Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ג'ין משופר Nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי

Published: August 23, 2014 doi: 10.3791/51764
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Drug Discovery Biology, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University

Summary

שורות תאי כתב להציע אמצעים כדי להמחיש, לעקוב ובודד תאים של ריבית מאוכלוסיות הטרוגניות. עם זאת, באמצעות רקומבינציה הומולוגית קונבנציונלית בתאי גזע עובריים אנושיים מיקוד הגן הוא מאוד לא יעיל. בזאת, אנו מתארים מיקוד מוקד PITX3 CNS המוח התיכון ספציפי גורם שעתוק עם EGFP באמצעות רקומבינציה הומולוגית המשופרת nuclease אבץ האצבע.

Abstract

מגבלה העיקרית אחת עם פרוטוקולי התמיינות תאי גזע עובריים אנושיים (ESC) הנוכחיים היא הדור של אוכלוסיות תאים הטרוגנית. תרבויות אלה מכילות תאים של עניין, אלא גם נגועות בESCs מובחן, נגזרים שאינם עצביים ותת עצביים אחרים. זה מגביל את השימוש שלהם במבחנה וביישומי vivo, כגון דוגמנות במבחנה לגילוי סמים או טיפול בתחליפי תא. כדי לסייע להתגבר על זה, שורות תאי כתב, אשר מציעות אמצעים כדי לחזות, מסלול ובודד תאים של עניין, יכולות להיות מהונדסות. עם זאת, כדי להשיג את זה בתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות רקומבינציה הומולוגית הקונבנציונלית היא מאוד לא יעילה. פרוטוקול זה מתאר מיקוד של homeobox יותרת המוח 3 הלוקוס (PITX3) בתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות nucleases אבץ אצבע מעוצב בהתאמה אישית, המציג את הפסקות DNA גדיל פעמיים ספציפיות לאתר, יחד עםPITX3 - וקטור תורם DNA -specific EGFP. בעקבות הדור של הקו הסלולרי כתב PITX3, זה יכול לאחר מכן להיות מובחן באמצעות פרוטוקולים שפורסמו לשימוש במחקרים כגון במבחנה דוגמנות מחלה או החלפת תא הטיפול בפרקינסון.

Introduction

פרוטוקולי התמיינות תאי גזע עובריים (ESC) זרם לגרום לאוכלוסיות תאים הטרוגנית, במיוחד ביחס לגזירה של פנוטיפים עצביים ספציפיים. כך, למרות שתרבויות להכיל את הפנוטיפ הסלולרי הרצוי, עצבי אחרים, סוגים מובחנים בלתי הלא עצבי ותא הם לעתים קרובות הווה 1. מאפיינים אלה מגבילים את היישום של ESC נגזר מקורות תא לשימוש בטיפול בתחליפי תא ובדוגמנות מחלה מבחנה.

שורות תאי כתב גנטיות מציעות אמצעים כדי להמחיש, לעקוב ובודד תאים של עניין, ובלבד שהביטוי של חלבון הכתב (RP) מתרבה ביטוי אנדוגני. שימוש במקדמים באופן מיידי במעלה הזרם של אזור קוד גנטי יכול לשמש כדי להפיק כתבים גנטיים גולמיים אך מבנים כגון חסרי אלמנטי רגולציה המדויקים השולטים על ביטוי גני אנדוגני. בניגוד לכך, רקומבינציה הומולוגית מציעההזדמנות להבטיח ביטוי באיכות גבוהה של RP. בעבר, מיקוד וקטורים מיועדים לרקומבינציה הומולוגית בלוקוסים ספציפיים של עניין היה בשימוש למקד RPS בעכבר ESCs (mESCs) באמצעות electroporation כאמצעי למשלוח DNA 1,2. עם זאת הדור של שורות תאי כתב באמצעות רקומבינציה הומולוגית הקונבנציונלית הוא מאוד לא יעיל לESCs האנושי (hESCs), ובכך תועד רק בקומץ של מקרים (שנסקר ב3). על ידי שימוש בחלבון מהונדס chimeric המכיל שילוב של פוק אני nuclease עם מוטיבים אבץ אצבע ספציפי לאתר, ידועים קולקטיבי אבץ האצבע nucleases (ZFNs), יכולות להיות הציגו הפסקות כפולות גדיל DNA בלוקוסים הגנומי שנקבע מראש. כאשר וקטור DNA עם הומולוגיה לשני הצדדים של הפסקת גדיל הדנ"א כפול הוא הוסיף, האתר הגנומי ניתן לתיקון על ידי רקומבינציה הומולוגית, המאפשר שילוב של רצף תורם DNA. טכניקה זו הוכיחה f שימושיתאו עריכה הגנומי בשני תאים ראשוניים אנושיים 4,5 וhESCs 6,7. nucleases עבודה מאוחרת יותר נצלה שעתוק כמו activator-מפעיל (TALENs), גורמי שעתוק המשמשים את מפעל פתוגנים 8, כדי לסייע בעיצוב של nucleases ספציפי לאתר 9.

בפרוטוקול הבא אנחנו מדגימים את הדור של שורת תאי כתב hESC ידי electroporation של EGFP המכיל וקטור מיקוד הומולוגי 6 יחד עם ZFNs לhomeobox יותרת המוח האנושי 3 הלוקוס (PITX3). בעקבות בחירתה אנטיביוטיקה ל2-3 שבועות, hESCs עם DNA המשולב בצורה נכונה יכול להיות ידני הרים, הרחיב והוקרן בתחילה באמצעות PCR, ומאומתים בהמשך על ידי סופג דרום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים מתבצעים בזרימה למינרית סטרילי. כל כלי התקשורת והפתרונים equilibrated ל37 ° C אלא אם צוינו אחרת.

.1 הרחבת PSCs האדם (hESCs וhiPSCs, WA-09 שימוש בפרוטוקול זה) לTransfection

הערה: אין צורך להרחיב את hESCs על Matrigel או Geltrex. hESCs הרחיב על fibroblasts העכבר העוברי (MEFs) יכול לשמש לelectroporation או nucleofection הבא צעד הסרת MEF (ראה סעיף 2.8).

  1. הכן 1 x 100 צלחת מ"מ ובקבוק 1 x 75cm2 של MEFs DR4 ב2.0 x 10 4 תאים לכל 2 סנטימטר בתקשורת MEF (ראה טבלה 1) על מנות מראש מצופה עם 0.1% w / ג'לטין v.
    הערה: CF1, MEFs BLK6 או MF1 ניתן להשתמש, לעומת זאת, מומלץ שמשמשים קווים MEF עמידים לאנטיביוטיקה, למשל, DR410.
  2. למחרת, hESCs מעבר על צלחת 100 מ"מ מראש מצופה MEFs מוכן בסעיף 1.1. כדי לעשות ASPI זהשיעור תקשורת hESC ממנות תרבויות, לשטוף hESCs עם תמיסת מלח המאוזן Ca 2 + / Mg2 + -חינם 'הנקס (HBSS), להוסיף Dispase (ראה טבלה 2 כרכים מתאימים) ומקום בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2. בעקבות 3-5 דגירה דקות, לשאוב Dispase ולשטוף בעדינות 1 - 2 פעמים עם HBSS להסיר MEFs. הוסף מדיה hESC (ראה טבלה 3) ובאמצעות מגרד תא, או פיפטה 5 מ"ל, בעדינות לגרד מושבות את פני השטח של צלחת התרבות.
  3. לאסוף את שברי המושבה בהשעיה ממנת התרבות לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. צלחת התרבות לשטוף עם תקשורת hESC והעברה לצינור 15 מ"ל. היזהר שלא לשבור את הגושים לתוך תאים בודדים או שברים קטנים.
  4. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב160 XG כדי גלולה שברי מושבה.
  5. לשאוב supernatant. הקש תחתון של צינור 15 מ"ל עם אצבע כדי לשחרר גלולה בר מושבה. שברים בעדינות resuspend מושבה בתקשורת hESC על פי יחס פיצול (normallya לפצל יחס בין 1: 4 ו 1: 8 הוא מתאים). להיות זהיר מאוד שלא להפוך את הגושים לתוך תאים בודדים או שברים קטנים כמו זה ישפיע replating יעילות.
  6. לפני replating ברי hESC על MEFs לשטוף 1x עם HBSS. לאט לאט להוסיף כמות מתאימה (ראה טבלה 2) של השעיה תא המכילה שברי hESC בתקשורת hESC מנות מראש מצופה MEFs.
  7. מניחים מנות תרבות על מדף בחממה ולנוע באיטיות קדימה ואחורה ומצד לצד כדי לפזר באופן שווה שברי מושבה.
  8. החלף תקשורת hESC יומית.
  9. כדי להכין תקשורת מותנית מMEFs (MEF-CM) לשטוף 75 סנטימטר 2 בקבוק מראש מצופה MEFs x 1 עם HBSS. הוסף מדיה hESC. בעקבות 24 שעות, לאסוף התנה תקשורת ולהחליף עם תקשורת hESC טריות. חזור מדי יום לתקופה מקסימלית של 12 ימים. אחסן MEF-CM ב 4 ° C. עד צורך.

2 הכנת ESCs האדם לTransfection

  1. שים לב לצמיחה של hESCsתחת מיקרוסקופ יומי. כאשר המושבות הפכו 40-50% ומחוברות, צלחת 3 x 100 מנות מ"מ עם 2.0 x 10 5 MEFs לסנטימטר 2.
  2. כאשר המושבות הפכו 60 - ומחוברות 70% הם מוכנים להיות transfected. מושבות 'חתן' על ידי הסרת מושבות מובחנות או ליבות מושבה.
    הערה: כפי שאנו מאמינים transfection גבוה יותר ויעילות מיקוד מתרחשת כאשר תאים נמצאים בצמיחת שלב יומן, הוא הציע שייערך electroporation לפני hESCs להגיע ≥ confluency 70%.
  3. לשטוף מושבות hESC עם HBSS ולהוסיף Accutase.
    הערה: אין צורך hESCs מראש פינוק עם מעכב ROCK Y-27632 עיכוב מספיק כיתרחש כאשר הודגרו עם Y-27632 במהלך שלב 2.7
  4. דגירה של 10 - 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2 עד מושבות ניתנות תאים בודדים כמתחת למיקרוסקופ. תאי Triturate עם טפטפת מ"ל 1.
  5. הוסף מדיה hESC ומסנן לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל באמצעות straine 40 מיקרומטר תאr כדי להסיר גושי תא.
  6. צנטריפוגה ב160 XG למשך 5 דקות. גלולה תא הגלולה בתקשורת hESC טריות וחזור כדי להסיר כל פתרון Accutase השיורי.
  7. תאים גלולים בתקשורת hESC המכילים 10 מיקרומטר Y-27632 ולהעביר כוללת ההשעיה התא לצלחת 100 מ"מ מראש מצופה עם ג'לטין.
  8. דגירה על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2 למשך תקופה מינימאלית של 30 דקות.
  9. במהלך תקופה זו MEFs ידבק צלחת ג'לטין מצופה. לאסוף hESCs לא חסיד באמצעות פיפטה 1 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל טרי ולקבוע צפיפות תאים באמצעות hemocytometer.

.3 Electroporation של hESCs

  1. תקשורת CM-MEF מסנן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולהוסיף 10 גורם גדילת רקומביננטי מ"ל / פיברובלסטים אנושיים ng 2 (rhFGF2).
  2. העבר את 7.5 x 106 hESCs מסעיף 2.9 לצינור חדש 15 מ"ל חרוטי ו צנטריפוגות ב XG 160 למשך 5 דקות.
  3. בתקופה זו הקימה את electroporator: בחר תכנית לele מעריכיctroporation ולהגדיר את הפרמטרים הבאים, מתח: 250 V, קיבוליות: 500 μF, והתנגדות: ∞-.
  4. לשאוב supernatant מחדש להשעות תא גלולה ב 0.8 מ"ל של 0.22 מיקרומטר HBSS המסונן קר כקרח. מעבירים את הפתרון לקובט electroporation 0.4 סנטימטר סטרילי.
  5. הוספת מבנה TV-hPITX3 קדימה מיקוד (30 מיקרוגרם DNA) ומערבבים בעדינות עם טפטפת 200 μl. לדגור על קרח למשך 5 דקות. במהלך תקופה זו להסיר aliquot אחד PITX3 ZFN mRNA ולהפשיר על קרח. כאשר העברה מופשרת 7.5 μl של ZFN mRNA לDNA / תערובת תא בקובט electroporation. מערבבים בעדינות עם טפטפת 200 μl.
    הערה: הלוקוס על הכוונת הוא הגורם העיקרי שתורם למיקוד יעילות. קידוד לוקוסים גנים שקטים, גנים לא באו לידי ביטוי בESCs, כגון PITX3 קשים למקד באמצעות רקומבינציה הומולוגית הקונבנציונלית 6. לפיכך, פרוטוקול זה מנצל אישית מעוצב ZFNs למוקד PITX3 האנושי כדי לגרום b גדיל הדנ"א כפולהreak.
  6. Electroporate על ידי הבא במסך ההוראות המופיעה על electroporator.
  7. בעזרת פיפטה 200 μl להעביר את התוכן מקובט electroporation לצינור 15 מ"ל מכיל 10 מ"ל תקשורת hESC. שטוף את קובט פעמיים עם 200 μl של תקשורת hESC בכל פעם ולהעביר צינור 15 מ"ל. יהיו "כמו רירי-" פסולת בהיקף של דנ"א וחלבון מתאי lysed אשר להשפיע לרעה על הישרדות תא. צנטריפוגה ב160 XG למשך 5 דקות כדי להסיר שאריות זה.
  8. לשאוב supernatant ולטפוח בעדינות תא גלולה כדי לשחרר. להשעות Re ב30 מ"ל בתוספת MEF-CM מכיל 10 מיקרומטר Y-27632 וreplate על 3 x 100 מנות מ"מ preplated עם MEFs.
  9. לשנות את התקשורת מדי יום. ביום 2, Y-27632 ניתנים למשיכה ותאים שגודלו בתקשורת hESC בלבד.
  10. אחרי 2-3 ימים hESCs צריך להיות 50-70% ומחוברות. בשלב זה מתחיל בחירת אנטיביוטיקה (לדוגמא, puromycin 0.5 מיקרוגרם / מ"ל).
  11. לשמור על selשיקוף על ידי הוספת מדיה hESC / puromycin טרי מדי יום. לאחר ~ 7 ימים מושבות קטנות צריכה להיות גלויות. אם לא נעשה שימוש בMEFs עמיד לאנטיביוטיקה, MEFs ניתן להשלים על ידי הוספת 1.0 x 10 4 תאים נוספים לסנטימטר 2.

.4 המשובטים המהונדסים hESC בחירה

  1. כ 14 - 21 יום בעקבות בחירתה (כאשר מושבות הגיעו קוטר ~ 1 מ"מ) להכין צלחות להתרחבות ולהקרנה. בגין על ידי הפשרת aliquot של Matrigel או Geltrex על 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימאלית של 5 שעות. לדלל לפי הוראות יצרנים ולהוסיף 75 μl היטב בכל צלחות 3 x 96 היטב. הכן צלחות 3 x 48 היטב על ידי ציפוי MEFs ב2.0 x 10 4 תאים לכל 2 סנטימטר. דגירה שני צלחות O / N ב 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2.
  2. למחרת לנתח מושבות ל16-25 חתיכות באמצעות 21 מחט G בסוף פיפטה 2 מ"ל על ידי חיתוך רשת.
  3. לשאוב Matrigel מצלחות 96 היטב ולהחליף עם supplemתקשורת ented CM-MEF. MEFs לשטוף בצלחות 48 היטב x 1 עם HBSS ולהוסיף מדיה hESC.
  4. בעזרת פיפטה 200 μl בעדינות להעביר 1/3 של המושבה גזור לתוך צלחת 48 היטב להרחבה. העבר את 2/3 האחר של המושבה גזור לתוך צלחת 96 היטב מתאימה המכילה תקשורת CM-MEF תוספת.
  5. לשמור על שני הצלחות על ידי שינוי בתקשורת יומית (בתוספת תקשורת CM-MEF לצלחות matrigel מצופה 96 היטב ותקשורת hESC לצלחות 48 היטב המכילות MEFs; שני בתוספת 0.5 מיקרוגרם / puromycin מ"ל).
  6. להרחיב עד 96-גם צלחות הן 100% ומחוברות ולאחר מכן בתחילה מסך באמצעות PCR.

.5 הקרנה והרחבת שיבוטים החיוביים

  1. כדי להכין הדנ"א הגנומי (שיטה המבוססת ביום 11 ב) להסיר את כל המדיה מצלחות על ידי היפוך, ואז למחוק על מגבות נייר.
  2. לשטוף היטב כל פעמיים עם RT PBS (100 μl / גם כל שטיפה), להפוך וכתם כלצעד 5.1. צלחות מקום בf -80 מעלות צלזיוסאו 1 - שעה 2 כדי לסייע בתמוגה תא (ניתן לאחסן צלחות ללא הגבלת זמן כזה).
  3. בעוד תאים נמצאים ב-80 ° C לעשות Sarcosyl תמוגה חוצץ (ראה טבלה 4) (50 μl / טוב). לlyse תאים, צלחות חמות למשך 5 דקות ב RT אז חיץ תמוגה פיפטה לתוך כל טוב. סוגר את הקצוות של כל צלחת עם קלטת, מקום במכל רב סגר המכיל מגבות נייר לחות כדי ליצור לחות, ודגירת O / N ב 60 ° C.
  4. לאחר הדגירה להוסיף 150 μl של 5M NaCl ל10 מ"ל של אתנול מוחלט -20 ° C, ומערבב היטב, ומוסיף 100 μl היטב כל אחד (הערה: אתנול ילך מעונן כאשר NaCl מתווסף). צלחות ברז בעדינות לתערובת (לא פיפטה) ולהשאיר למשך תקופה מינימאלית של 30 דקות ב RT. במהלך תקופה זו הפתרון ילך ברור וDNA יהיה להאיץ.
  5. הסר פתרון כמו בשלב 5.1 לאחר מכן להוסיף 150 μl של 70% אתנול היטב כל אחד. הפוך צלחת בעדינות ולמחוק כמו קודם. חזור על שלב זה 2x נוסף.
    הערה: מאחר DNA זירז באופן טבעי adheמיל לפלסטיק תרבית רקמה זה לא להיות וחלץ במהלך שלבי כביסה אלה.)
  6. לאחר לשטוף הסופי צלחות צנטריפוגות בקצרה במהירות השיא להתרכז DNA לתחתית של כל אחד גם אז אוויר יבש ב RT (או 37 מעלות צלזיוס) במשך דקות לפחות 30.
  7. הוספת 40 - 50 T0.1E μl (pH8.0) (ראה לוח 5) או TE (pH8.0) לכל צלחות גם ומקום ב65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 או 4 ° CO / N לפני השימוש לPCR. Resuspend DNA בעדינות על ידי הקשה על צידי הצלחת. השתמש 1-2 μl של תגובת PCR מחדש מושעה μl DNA / 10.
  8. באמצעות להרחיב מערכת PCR תבנית ארוכה עם זרוע L hPITX3 gen. F ופריימרים R GFP זרוע L hPITX3 לבצע סינון ראשוני של שיבוטים ב58 חישול C °, 45 הארכת שניות, 35 מחזורים.
  9. דגימות Electrophorese עם 1kb Hyperladder ב1% agarose ג'ל מכילים GelRed ב100 V 45 דקות ולזהות שיבוטים חיוביים באמצעות תאורת UV.
  10. לאמת שיבוטים חיוביים PCR ידי לעכל הדנ"א הגנומי מexpaשיבוטים nded (ראה להלן) עם בדיקות HindIII והכלאות 5 'ו 3' של זרועות ההומולוגיה וקטור לכתם דרום (כפי שתואר לעיל ב1). בדיקות מופקות על ידי PCR באמצעות זוגות פריימר hPITX3 5 'הבדיקה F ו R, וhPITX3 3' בדיקה F ו R, מתעכל עם EcoRI וligated לתוך וקטור שיבוט כללי.
  11. תלוי במספר של שיבוטים חיוביים, להכין 2 בארות של צלחת 6 היטב על ידי מראש ציפוי עם MEFs (2.0 x 10 4 תאים לכל 2 סנטימטר).
  12. למחרת pretreat שיבוטים חיוביים בצלחת 48 היטב עם 10 מיקרומטר Y-27632 למינימום של 1 שעה.
  13. לשטוף שיבוטים חיוביים עם HBSS ולהוסיף 300 μl של Accutase.
  14. כאשר מושבות ניתנות תאים בודדים, להוסיף 1 מ"ל של תקשורת hESC ולאסוף לתוך צינור 15 מ"ל.
  15. לשנות את התקשורת מדי יום. ביום 2, Y-27632 ניתנים למשיכה ותאים שגודלו בתקשורת hESC.
  16. כאשר מושבות הן 70 - 80% ומחוברות, תת ולהקפיא את יתרת קולושברים בניו יורק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעקבות שיתוף electroporation של זוג אבץ אצבע PITX3 המותאם אישית תוכנן יחד עם PITX3 - וקטור תורם DNA -specific EGFP, ובחירת puromycin שלאחר מכן, שיבוטים hESC חיוביים בתחילה זוהו באמצעות הקרנה הגנומי PCR (איור 1). הכלאה כתם הדרומית של שיבוטים אלה PCR החיוביים עם 5 'ו 3' בדיקות ספציפיות אישרה מיקוד נכון לאקסון 1 של מוקד PITX3 (איור 2), עם יעילות של 19%. תמונות Immunofluorescent שמוצגים באיור 3 מדגימות ביטוי EGFP מונע על ידי האמרגן PITX3 הבא בידול באמצעות פרוטוקול התמיינות תאי סטרומה PA6 פורסם 12,13. Co-לוקליזציה של EGFP יכולה להיבחן עם סמנים של נוירונים דופאמין המוח התיכון כגון FOXA2 (אדום) (איור 3 א) וhydroxylase טירוזין (TH; אדום) (איור 3 ב), ואילו חשוב לא שיתוף הלוקליזציה ג ולד להיות שנצפה עם סמן GABAergic, חומצת גמא-aminobutyric (GABA; אדום)   (איור 3 ג).

איור 1
איור 1 הקרנת PCR גנומי ראשונית. בעקבות קטיף מושבה והתרחבות, הקרנת PCR גנומי ראשונית זוהתה שיבוטים חיוביים רבים כפי שמוצג על ידי מוצר PCR (להקה ב984 נ"ב). (המשובטים הוקרנו באמצעות פריימרים זרוע L hPITX3 gen. F, שנמצא ממש מחוץ לעזבה זרוע המיקוד, וזרוע L hPITX3 GFP R הנמצא בתוך גן EGFP.) ימני ונתיבי צד השמאלי הם 1 kb סולם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

lways "> איור 2
איור 2 תיקוף EGFP מיקוד למוקד hPITX3 באמצעות nucleases אצבע האבץ בhESCs. () סכמטי של אסטרטגית כתם הדרום המועסק כדי לאמת את המיקוד. סכמטי הפנל העליון ממחיש את מוקד hPITX3 ילידים לפני המיקוד. סכמטי הפנל התחתון מתאר את מוקד hPITX3 הבא הכנסה נכונה של transgene EGFP. הקווים האדומים מתחת לכל פנל להמחיש את האתרים שבם 5 'ו 3' בדיקות כתם דרום יחייבו, ומתאימים ללהקות באיור 2. כתם דרום נציג של מושבות ממוקדות בצורה נכונה שנבחרו מPCR לפני הקרנה (B). קיצורים: EGFP, חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר; PGK, אמרגן קינאז phosphoglycerol האנושי; פורו, גן התנגדות puromycin. תכונות אחרות: אתרי loxP, סגול; רצף polyadenylation, blue, אקסונים hPITX3, כתום. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3 hPITX3-EGFP hESCs מובחן בתנאי PA6 / LSB / SAG / FGF8. תמונות Immunofluorescent של EGFP שכותרתו עם () FOXA2 TH (אדום) (אדום), (ב) ו (ג) GABA (אדום). Counterstained עם DAPI (כחול). סולמות ברים, 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בעקבות שיתוף electroporation של זוג אבץ אצבע PITX3 המותאם אישית תוכנן יחד עם PITX3 - -specific EGFP וקטור DNA תורם, ובחירת puromycin שלאחר מכן, השיבוטים hESC חיוביים בתחילה זוהו באמצעות הקרנה הגנומי PCR (איור 1). הכלאה כתם הדרומית של שיבוטים אלה PCR החיוביים עם 5 'ו 3' בדיקות ספציפיות אישרה מיקוד נכון לאקסון 1 של מוקד PITX3 (איור 2), עם יעילות של 19%. תמונות Immunofluorescent שמוצגים באיור 3 מדגימות ביטוי EGFP מונע על ידי האמרגן PITX3 הבא בידול באמצעות פרוטוקול התמיינות תאי סטרומה PA6 פורסם 12,13. Co-לוקליזציה של EGFP יכולה להיבחן עם סמנים של נוירונים דופאמין המוח התיכון כגון FOXA2 (אדום) (איור 3 א) וhydroxylase טירוזין (TH; אדום) (איור 3 ב), ואילו חשוב לא שיתוף לוקליזציה יכולה להיבחן עם סמן GABAergic , גמא aminobutyric חומצה (GABA; אדום) (איור 3 ג).

ontent "FO: לשמור-together.within-page =" תמיד "> איור 1
איור 1 הקרנת PCR גנומי ראשונית. בעקבות קטיף מושבה והתרחבות, הקרנת PCR גנומי ראשונית זוהתה שיבוטים חיוביים רבים כפי שמוצג על ידי מוצר PCR (להקה ב984 נ"ב). (המשובטים הוקרנו באמצעות פריימרים זרוע L hPITX3 gen. F, שנמצא ממש מחוץ לעזבה זרוע המיקוד, וזרוע L hPITX3 GFP R הנמצא בתוך גן EGFP.) ימני ונתיבי צד השמאלי הם 1 kb סולם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2 תיקוףEGFP מיקוד למוקד hPITX3 באמצעות nucleases אצבע האבץ בhESCs. () סכמטי של אסטרטגית כתם הדרום המועסק כדי לאמת את המיקוד. סכמטי הפנל העליון ממחיש את מוקד hPITX3 ילידים לפני המיקוד. סכמטי הפנל התחתון מתאר את מוקד hPITX3 הבא הכנסה נכונה של transgene EGFP. הקווים האדומים מתחת לכל פנל להמחיש את האתרים שבם 5 'ו 3' בדיקות כתם דרום יחייבו, ומתאימים ללהקות באיור 2. כתם דרום נציג של מושבות ממוקדות בצורה נכונה שנבחרו מPCR לפני הקרנה (B). קיצורים: EGFP, חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר; PGK, אמרגן קינאז phosphoglycerol האנושי; פורו, גן התנגדות puromycin. תכונות אחרות: אתרי loxP, סגול; רצף polyadenylation, אקסונים כחולים, hPITX3, כתום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של fi זהתרשים.

איור 3
איור 3 hPITX3-EGFP hESCs מובחן בתנאי PA6 / LSB / SAG / FGF8. תמונות Immunofluorescent של EGFP שכותרתו עם () FOXA2 TH (אדום) (אדום), (ב) ו (ג) GABA (אדום). Counterstained עם DAPI (כחול). סולמות ברים, 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

חומר מ"ל / 100 מ"ל מס 'קטלוגי (ספק)
DMEM 89 10566-016 (Life Technologies)
בסרום שור עוברי 10 16140-071 (Life Technologies)
העט / סטרפטוקוקוס 1 15070-063 (Life Technologies)

טבלת 1.

רכיב צלחת 100 מ"מ צלחת 60 מ"מ 6 גם 48 היטב 96 היטב 75cm 2 בקבוק
HBSS 5 מ"ל 2 מ"ל 1 מ"ל 0.5 מ"ל 0.1 מ"ל 8 מ"ל
Accutase 5 מ"ל 2 מ"ל 1 מ"ל 0.5 מ"ל 0.1 מ"ל 8 מ"ל
Dispase 5 מ"ל 2 מ"ל 1 מ"ל - - -
תקשורת hESC 10 מ"ל 6 מ"ל 3 מ"ל 0.5 מ"ל 0.2 מ"ל 15 מ"ל
Matrigel - - - - 0.1ml -

טבלה 2.

</ שולחן>

טבלה 3.

חומר מ"ל / 100 מ"ל מס 'קטלוגי (ספק)
DMEM / F12 80 11320-033 (Life Technologies)
KSR 20 10828-028 (Life Technologies)
NEAA 1 11140-050 (Life Technologies)
GlutaMAX 1 35050-061 (Life Technologies)
העט / סטרפטוקוקוס 1 15070-063 (Life Technologies)
SS-mercaptoethanol 0.1 21985-023 (Sigma-Aldrich)
rhFGF2 7 ng / [סופי] מ"ל 233-FB-025 / CF (R & D מערכות)
חומר ריכוז מס 'קטלוגי (ספק)
תמיסת מלח נתרן N-Lauroylsarcosine (Sarcosyl) 0.5% (w / v) 61747 (Sigma-Aldrich)
EDTA 10.0 מ"מ E9884 (Sigma-Aldrich)
NaCl 10.0 מ"מ S3014 (Sigma-Aldrich)
טריס-Cl (pH7.5) 10.0 מ"מ T3253 (Sigma-Aldrich)
Proteinase K 1.0 מ"ג / מ"ל BIO-37,084 (ביוליין אוסטרליה)

לוח 4.

חומר ריכוז מס 'קטלוגי (ספק)
טריס-Cl (pH8.0) 10.0 מ"מ T3253 (Sigma-Aldrich)
EDTA (pH8.0) 0.1 מ"מ E9884 (Sigma-Aldrich)

לוח 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הדור של שורות תאי כתב מציע אמצעי רב עוצמה למעקב אחר, לחזות ובודד תאים של ריבית מאוכלוסייה הטרוגנית נגזרת מhESCs. עם זאת, גן המיקוד באמצעות רקומבינציה הומולוגית הקונבנציונלית הוכיח להיות מאוד יעיל לESCs אדם 3. בפרוטוקול זה אנו מתארים טכניקה פשוטה יחסית להכנסת RP לאקסון אחד לוקוס PITX3, בhESCs באמצעות וקטור מיקוד זמין באופן נרחב יחד עם ZFNs. בידיים שלנו את מערכת מיקוד הגן היא יעילה, עם 19% משיבוטי puromycin עמיד המכילים מוקד PITX3 ממוקד בצורה נכונה (דומה לזה שפורסם בעבר 6).

מגבלה בשימוש בZFNs כדי להקל על מיקוד גן היא הקושי בעיצוב ZFNs מאפס בבית. כך, בפרוטוקול זה השתמש אישית מעוצב ZFNs זמין מסחרי, אשר יכול להיות יקר לרכישה. & #160; לאחרונה, מערכת Talen הייתה בשימוש כבר גן המיקוד באמצעות רקומבינציה הומולוגית 9. השימוש בTALENs מקטין באופן משמעותי את עלות עריכת גן ויכול להיות מתוכנן בבית, זירוז התהליך. למרות שלא הפגין במפורש במחקר זה, פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות לשלב את השימוש בTALENs כמתודולוגיה זהה, מלבד פלסמידים Talen משמשים בשלב 3.5 במקום ZFN mRNA, כפי שמוצג ב9.

בעת שימוש בטכניקה זו היא הכרחי על מנת להבטיח כי hPSCs נמצא בצמיחת שלב יומן, (למשל, תרבויות אינן 70% או יותר ומחוברות). אנו מאמינים כי זו היא קריטית כגישת רווחי פלסמיד לגרעין הבא התמוטטות מעטפת גרעין בעת ​​חלוקת תא. יתר על כן, וקטור תורם DNA ישלב רק לDNA הבא סינתזת דנ"א כתהליך זה מנצל תיקון מכוון הומולוגיה במהלך החלוקה לשלב DNA התורם להגנום.

מגבלה אפשרית נוספת עם גישת ZFN היא המבוא של DNA פורץ במקום אחר בגנום. למרות שכלת דרום עם 5 חיצוניים 'ו 3' בדיקות מזהה שילוב נכון זה לא יאתר אירועי אינטגרציה נוספים או תיקון מועד לטעויות במקום אחר בגנום. ניתן לבחון אירועי אינטגרציה נוספים על ידי הכלאת דרום באמצעות בדיקות וקטור ספציפי (לדוגמא, EGFP) ואילו מחשוף מחוץ היעד של זוגות ZFN ניתן לאתר באמצעות Selex 3,6.

למרות שאנחנו לא צופים כל השפעה ברורה בפיתוח של נוירונים דופאמין המוח התיכון שניתן לייחס ישירות לאיון של גן PITX3 אחד, חוקרים צריכים לזכור כי כל מקרה שבו מיקוד עותק אחד של גן מופר עלול לפגוע פיתוח של תא ושצריך לקחת את זה בחשבון בעת ​​ניתוח תוצאות. בין אם זה המקרה יהיה תלוי במידה רבהעל הגן להיות ממוקד ועשויים להיות הוברר רק על ידי ביצוע הניסוי.

באמצעות פרוטוקול בידול מבוסס PA6 12,13 היינו יכול לאשר את נאמנותה של מערכת הכתב על ידי immunofluorescence (איור 3) וניתוח qPCR של EGFP החיובי לעומת אוכלוסיות שליליות הבא תא הקרינה המופעל מיון (מידע לא מוצג). כPITX3 הוא גורם שעתוק ספציפי לנוירונים דופאמין המוח התיכון 14, ההנדסה של שורת תאי כתב PITX3 אדם תקל על השימוש בנוירונים דופאמין המוח התיכון PITX3 + נגזרים מhESCs בלימודים של כל אחד במבחנה דוגמנות PD או טיפול בתחליפי תא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש לי המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

העבודה המתוארת בפרוטוקול זה התאפשרה על ידי מימון מהממשלה ויקטוריאני, כחלק מברית של שיתוף פעולה עם מכון קליפורניה לרפואת רגנרטיבית (CIRM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) GlobalStem GSC-6004G
Gelatin Sigma G1393-100ML
HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) Life Technologies 14175-095
Dispase StemCell Technologies 7923
Cell Scraper Corning 3008
Accutase Life Technologies A11105-01
Y27632 Axon Medchem Axon 1683
Cell Strainer - 40 μm BD Biosciences 352340
33 mm - 0.22 μm filter Millipore SLGP033RS
rhFGF2 R&D Systems 233-FB-025/CF
Electroporator BioRad 165-2661
0.4 cm electroporation cuvette BioRad 165-2088
Human TV-hPITX3-forward targeting construct Addgene 31942
ZFN Kit; Human PITX3 Sigma-Aldrich CKOZFN1050-1KT
Puromycin InvivoGen ant-pr-1
Matrigel BD Biosciences 354277
Geltrex Life Technologies A1569601
NaCl Sigma-Aldrich S3014
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 10566-016
Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) Life Technologies 16140-071
Pen/Strep Life Technologies 15070-063
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) Life Technologies 11320-033
KnockOut Serum Replacement (KSR) Life Technologies 10828-028
MEM Non-Essential Amino Acids  (NEAA) Life Technologies 11140-050
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
ß-mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) Sigma-Aldrich 61747
EDTA Sigma-Aldrich E9884
Trizma Hydrochloride Sigma-Aldrich T3253
Proteinase K solution (20 mg/ml) Bioline Australia BIO-37084
Expand Long Template PCR System Roche Australia 11681834001
hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ GeneWorks, Australia
hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ GeneWorks, Australia
HyperLadder 1 kb  Bioline Australia BIO-33025
GelRed Jomar Bioscience, Australia 41003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
  2. Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential. Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).
  3. Collin, J., Lako, M. Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells. Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).
  4. Carroll, D. Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents. Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).
  5. Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
  6. Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
  7. Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).
  8. Boch, J., Bonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).
  9. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
  10. Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).
  11. Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).
  12. Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).
  13. Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).
  14. Smidt, M. P., et al. A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 90 Electroporation תאי גזע עובריים אנושיים עריכת הגנום קו סלולארי כתב נוירונים דופאמין המוח התיכון
ג&#39;ין משופר Nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hartley, B. J., Fabb, S. A., Finnin, … More

Hartley, B. J., Fabb, S. A., Finnin, B. A. L., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (90), e51764, doi:10.3791/51764 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter