve 15 ml'lik bir tüp içine toplar.
- Günlük medya değiştirin. 2. günde,-Y-27632 çekilebilir ve hücreler HESC ortamında yetiştirildi.
- % 80 birleşmiş, alt kültür ve Colo kalanını dondurmak - koloniler 70 olduğundaNY fragmanları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PITX3 birlikte özel olarak tasarlanmış PITX3 çinko-parmak çiftinin eş elektroporasyon izlenerek - EGFP özgü bir DNA vektörü verici ve sonraki puromisin seçimi, pozitif HESC genomik klonları başlangıçta PCR taraması (Şekil 1) ile tespit edilmiştir. Bu PCR ile pozitif klonların 5 've 3' özgü problar Güney benek hibridizasyonu,% 19 oranında bir verim ile, PITX3 konumunda (Şekil 2) 1. ekson doğru hedeflemeyi doğruladı. Şekil 3'te gösterilen görüntüler, yayınlanmış bir immünofloresan PA6 stromal hücre farklılaşması protokolü kullanılarak 12,13 farklılaşmayı takiben PITX3 promoteri tarafından tahrik EGFP ekspresyonu göstermektedir. EGFP eş-lokalizasyonu gibi FOXA2 (kırmızı) (Şekil 3A) ve tirosin hidroksilaz (TH, kırmızı) ve orta beyin dopaminerjik nöronları işaretleri ile görüldü, (Şekil 3B) önemlisi Hiçbir beraber-lokalizasyon c iken GABAerjik işaretleyici, gama-aminobutirik asit (; kırmızı GABA) gözlenebilir ould (Şekil 3C).
PCR ürünü (984 bp bant) ile gösterildiği gibi, Şekil 1. Ön genomik PCR taraması. Koloni toplama ve büyümeden sonra, ön genomik PCR taraması için, çok sayıda pozitif klonları tespit edildi. (Klonlar. EGFP geni içinde yer almaktadır primerler hPITX3 L kol gen. Sadece sol hedefleyen kolu dışında yatıyor K, ve hPITX3 L kol GFP R kullanılarak tarandı) Sağ ve sol taraftaki şeritleri 1 kb'dir merdiveni. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
EGFP Şekil 2. Doğrulama HESC çinko parmak nükleazlar kullanarak hPITX3 mahaline hedefleme. Hedefleme doğrulamak için kullanılan strateji, Southern blot (A) şematik. Üst panel şematik hedefleme önce doğal hPITX3 lokusu göstermektedir. Alt panel şematik EGFP transgenin doğru yerleştirilmesini takiben hPITX3 lokusunu tanımlamaktadır. Her bir panel altında Kırmızı ile 5 've 3' sonda Güney benek bağlanacak hangi yerleri göstermek ve Şekil 2B'de. (B) 'PCR ön tarama seçilmektedir doğru hedef koloniler Örnek Güney benek olarak bantların karşılık gelir. Kısaltmalar: EGFP arttırılmış yeşil flüoresan proteini; PGK insan fosfogliserol kinaz promotörü; PURO, puromisin direnç geni. Diğer özellikler: loxp siteleri, mor; poliadenilasyon sekansı, Blue, hPITX3 ekzonlar, turuncu. bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. hPITX3 EGFP HESC PA6 / LSB / SAG / FGF8'i koşulları altında farklılaşmış. (A) FOXA2 (kırmızı), (B) TH (kırmızı) ve (C) GABA (kırmızı) ile etiketli EGFP Immunofluorescent görüntüleri. DAPI (mavi) ile zıt. Barlar, 50 mikron teraziler. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
PITX3 ile birlikte özel tasarlanmış PITX3 çinko-parmak çiftinin eş Elektroporasvon takiben - EGFP -spesifik DNA, verici vektör, ve daha sonra puromisin seçimi, pozitif HESC genomik klonları başlangıçta PCR taraması (Şekil 1) ile tespit edilmiştir. Bu PCR ile pozitif klonların 5 've 3' özgü problar Güney benek hibridizasyonu,% 19 oranında bir verim ile, PITX3 konumunda (Şekil 2) 1. ekson doğru hedeflemeyi doğruladı. Şekil 3'te gösterilen görüntüler, yayınlanmış bir immünofloresan PA6 stromal hücre farklılaşması protokolü kullanılarak 12,13 farklılaşmayı takiben PITX3 promoteri tarafından tahrik EGFP ekspresyonu göstermektedir. Hiçbir beraber-önemlisi lokalizasyonu GABAerjik işareti ile görülemezken, (Şekil 3B), EGFP eş-lokalizasyonu gibi FOXA2 (kırmızı) (Şekil 3A) ve tirosin hidroksilaz (TH-kırmızı) ve orta beyin dopaminerjik nöronları işaretleri ile gözlenebilir , gama-aminobutirik asit (GABA; kırmızı) (Şekil 3C).
ontent "fo: keep-together.within-page =" her zaman ">PCR ürünü (984 bp bant) ile gösterildiği gibi, Şekil 1. Ön genomik PCR taraması. Koloni toplama ve büyümeden sonra, ön genomik PCR taraması için, çok sayıda pozitif klonları tespit edildi. (Klonlar. EGFP geni içinde yer almaktadır primerler hPITX3 L kol gen. Sadece sol hedefleyen kolu dışında yatıyor K, ve hPITX3 L kol GFP R kullanılarak tarandı) Sağ ve sol taraftaki şeritleri 1 kb'dir merdiveni. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. DoğrulamaEGFP HESC çinko parmak nükleazlar kullanılması hPITX3 mahale hedeflenmesi. Hedefleme doğrulamak için kullanılan strateji, Southern blot (A) şematik. Üst panel şematik hedefleme önce doğal hPITX3 lokusu göstermektedir. Alt panel şematik EGFP transgenin doğru yerleştirilmesini takiben hPITX3 lokusunu tanımlamaktadır. Her bir panel altında Kırmızı ile 5 've 3' sonda Güney benek bağlanacak hangi yerleri göstermek ve Şekil 2B'de. (B) 'PCR ön tarama seçilmektedir doğru hedef koloniler Örnek Güney benek olarak bantların karşılık gelir. Kısaltmalar: EGFP arttırılmış yeşil flüoresan proteini; PGK insan fosfogliserol kinaz promotörü; PURO, puromisin direnç geni. Diğer özellikler: loxp siteleri, mor; poliadenilasyon dizisi, mavi, hPITX3 ekzonlar, turuncu. bu fi büyük halini görmek için buraya tıklayınızGüre.
Şekil 3. hPITX3 EGFP HESC PA6 / LSB / SAG / FGF8'i koşulları altında farklılaşmış. (A) FOXA2 (kırmızı), (B) TH (kırmızı) ve (C) GABA (kırmızı) ile etiketli EGFP Immunofluorescent görüntüleri. DAPI (mavi) ile zıt. Barlar, 50 mikron teraziler. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Madde | ml / 100 mi | Katalog No (Tedarikçi) |
| DMEM | 89 | 10566-016 (Life Technologies) |
| Fetal Sığır Serumu | 10 | 16140-071 (Life Technologies) |
| Kalem / Strep | 1 | 15070-063 (Life Technologies) |
Tablo 1.
| Bileşen | Her 100 mm tabak | 60 mm tabak | 6-çukurlu | 48-çukurlu | 96-çukurlu | 75cm 2 şişe |
| HBSS | 5 mi | 2 mi | 1 mi | 0.5 mi | 0.1 mi | 8 mi |
| Accutase | 5 mi | 2 mi | 1 mi | 0.5 mi | 0.1 mi | 8 mi |
| Dispase | 5 mi | 2 mi | 1 mi | - | - | - |
| ESC medya | 10 mi | 6 mi | 3 mi | 0.5 mi | 0.2 mi | 15 mi |
| Matrıgel | - | - | - | - | 0.1ml | - |
Tablo 2.
| Madde | ml / 100 mi | Katalog No (Tedarikçi) | |
| DMEM / F12 | 80 | 11320-033 (Life Technologies) | |
| KSR | 20 | 10828-028 (Life Technologies) | |
| MEM'dir | 1 | 11140-050 (Life Technologies) | |
| GlutaMAX | 1 | 35050-061 (Life Technologies) | |
| Kalem / Strep | 1 | 15070-063 (Life Technologies) | |
| ß-merkaptoetanol | 0.1 | 21985-023 (Sigma-Aldrich) | |
| rhFGF2 | 7 ng / ml [Final] | 233-FB-025 / CF (Ar-Ge Sistemleri) |
| Madde | Konsantrasyon | Katalog No (Tedarikçi) |
| N-Lauroylsarcosine sodyum tuzu çözeltisi (sarkosil) | % 0.5 (a / h) | 61747 (Sigma-Aldrich) |
| EDTA | 10.0 mM | E9884 (Sigma-Aldrich) |
| NaCl | 10.0 mM | S3014 (Sigma-Aldrich) |
| Tris-HCl (pH 7.5) | 10.0 mM | T3253 (Sigma-Aldrich) |
| Proteinaz K | 1.0 mg / ml | BIO-37084 (Bioline Avustralya) |
Tablo 4.
| Madde | Konsantrasyon | Katalog No (Tedarikçi) |
| Tris-HCl (pH 8.0) | 10.0 mM | T3253 (Sigma-Aldrich) |
| EDTA (pH 8.0) | 0.1 mM | E9884 (Sigma-Aldrich) |
Tablo 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Raportör hücre çizgilerinin üretimi, etiket görselleştirmek ve hESC türetilmiş bir heterojen popülasyonda ilgi konusu hücrelerin izole edilmesi için güçlü bir araç sunar. Bununla birlikte, geleneksel homolog rekombinasyon yoluyla hedef geni insan EKH 3 için son derece randımansız olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokolde ZFNs ile birlikte yaygın olarak kullanılan hedefleme vektörü kullanılarak hESC, ekson PITX3 lokusunun bir RP içine verilmesi için nispeten basit bir tekniği açıklar. Bizim ellerde gen hedefleme sistemi (daha önce 6 yayınlanmış benzer) bir doğru hedeflenmektedir PITX3 yerinin içeren puromycin dirençli klonların% 19 ile, verimlidir.
Gen hedefleme kolaylaştırmak için ZFNs kullanarak bir sınırlama evde sıfırdan ZFNs tasarımı güçlüğüdür. Dolayısıyla, bu protokol biz özel kazanmak için pahalı olabilir piyasada mevcut ZFNs, tasarlanmış. & # Kullanılan160; Daha yakın zamanda, sistem TALEN homolog rekombinasyon 9 kullanarak gen hedeflemesi için kullanılmıştır. Talens kullanımı büyük ölçüde gen düzenleme maliyetini azaltır ve süreci hızlandırdığını, in-house dizayn edilebilir. Açıkça bu çalışmada ortaya rağmen yöntemi aynıdır TALEN plazmidler Aşama 3.5 yerine ZFN mRNA kullanılan dışında 9'da gösterildiği gibi, bu protokol, kolayca, TALENS kullanımını içerecek şekilde modifiye edilebilir.
Bu tekniği kullanarak zaman hPSCs log fazı büyüme, olmasını sağlamak için zorunludur (örneğin, kültürler% 70 veya daha fazla birleşik değildir). Bu hücre bölünmesi esnasında çekirdek zarı parçalanmasını takiben çekirdeğe plazmid erişim kazanır kadar önemli olduğunu düşünüyoruz. Bu işlem, DNA içine dahil etmek için verici bölünmesi sırasında homolog yönelik onarım kullanan Dahası, DNA donör sadece vektör DNA sentezi, aşağıdaki DNA içine dahil edecektirvektörleri kapsar.
ZFN yaklaşımı ile ilgili bir diğer potansiyel sınırlama DNA giriş genomunda başka kırılır. Harici 5 've 3' sonda ile Southern melezleştirme doğru entegrasyon tespit Her ne kadar başka genomuna entegrasyonu etkinliklerle ek veya hata-eğilimli onarım algılamaz. İlave birleşme durumları SELEX 3,6 kullanılarak tespit edilebilir ZFN çiftlerinin hedef dışı bölünmesi ise, vektöre spesifik problar kullanılarak Southern hibridizasyonu (örneğin, EGFP) tarafından kontrol edilebilir.
Doğrudan bir PITX3 geninin inaktivasyonu atfedilen olabilir orta beyin dopaminerjik nöronların gelişiminde belirgin etkilerini gözlemlemek yoktu, araştırmacılar bir genin bir kopyasının bozulur herhangi bir hedefleme olay için zararlı olabileceğini akılda tutmalıdır sonuçları analiz ederken ve o hücrenin gelişimi dikkate bu almalısınız. Bu olup olmadığı durum büyük ölçüde bağlı olacaktırgeninde hedeflenmiş olan ve sadece deney yapılarak tespit edilebilir.
Bir PA6 göre farklılaşma protokol 12,13 kullanımıyla çok (Şekil 3) ve sıralama floresan-aktive edilmiş hücre aşağıdaki negatif popülasyonlar karşı pozitif EGFP QPCR kullanılarak, bağışıklık fluorışımasıyla analiz raportör sistemin kalitesini onaylamak mümkün olmuştur (veriler gösterilmemiştir). PITX3 orta beyin dopaminerjik nöronları 14 için bir transkripsiyon faktörü özgü olarak, bir insan PITX3 raportör hücre kuşağının mühendislik ya in vitro ya da hücre PD modelleme yenileme tedavisine çalışmalarda hESC türetilen PITX3 + orta beyin dopaminerjik nöronları kullanımını kolaylaştırmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu protokol açıklanan Çalışma Rejeneratif Tıp Kaliforniya Enstitüsü (CIRM) ile bir işbirliği ittifak parçası olarak Victoria Hükümeti tarafından finanse edilerek mümkün olmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer - 40 μm | BD Biosciences | 352340 | |
| 33 mm - 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4 cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1 kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
References
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential. Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).
- Collin, J., Lako, M. Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells. Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).
- Carroll, D. Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents. Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).
- Boch, J., Bonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).
- Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).
- Smidt, M. P., et al. A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).
Tags
Moleküler Biyoloji Sayı 90 Elektroporasyon insan embriyonik kök hücre genom düzenleme muhabir hücre hattı orta beyin dopaminerjik nöronlar View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
