Summary
Rapportørcellelinjer gir et middel for å visualisere, spore og isolere celler av interesse fra heterogene populasjoner. Det er imidlertid gene-rettet ved hjelp av konvensjonelle homolog rekombinasjon i humane embryoniske stamceller ekstremt ineffektiv. Heri beskriver vi målretting CNS midthjernen spesifikk transkripsjonsfaktor PITX3 locus med EGFP bruker sink-finger nuclease forbedret homolog rekombinasjon.
Abstract
En stor begrensning med dagens menneskelige embryonale stamceller (ESC) differensiering protokoller er den generasjonen av heterogene cellepopulasjoner. Disse kulturene inneholder celler av interesse, men er også forurenset med udifferensierte ESCs, ikke-nevrale derivater og andre neuronale subtyper. Dette begrenser deres anvendelse i in vitro-og in vivo-anvendelser, for eksempel in vitro modell for medisiner eller celleerstatningsterapi. For å hjelpe overvinne dette, reporter cellelinjer, som tilbyr et middel til å visualisere, spore og isolere celler av interesse, kan være konstruert. Men for å oppnå dette i humane embryonale stamceller via konvensjonell homolog rekombinasjon er ekstremt ineffektiv. Denne protokollen beskriver målretting av hypofysen homeobox 3 (PITX3) locus i humane embryonale stamceller ved hjelp av tilpasset designet sink-finger nukleaser, som introduserer stedsspesifikke dobbel tråd DNA pauser, sammen med enPITX3 - EGFP -spesifikk DNA donor vektor. Etter genereringen av PITX3 rapportørcellelinje, kan den deretter bli differensiert ved hjelp av publiserte protokoller for bruk i studier slik som in vitro-Parkinsons sykdom-modellering eller celleerstatningsterapi.
Introduction
Gjeldende embryonale stamceller (ESC) differensiering protokoller resultere i heterogene cellepopulasjoner, spesielt med hensyn til avledning av spesifikke nevronale fenotyper. Således, selv om kulturer inneholder den ønskede cellulære fenotype, annen neuronal, ikke-neuronal og un-differensierte celletyper er ofte tilstede 1. Disse egenskapene begrenser anvendelsen av ESC avledet cellekilder for anvendelse i celleerstatningsterapi og in vitro sykdom modellering.
Genetiske rapportørcellelinjer gir et middel for å visualisere, spore og isolere celler av interesse, under forutsetning av at ekspresjon av rapportørprotein (RP) reproduserer endogen ekspresjon. Bruk av promotorer umiddelbart oppstrøms av et gen kodende område kan brukes til å utlede råolje genetiske reportere, men slike konstruksjoner mangler de nøyaktige regulatoriske elementer som kontrollerer genekspresjon endogent. I motsetning til dette har homolog rekombinasjon imulighet til å sikre high-fidelity uttrykk for RP. I det siste har målretting vektorer konstruert for homolog rekombinasjon ved bestemte geometriske steder av interesse blitt brukt til å målrette RPs i mus ESCs (mESCs) under anvendelse av elektroporering som et middel for DNA leverings 1,2. Men den generasjonen av reporter cellelinjer via konvensjonell homolog rekombinasjon er ekstremt ineffektiv for menneske ESCs (hESCs), og dermed har bare blitt dokumentert i en håndfull saker (anmeldt i 3). Ved å bruke en konstruert kimert protein som inneholder en blanding av en Fok jeg nuclease med stedsspesifikke sinkfingermotiv, kjent under samle sink-finger nukleaser (ZFNs), DNA-dobbelttrådbrudd kan bli innført på forhåndsbestemt genomisk loci. Når en DNA-vektor med homologi til begge sider av den doble DNA-tråd pause blir tilsatt, kan den genomiske sete repareres ved homolog rekombinasjon, slik at inkorporering av donor-DNA-sekvensen. Denne teknikken har vist seg nyttig feller genomisk redigering i både menneskelige primære celler 4,5 og hESCs 6,7. Nyere arbeid har utnyttet transkripsjons aktivator lignende effektor nukleaser (Talens), transkripsjonsfaktorer som brukes av plantepatogener 8, til hjelp i utformingen av stedsspesifikke nukleaser ni.
I den følgende protokoll demonstrerer vi generering av et hESC rapportørcellelinje ved elektroporering av en EGFP inneholdende homolog målretting vektor 6 sammen med ZFNs for human hypofyse homeobox 3 (PITX3) locus. Etter antibiotika utvalg i 2-3 uker, kan hESCs med riktig integrert DNA manuelt plukket, utvidet og skjermet i utgangspunktet via PCR, og senere validert av Southern blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer utføres i en steril laminær strømningshette. Alle medier og løsninger er ekvilibrert til 37 ° C med mindre annet er angitt.
1. Utvidelse av menneske PSC avtaler (hESCs og hiPSCs, WA-09 brukes i denne Protocol) for Transfeksjon
Merk: Det er ikke nødvendig å utvide hESCs på Matrigel eller Geltrex. hESCs ekspandert på mus embryonale fibroblaster (MEFs) kan brukes for elektroporering eller nucleofection etter en MEF fjerningstrinnet (se avsnitt 2.8).
- Forbered 1 x 100 mm form og 1 x 75cm2 kolbe DR4 MEFs på 2,0 x 10 4 celler pr cm2 i MEF medium (se Tabell 1) på retter forhåndsbelagt med 0,1% vekt / volum gelatin.
Merk: CF1, kan BLK6 eller MF1 MEFs brukes, men anbefales det at antibiotikaresistente MEF linjer blir brukt, for eksempel, DR410. - Den neste dagen, passasje hESCs bort på en 100 mm fatet pre-belagt med MEFs utarbeidet i avsnitt 1.1. For å gjøre dette ASPIsats hESC media fra kulturer retter, vaske hESCs med Ca2 + / Mg2 + -gratis Hanks 'balanserte saltløsning (HBSS), tilsett dispase (se tabell 2 for aktuelle volumer) og plasser i en fuktet inkubator ved 37 ° C / 5% CO 2. Etter 3-5 min inkubering aspireres dispase og forsiktig vask 1 - 2 ganger med HBSS for å fjerne MEFs. Legg hESC medium (se tabell 3) og ved hjelp av en celleskrape, eller 5 ml-pipette, forsiktig skrape koloniene av overflaten av dyrkningsskål.
- Samle koloni fragmentene i suspensjon fra dyrkningsskål inn i et 15 ml sentrifugerør. Skyll kultur tallerken med hESC media og overføring til 15 ml tube. Vær nøye med å ikke bryte opp klumper i enkeltceller eller små fragmenter.
- Sentrifuger i 5 min ved 160 xg til pellet koloni fragmenter.
- Aspirer supernatant. Trykk bunnen av 15 ml tube med fingeren for å løsne koloni fragment pellet. Forsiktig resuspender koloni fragmenter i hESC media i henhold til split ratio (normallya delt forhold mellom 1: 4 og 1: 8 er hensiktsmessig). Vær veldig forsiktig med å gjengi klumper i enkeltceller eller små fragmenter som dette vil påvirke replating effektivitet.
- Før replating hESC fragmenter på MEFs vaske 1x med HBSS. Sakte legger en passende mengde (se tabell 2) cellesuspensjon som inneholder hESC fragmenter i hESC media til retter pre-belagt med MEFs.
- Plasser kultur retter på hylle i kuvøse og bevege seg sakte frem og tilbake og fra side til side for å fordele koloni fragmenter.
- Bytt hESC media daglig.
- For å forberede betinget media fra MEFs (MEF-CM) vaske 75 cm 2 kolbe pre-belagt med MEFs 1 x med HBSS. Legg hESC media. Etter 24 timer, samle betinget media og erstatte med frisk hESC media. Gjenta daglig i maksimalt 12 dager. Oppbevar MEF-CM ved 4 ° C inntil nødvendig.
2. Utarbeidelse av menneske ESCs for Transfeksjon
- Observere veksten av hESCsunder et mikroskop daglig. Når kolonier bli 40-50% konfluent, plate 3 x 100 mm retter med 2,0 x 10 5 MEFs per cm 2.
- Når kolonier bli 60 - 70% konfluent de er klar til å bli tilført. 'Groom' kolonier ved å fjerne differensierte kolonier eller koloni kjerner.
Merk: Som vi tror høyere transfeksjon og målretting effektivitet oppstår når cellene er i log fase vekst, er det foreslått at elektroporering bli gjennomført før hESCs nå ≥ 70% konfluens. - Vask hESC kolonier med HBSS og legge Accutase.
Merk: Det er ikke nødvendig å forbehandle hESCs med ROCK inhibitor Y-27632 som tilstrekkelig hemming vil skje når inkubert med Y-27632 under trinn 2.7 - Inkuber i 10-20 min ved 37 ° C / 5% CO2 inntil kolonier gjengis enkeltceller som sett under et mikroskop. Knus celler med en 1 ml pipette.
- Legg hESC media og filter i en 15 ml konisk rør ved hjelp av en 40 mikrometer celle strainer å fjerne celle klumper.
- Sentrifuger ved 160 xg i 5 min. Resuspender cellen pellet i friske hESC media og gjenta for å fjerne eventuelle rester Accutase løsning.
- Resuspender celler i hESC media inneholdende 10 uM Y-27632 og overføre den totale cellesuspensjonen til en 100 mm fatet pre-belagt med gelatin.
- Inkuber ved 37 ° C / 5% CO2 i minst 30 min.
- I løpet av denne tiden MEFs vil følge den gelatin belagt parabolen. Samle ikke-adherente hESCs ved hjelp av en 1 ml-pipette inn i en ny 15 ml sentrifugerør og bestemme celletetthet ved hjelp av et hemocytometer.
3. Electroporation av hESCs
- Filtrer CM-MEF media og som benytter et 0,22 mikrometer filter og tilsett 10 ng / ml rekombinant human-fibroblast-vekstfaktor 2 (rhFGF2).
- Overfør 7,5 x 106 hESCs fra avsnitt 2.9 til et nytt 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 160 xg i 5 min.
- I løpet av denne tiden satt opp electroporator: Velg program for eksponentiell electroporation og angi følgende parametere, Spenning: 250 V, Capacitance: 500 mF, og Resistance: ∞-.
- Aspirer supernatanten og re-suspendere cellepelleten i 0,8 ml iskald 0,22 um filtrert HBSS. Overfør løsningen til en steril 0,4 cm kyvette electroporation.
- Legg TV-hPITX3-forward targeting konstruere (30 mikrogram DNA) og bland forsiktig med en 200 mL pipette. Inkuber på is i 5 min. I løpet av denne tiden fjerne en delmengde av PITX3 ZFN mRNA og tine på is. Når tint transfer 7,5 mL av ZFN mRNA til DNA / celle blandingen i elektroporering kyvette. Bland forsiktig med en 200 ul pipette.
Merk: locus være målrettet er den viktigste faktoren som bidrar til målretting effektivitet. Loci koding tause gener, gener som ikke er uttrykt i ESCs, slik som PITX3 er vanskelige å målrette homolog rekombinasjon ved hjelp av konvensjonelle seks. Dermed benytter denne protokollen tilpasset designet ZFNs for menneske PITX3 locus å indusere en DNA dobbel tråd break. - Electroporate ved å følge instruksjonene på skjermen på electroporator.
- Ved hjelp av en 200 mL pipette overføre innholdet fra electroporation kyvetten til en 15 ml tube inneholder 10 ml hESC media. Vask kyvetten to ganger med 200 mL av hESC media hver gang, og overføring til en 15 ml tube. Det vil være "slimlignende" rester bestående av DNA og protein fra de lyserte celler som vil negativt påvirke celleoverlevelse. Sentrifuger ved 160 xg i 5 minutter for å fjerne dette avfall.
- Aspirer supernatanten og banke forsiktig på cellen pellet å løsne. Re-suspendere i 30 ml supplert MEF-CM inneholder 10 mikrometer Y-27632 og replate på 3 x 100 mm retter forhåndsbelagte med MEFs.
- Endre media daglig. På dag 2, kan Y-27632 trekkes tilbake og celler dyrket i hESC media bare.
- Etter 2-3 dager ble hESCs bør være 50-70% konfluent. På dette punkt begynner antibiotikum valg (f.eks, 0,5 ug / ml puromycin).
- Opprettholde selection ved å legge fersk hESC / puromycin media daglig. Etter ~ 7 dager små kolonier bør være synlig. Dersom antibiotikaresistente MEFs ikke blir brukt, kan MEFs suppleres ved å legge ytterligere 1,0 x 10 4 celler per cm 2.
4. Plukke transgene hESC Clones
- Omtrent 14 - 21 dager etter valg (når kolonier har nådd ~ 1 mm diameter) forberede plater for ekspansjon og screening. Begynn med avriming en alikvot av Matrigel eller Geltrex ved 4 ° C i minst 5 timer. Fortynne som per produsentens instruksjoner og tilsett 75 mL til hver brønn på 3 x 96-brønners plater. Forbered 3 x 48-brønners plater ved plating MEFs på 2,0 x 10 4 celler per cm 2. Inkuber begge platene O / N ved 37 ° C / 5% CO2.
- Den følgende dag dissekere kolonier i 16 til 25 stykker ved hjelp av en 21 G nål på enden av en 2 ml pipette ved å kutte et rutenett.
- Aspirer Matrigel fra 96-brønners plater og erstatte med kompletteresi avdelinger CM-MEF medier. Vask MEFs i 48-brønners plater 1 x med HBSS og legge hESC medier.
- Ved å bruke en 200 ul pipette forsiktig overføre 1/3 av den dissekerte koloni i en 48-brønns plate for ekspansjon. Overfør den andre 2/3 av den dissekerte koloni inn i en tilsvarende 96-brønners plate inneholdende supplert CM-MEF medier.
- Opprettholde begge platene ved å endre media daglig (supplert CM-MEF media for 96-brønners matrigel belagte plater og hESC media for 48-brønners plater som inneholder MEFs; både supplert med 0,5 mikrogram / ml puromycin).
- Utvid til 96-brønners plater er 100% sammenflytende, og deretter screene innledning via PCR.
5. Screening og utvidelse av positive kloner
- For å forberede genomisk DNA (metode basert på 11) Fjern alle medier fra plater ved å snu, deretter blot på tørkepapir.
- Skyll hver brønn to ganger med RT PBS (100 ul / brønn hver vask), invertere og blot som for trinn 5.1. Plasser platene på -80 ° C feller 1 - 2 timer for å hjelpe til cellelyse (platene kan lagres på ubestemt tid som dette).
- Mens cellene er ved -80 ° C gjør Sarcosyl Lysis Buffer (se tabell 4) (50 ul / brønn). For å lysere cellene, varme plater i 5 min ved RT og deretter pipette lysis buffer i hver brønn. Forsegle kantene av hver plate med tape, sted i en lukket beholder inneholdende fuktige papirhåndklær for å skape luftfuktigheten, og inkuberes O / N ved 60 ° C.
- Etter inkubasjon legge 150 ul 5M NaCl til 10 ml -20 ° C absolutt etanol, bland godt, og tilsett 100 mL til hver brønn (Merk: etanol vil gå overskyet når NaCl er lagt til). Tapp platene forsiktig for å blande (ikke pipette) og la stå i et minimum av 30 min ved RT. I løpet av denne tiden oppløsningen vil gå klar og DNA vil utfelles.
- Fjern-løsning som i trinn 5.1 og deretter legge til 150 ul 70% etanol til hver brønn. Snu platen forsiktig og blot som før. Gjenta dette trinnet en ytterligere 2x.
Merk: Fordi utfelt DNA naturlig adheres til vevskultur plast den ikke komme ut av stilling under disse vasketrinnene.) - Etter den siste vask kort sentrifuger platene ved topphastighet for å konsentrere DNA til bunnen av hver brønn og deretter lufttørket ved romtemperatur (eller 37 ° C) i minst 30 min.
- Legg 40 - 50 mikroliter T0.1E (pH8.0) (se tabell 5) eller TE (pH8.0) til hver brønn og platene sted ved 65 ° C i 1 time eller ved 4 ° CO / N før bruk for PCR. Resuspender DNA ved forsiktig å banke på de sider av platen. Bruk 1-2 pl av re-suspendert DNA / 10 pl PCR-reaksjon.
- Bruke Utvid Long Mal PCR System med hPITX3 L arm gen. F og hPITX3 L arm GFP R primere utføre innledende screening av kloner ved 58 ° C annealing, 45 sek forlengelse, 35 sykluser.
- Electrophorese prøver med Hyperladder 1kb i en 1% agarosegel inneholdende GelRed ved 100 V i 45 min, og detektere positive kloner via UV-belysning.
- Validere PCR positive kloner ved å fordøye genomisk DNA fra ekspansjon gjennom sinebindes kloner (se nedenfor) med Hindlll og hybridiserende prober 5 'og 3' av vektoren homologi armer til et Southern blot (som tidligere beskrevet i 1). Prober blir generert ved hjelp av PCR ved bruk av primerpar hPITX3 5 'probe F og R, og hPITX3 3'-probe F og R, spaltet med EcoRI og ligert inn i en generell kloningsvektor.
- Avhengig av antallet av positive kloner, forberede to brønner på en 6-brønners plate ved å pre-plating med MEFs (2.0 x 10 4 celler pr cm 2).
- Den neste dag pretreat positive kloner i 48-brønners plate med 10 uM Y-27632 i minst 1 time.
- Vask positive kloner med HBSS og legge til 300 ul Accutase.
- Når kolonier er gjengitt enkeltceller, tilsett 1 ml hESC media og samles opp i 15 ml tube.
- Endre media daglig. På dag 2, kan Y-27632 trekkes tilbake og celler dyrket i hESC media.
- Når koloniene er 70 - 80% konfluent, subkultur og fryse resten av coloNY fragmenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter co-electroporation av spesialdesignede PITX3 sink-finger par sammen med PITX3 - EGFP -spesifikk DNA donor vektor, og påfølgende puromycin utvalg, ble positive hESC kloner utgangspunktet oppdaget via genomisk PCR-screening (figur 1). Southern blot-hybridisering av disse PCR-positive kloner med 5 'og 3' prober spesifikke bekreftet korrekt målretting til exon 1 i PITX3 locus (figur 2), med en effektivitet på 19%. Immunofluorescerende bildene som er vist i figur 3 viser EGFP ekspresjon drevet av PITX3 promoter skilles ved hjelp av en publisert PA6 stromale celledifferensiering protokoll 12,13. Samlokalisering av EGFP kunne observeres med markører for midthjernen dopaminerge nevroner som FOXA2 (red) (figur 3A) og tyrosin hydroksylase (TH; rød) (Figur 3B), mens viktigere ingen samlokalisering c ould observeres med GABAerg markør, gamma-aminosmørsyre (GABA; rød) (Figur 3C).
Figur 1. Innledende genomisk PCR-screening. Følge koloni plukking og ekspansjon, foreløpig genomisk PCR-screening har oppdaget en rekke positive kloner, som vist ved PCR-produktet (bånd på 984 bp). (Kloner ble screenet ved hjelp av primere hPITX3 L arm gen. F, som ligger rett utenfor den venstre målretting arm, og hPITX3 L arm GFP R som ligger innenfor EGFP genet.) Høyre og venstre kjørefelt er en 1 kb stigen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Validering av EGFP målretting til hPITX3 locus bruker sink finger nukleaser i hESCs. (A) Skjematisk av Southern blot strategi ansatt for å validere målgruppe. Toppanelet skjematisk illustrerer den innfødte hPITX3 locus før målretting. Bunnpanelet skjematisk skildrer hPITX3 locus følgende riktig innsetting av EGFP transgenet. De røde linjer under hvert panel illustrere steder for den 5 'og 3' Southern blot sonder vil binde, og tilsvarer de bandene i figur 2B. (B) Representant Southern blot av riktig målrettede kolonier valgt fra PCR pre-screening. Forkortelser: EGFP, forbedret grønt fluorescerende protein; PGK, menneskelig phosphoglycerol kinase arrangøren; PURO, puromycin motstand genet. Andre funksjoner: loxP nettsider, lilla; polyadenylerings-sekvens, blue, hPITX3 eksoner, orange. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. hPITX3-EGFP hESCs differensiert i henhold PA6 / LSB / SAG / FGF8 forhold. Immunofluorescent bilder av EGFP merket med (A) FOXA2 (red), (B) TH (rød) og (C) GABA (rød). Kontra med DAPI (blå). Skalerer barer, 50 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Etter co-electroporation av spesialdesignede PITX3 sink-finger paret sammen med PITX3 - EGFP -spesifikk DNA-donor vektor, og påfølgende puromycin markering, hESC positive kloner ble først oppdaget via genomisk PCR-screening (figur 1). Southern blot-hybridisering av disse PCR-positive kloner med 5 'og 3' prober spesifikke bekreftet korrekt målretting til exon 1 i PITX3 locus (figur 2), med en effektivitet på 19%. Immunofluorescerende bildene som er vist i figur 3 viser EGFP ekspresjon drevet av PITX3 promoter skilles ved hjelp av en publisert PA6 stromale celledifferensiering protokoll 12,13. Samlokalisering av EGFP kunne observeres med markører for midthjernen dopaminerge nevroner som FOXA2 (red) (figur 3A) og tyrosin hydroksylase (TH; rød) (Figur 3B), mens viktigere ingen samlokalisering kunne observeres med GABAergic markør , gamma-aminosmørsyre (GABA; rød) (Figur 3C).
ontent "fo: keep-together.within-page =" alltid ">Figur 1. Innledende genomisk PCR-screening. Følge koloni plukking og ekspansjon, foreløpig genomisk PCR-screening har oppdaget en rekke positive kloner, som vist ved PCR-produktet (bånd på 984 bp). (Kloner ble screenet ved hjelp av primere hPITX3 L arm gen. F, som ligger rett utenfor den venstre målretting arm, og hPITX3 L arm GFP R som ligger innenfor EGFP genet.) Høyre og venstre kjørefelt er en 1 kb stigen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Validering avEGFP målretting til hPITX3 locus bruker sink finger nukleaser i hESCs. (A) Skjematisk av Southern blot strategi ansatt for å validere målgruppe. Toppanelet skjematisk illustrerer den innfødte hPITX3 locus før målretting. Bunnpanelet skjematisk skildrer hPITX3 locus følgende riktig innsetting av EGFP transgenet. De røde linjer under hvert panel illustrere steder for den 5 'og 3' Southern blot sonder vil binde, og tilsvarer de bandene i figur 2B. (B) Representant Southern blot av riktig målrettede kolonier valgt fra PCR pre-screening. Forkortelser: EGFP, forbedret grønt fluorescerende protein; PGK, menneskelig phosphoglycerol kinase arrangøren; PURO, puromycin motstand genet. Andre funksjoner: loxP nettsider, lilla; polyadenyleringssekvensen, blå, hPITX3 eksoner, orange. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Figur 3. hPITX3-EGFP hESCs differensiert i henhold PA6 / LSB / SAG / FGF8 forhold. Immunofluorescent bilder av EGFP merket med (A) FOXA2 (red), (B) TH (rød) og (C) GABA (rød). Kontra med DAPI (blå). Skalerer barer, 50 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Stoff | ml / 100 ml | Katalog Nr (Leverandør) |
| DMEM | 89 | 10566-016 (Life Technologies) |
| Fetal Bovine Serum | 10 | 16140-071 (Life Technologies) |
| Pen / Strep | 1 | 15070-063 (Life Technologies) |
Tabell 1.
| Komponent | 100 mm fatet | 60 mm fatet | 6-brønns | 48-brønns | 96-brønn | 75cm 2 kolbe |
| HBSS | 5 ml | 2 ml | 1 ml | 0,5 ml | 0,1 ml | 8 ml |
| Accutase | 5 ml | 2 ml | 1 ml | 0,5 ml | 0,1 ml | 8 ml |
| Dispase | 5 ml | 2 ml | 1 ml | - | - | - |
| hESC media | 10 ml | 6 ml | 3 ml | 0,5 ml | 0,2 ml | 15 ml |
| Matrigel | - | - | - | - | 0,1 ml | - |
Tabell 2.
| Stoff | ml / 100 ml | Katalog Nr (Leverandør) | |
| DMEM / F12 | 80 | 11320-033 (Life Technologies) | |
| KSR | 20 | 10828-028 (Life Technologies) | |
| NEAA | 1 | 11140-050 (Life Technologies) | |
| GlutaMAX | 1 | 35050-061 (Life Technologies) | |
| Pen / Strep | 1 | 15070-063 (Life Technologies) | |
| ß-mercaptoethanol | 0.1 | 21985-023 (Sigma-Aldrich) | |
| rhFGF2 | 7 ng / ml [siste] | 233-FB-025 / CF (R & D Systems) |
| Stoff | Konsentrasjon | Katalog Nr (Leverandør) |
| N-lauroyl-sarcosin sodium salt løsning (Sarcosyl) | 0,5% (w / v) | 61747 (Sigma-Aldrich) |
| EDTA | 10,0 mM | E9884 (Sigma-Aldrich) |
| NaCl | 10,0 mM | S3014 (Sigma-Aldrich) |
| Tris-Cl (pH 7,5) | 10,0 mM | T3253 (Sigma-Aldrich) |
| Proteinase K | 1,0 mg / ml | BIO-37084 (Bioline Australia) |
Tabell 4.
| Stoff | Konsentrasjon | Katalog Nr (Leverandør) |
| Tris-Cl (pH8.0) | 10,0 mM | T3253 (Sigma-Aldrich) |
| EDTA (pH8.0) | 0,1 mM | E9884 (Sigma-Aldrich) |
Tabell 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generering av reporter cellelinjer tilbyr et kraftig middel til å spore, visualisere og isolere celler av interesse fra en heterogen befolkning avledet fra hESCs. Imidlertid har genet målretting via konvensjonell homolog rekombinasjon vist seg å være meget ineffektive for menneske ESCs 3. I denne protokollen beskriver vi en relativt enkel teknikk for innføring av en RP i exon én av PITX3 locus, i hESCs ved hjelp av en allment tilgjengelig målretting vektor sammen med ZFNs. I våre hender genet targeting system er effektivt, med 19% av puromycin-resistente kloner inneholdende en fullstendig målrettet PITX3 locus (lik den som tidligere er publisert 6).
En begrensning med hjelp ZFNs til rette genet targeting er vanskeligheten med å utforme ZFNs fra grunnen av i huset. Derfor, i denne protokollen vi brukte spesialdesignet kommersielt tilgjengelige ZFNs, som kan være dyrt å anskaffe. & #160; Mer nylig har den TALEN systemet blitt brukt til å målrette genet ved hjelp av homolog rekombinasjon 9. Bruken av Talens reduserer kostnadene av genet redigering og kan være utformet i huset, for å påskynde prosessen. Selv om det ikke er eksplisitt vist i denne studien, kan denne protokollen lett modifiseres til å omfatte bruk av Talens som metodikken er den samme, unntatt Talen plasmider anvendt i trinn 3,5 i stedet for ZFN mRNA, som vist i 9.
Når du bruker denne teknikken er det viktig å sikre at hPSCs er i log fase vekst, (f.eks kulturer er ikke 70% eller mer sammenflytende). Vi tror at dette er kritisk som plasmidet skaffer seg adgang til kjernen følgende atom konvolutt sammenbrudd under celledeling. Videre vil DNA-donor vektoren bare innlemme i DNA etter DNA-syntese som denne prosess utnytter homologi-rettet reparasjon under divisjon å innlemme donor-DNA inn i detgenom.
En annen potensiell begrensning med ZFN tilnærming er å innføre DNA-bryter andre steder i genomet. Selv Southern hybridisering med ekstern 5 'og 3' prober oppdager riktig integrasjon det ikke vil avdekke ytterligere integrering hendelser eller utsatt for feil reparasjon andre steder i genomet. Ekstra integrasjonshendelser kan bli undersøkt ved Southern-hybridisering ved bruk av vektorspesifikke prober (f.eks EGFP), mens ut-target spalting av ZFN parene kan detekteres ved hjelp av SELEX 3,6.
Selv om vi ikke observere noen åpenbare effekter i utviklingen av midthjernen dopaminerge nevroner som kan knyttes direkte til inaktivering av ett PITX3 genet, bør forskere huske på at noen målretting hendelse hvor en kopi av et gen blir forstyrret kan være skadelig for utvikling av cellen og bør ta hensyn til dette når analysere resultatene. Hvorvidt dette er tilfelle vil avhenge i stor gradden genet blir målrettet og kan bare påvises ved å utføre forsøket.
Ved hjelp av en PA6 basert differensiering protokoll 12,13 vi var i stand til å bekrefte troskap reporteren systemet ved immunfluorescens (figur 3) og qPCR analyse av EGFP positive vs negative populasjoner følgende fluorescens-aktivert celle sortering (data ikke vist). Som PITX3 er en transkripsjonsfaktor som er spesifikk for midthjernen dopaminerge nevroner 14, vil prosjektering av et menneske PITX3 reporter cellelinje forenkle bruken av PITX3 + midthjernen dopaminerge nevroner avledet fra hESCs i studier av enten in vitro PD modellering eller celle replacement therapy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet som er beskrevet i denne protokollen ble gjort mulig med midler fra den viktorianske regjeringen som en del av et samarbeids allianse med Californian Institute for Regenerative Medicine (CIRM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer - 40 μm | BD Biosciences | 352340 | |
| 33 mm - 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4 cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1 kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
References
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential. Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).
- Collin, J., Lako, M. Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells. Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).
- Carroll, D. Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents. Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).
- Boch, J., Bonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).
- Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).
- Smidt, M. P., et al. A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).
Tags
Molecular Biology Electroporation humane embryonale stamceller genom redigering reporter cellelinje midthjernen dopaminerge nevroner View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
