Summary
Reporter cellinjer erbjuder ett sätt att visualisera, spåra och isolera celler av intresse från heterogena populationer. Dock är gen-inriktning med konventionell homolog rekombination i humana embryonala stamceller extremt ineffektivt. Häri beskriver vi riktar CNS hjärnan specifik transkriptionsfaktor PITX3 locus med EGFP användning av zink-finger nukleas förstärkt homolog rekombination.
Abstract
En stor begränsning med dagens mänskliga embryonala stamceller (ESC) differentieringsprotokoll är den generation av heterogena cellpopulationer. Dessa kulturer innehåller cellerna av intresse, men är också förorenat med odifferentierade ekonomiska och sociala råd, icke-neurala derivat och andra neuronala subtyper. Detta begränsar deras användning i in vitro och in vivo applikationer, såsom in vitro-modeller för läkemedelsutveckling eller cellersättningsterapi. För att lösa det här, reporter cellinjer, som erbjuder ett sätt att visualisera, spåra och isolera celler av intresse, kan manipuleras. Men för att uppnå detta på mänskliga embryonala stamceller genom konventionell homolog rekombination är extremt ineffektivt. Detta protokoll beskriver inriktning av hypofys homeobox 3 (PITX3) locus i humana embryonala stamceller med hjälp av specialdesignade zinkfinger nukleaser, som inför platsspecifika dubbelsträngat DNA raster, tillsammans med enPITX3 - EGFP specifik DNA-donatorvektor. Efter alstringen av PITX3 reporter-cellinje, kan det sedan differentieras med användning av publicerade protokoll för användning i studier som in vitro Parkinsons sjukdom modellering eller cellersättningsterapi.
Introduction
Aktuella embryonala stamceller (ESC) differentieringsprotokoll leda heterogena cellpopulationer, särskilt med avseende på härledningen av specifika neuronala fenotyper. Även om kulturer innehåller den önskade cellulära fenotyp, andra neuronala, icke-neuronala och un-differentierade celltyper är ofta närvarande 1. Dessa egenskaper begränsa tillämpningen av ESC härledda cellkällor för användning i cellersättningsterapi och in vitro modellsjukdom.
Genetiska reporter cellinjer erbjuder ett sätt att visualisera, spåra och isolera celler av intresse, under förutsättning att uttrycket av reporterprotein (RP) återger endogen uttryck. Användning av promotorer omedelbart uppströms om en gen kodande region kan användas för att härleda råa genetiska reportrar men sådana konstruktioner saknar de exakta regulatoriska element som styr endogena genuttryck. Däremot erbjuder homolog rekombination imöjlighet att se till hifi-uttryck för RP. I det förflutna, targeting vektorer konstruerade för homolog rekombination vid specifika loci av intresse har använts för att rikta RP i mus ESCS (mESCs) med användning av elektroporering som ett sätt att DNA-leveransen 1,2. Men generering av reporter cellinjer via konventionella homolog rekombination är extremt ineffektivt för mänskliga ekonomiska och sociala råd (hESCs), och därför har endast dokumenterats i en handfull fall (över 3). Genom att använda en konstruerad chimär protein innehållande en fusion av en Fok I nukleas med platsspecifika zinkfingermotiv, kända som zinkfinger nukleaser (ZFNs), DNA dubbel-strängbrott kan införas på förutbestämd iska loci. När en DNA-vektor med homologi till båda sidorna av DNA-dubbelsträngbrott tillsätts, kan den genomiska platsen repareras genom homolog rekombination, vilket möjliggör inkorporeringen av DNA-donatorsekvens. Denna teknik har visat sig vara till nytta feller genom-redigering i både humana primära celler 4,5 och hESCs 6,7. Nyare arbete har utnyttjas transkriptions aktivator liknande effektor nukleaser (Talens), transkriptionsfaktorer som används av växtpatogener 8, för att hjälpa till i utformningen av platsspecifika nukleaser 9.
I följande protokoll visar vi genereringen av en hESC reporter cellinjen genom elektroporation av en EGFP innehållande homolog målinriktning vektor 6 tillsammans med ZFNs för det humana hypofys homeobox 3 (PITX3) locus. Efter antibiotikaselektion i 2-3 veckor, kan hESCs med korrekt integrerat DNA manuellt plockas expanderade och screenas initialt via PCR, och därefter bekräftats av Southern blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer utförs i en steril laminärt flöde huva. Alla medier och lösningar bringas till jämvikt vid 37 ° C om inte annat anges.
1 Utbyggnad av mänskliga PSC (hESCs och hiPSCs, WA-09 används i detta protokoll) för transfektion
Obs: Det är inte nödvändigt att utvidga hESCs på Matrigel eller Geltrex. hESCs expanderade på mus embryonala fibroblaster (MEF) kan användas för elektroporering eller nucleofection efter en MEF borttagning steg (se avsnitt 2.8).
- Bered 1 x 100 mm skålen och 1 x 75cm2 kolv DR4 MEF på 2,0 x 10 4 celler per cm2 i MEF media (se tabell 1) på rätter i förväg belagda med 0,1% vikt / volym gelatin.
Notera: CF1, kan BLK6 eller MF1 MEF användas, dock är det rekommenderat att antibiotikaresistenta MEF linjer används, till exempel, DR410. - Nästa dag, passage hESCs på en 100 mm skål för-klädd med MEF upprättad i avsnitt 1.1. För att göra detta aspiränta hESC media från kulturer rätter, tvätta hESCs med Ca2 + / Mg2 + -fri Hanks balanserade saltlösning (HBSS), till Dispase (se tabell 2 för lämpliga volymer) och placera i en fuktad inkubator vid 37 ° C / 5% CO2. Efter 3-5 min inkubation, aspirera Dispase och försiktigt tvätta 1-2 gånger med HBSS för att avlägsna MEF. Lägg hESC medier (se tabell 3) och med användning av en cellskrapa, eller 5 ml pipett, försiktigt skrapa kolonier bort från ytan av odlingsskålen.
- Samla kolonifragment i avstängning från odlingsskålen i en 15 ml centrifugrör. Skölj odlingsskål med hESC media och överföring till 15 ml tub. Var noga med att inte bryta upp klumpar i enstaka celler eller små fragment.
- Centrifugera i 5 minuter vid 160 xg för att pellekolonifragment.
- Aspirera supernatanten. Tryck ned i 15 ml rör med fingret för att lossa kolonifragment pellet. Försiktigt resuspendera kolonifragment i hESC media enligt delningsfaktorn (normallya dela förhållandet mellan 1: 4 och 1: 8 är lämpligt). Var ytterst noga med att inte göra klumpar i enstaka celler eller små fragment som detta kommer att påverka omstryka effektivitet.
- Innan omstryka hESC fragment på MEF tvätta 1x med HBSS. Långsamt en lämplig mängd (se tabell 2) cellsuspension innehåller hESC fragment i hESC media till maträtter för-pläterade med MEF.
- Placera odlingsskålar på hyllan i kuvös och gå långsamt fram och tillbaka och från sida till sida för att omfördela kolonifragment.
- Byt hESC medier dagligen.
- För att förbereda rade media från MEF (MEF-CM) tvätta 75 cm 2-kolv för-klädd med MEF 1 x med HBSS. Lägg hESC medier. Efter 24 timmar, samla rade media och ersätta med färsk hESC media. Upprepa dagligen i högst 12 dagar. Förvara MEF-CM vid 4 ° C tills det behövs.
2 Beredning av mänskliga ekonomiska och sociala råd för transfektion
- Beakta tillväxten av hESCsunder ett mikroskop dagligen. När samhällena blir 40-50% sammanflytande, plattan 3 x 100 mm skålar med 2,0 x 10 5 MEF per cm2.
- När kolonierna blir 60-70% konfluenta de är redo att transfekteras. 'Groom' kolonier genom att ta bort differentierade kolonier eller kolonikärnor.
OBS: Eftersom vi tror högre transfektion och inriktnings effektivitet uppstår när cellerna är i logfastillväxt, föreslås att elektroporering genomföras före hESCs når ≥ 70% konfluens. - Tvätta hESC kolonier med HBSS och lägga Accutase.
Obs: Det är inte nödvändigt att förbehandla hESCs med ROCK-hämmare Y-27632 som tillräcklig hämning inträffar vid inkubation med Y-27632 under steg 2.7 - Inkubera under 10-20 min vid 37 ° C / 5% CO2 tills kolonier renderas enstaka celler som betraktas under ett mikroskop. Mal sönder celler med en 1 ml pipett.
- Lägg hESC media och filter till ett 15 ml koniskt rör med hjälp av en 40 pm cell strainer att ta bort cellklumpar.
- Centrifugera vid 160 xg under 5 min. Resuspendera cellpelleten i färskt hESC media och upprepa för att avlägsna eventuell kvarvarande Accutase lösning.
- Återsuspendera cellerna i hESC media innehållande 10 pM Y-27632 och överför det totala cellsuspension till en 100 mm skål förbelagts med gelatin.
- Inkubera vid 37 ° C / 5% CO2 i minst 30 minuter.
- Under denna tid MEF kommer att följa gelatinet belagda skålen. Samla icke-vidhäftande hESCs med en 1 ml pipett i en ny 15 ml centrifugrör och bestämma celldensitet med hjälp av en hemocytometer.
3. Elektroporation av hESCs
- Filtrera CM-MEF-media med en 0,22 pm filter och tillsätt 10 ng / ml rekombinant human fibroblasttillväxtfaktor 2 (rhFGF2).
- Överför 7.5 x 106 hESCs från avsnitt 2.9 till en ny 15 ml koniska rör och centrifugera vid 160 xg under 5 minuter.
- Under denna tid ställa in elektroporator: Välj program för exponentiell electroporation och ställ in följande parametrar, Spänning: 250 V, Kapacitans: 500 mF och Resistance: ∞-.
- Aspirera supernatanten och slamma cellpelleten i 0,8 ml iskall 0,22 pm filtrerad HBSS. Överför lösningen till en steril 0,4 cm elektroporationskyvett.
- Lägg till TV-hPITX3 framåt målkonstruktion (30 mikrogram DNA) och blanda försiktigt med en 200 l pipett. Inkubera på is under 5 min. Under denna tid avlägsna en alikvot av PITX3 ZFN mRNA och tina på is. När tinas överföringen 7,5 pl av ZFN-mRNA till DNA / cellblandningen i elektroporeringskyvett. Blanda försiktigt med en 200 l pipett.
Obs! Locus blir måltavla är den viktigaste faktorn som bidrar till att rikta effektivitet. Loci kodar tysta gener, gener som inte uttrycks i ekonomiska och sociala råd, som PITX3 är svåra att rikta med konventionell homolog rekombination 6. Därmed utnyttjar detta protokoll skräddarsytt ZFNs för den mänskliga PITX3 locus att framkalla en DNA dubbelsträng bryt. - Electroporate genom att följa instruktionerna på skärmen på elektroporator.
- Med hjälp av en 200 l pipett överföra innehållet från elektroporeringskyvett till ett 15 ml rör som innehåller 10 ml hESC media. Tvätta kyvetten två gånger med 200 ni hESC media varje gång och överföra till en 15 ml tub. Det kommer att finnas "slem-liknande" skräp som består av DNA och protein från de lyserade cellerna som negativt kommer att påverka cellöverlevnad. Centrifugera vid 160 xg under 5 minuter för att avlägsna detta skräp.
- Aspirera supernatanten och försiktigt knacka cellpelletten att lossa. Åter suspendera i 30 ml kompletterat MEF-CM innehållande 10 ^ M Y-27632 och förnyad utbredning på 3 x 100 mm skålar pläterad med MEF.
- Ändra media dagligen. På dag 2, kan Y-27.632 dras tillbaka och celler odlas i enbart hESC medier.
- Efter 2-3 dagar hESCs bör vara 50-70% sammanflytande. Vid denna punkt börjar antibiotikaselektion (t.ex. 0,5 ng / ml puromycin).
- Bibehåll selektion genom att lägga färska hESC / puromycin media dagligen. Efter ~ 7 dagar små kolonier ska vara synliga. Om antibiotikaresistenta MEF inte används, kan MEF kompletteras genom att lägga till ytterligare 1,0 x 10 4 celler per cm2.
4. Picking Transgenic hESC Kloner
- Cirka 14 - 21 dagar efter valet (då kolonier har nått ~ 1 mm diameter) förbereda plattor för expansion och screening. Börja med avfrostning en alikvot av Matrigel eller Geltrex vid 4 ° C under minst 5 tim. Späd enligt tillverkarens instruktioner och tillsätt 75 l till varje brunn i 3 x 96-hålsplattor. Förbered 3 x 48-hålsplattor med plätering MEF på 2,0 x 10 4 celler per cm2. Inkubera båda plattorna O / N vid 37 ° C / 5% CO2.
- Följande dag dissekera kolonier i 16-25 bitar med hjälp av en 21 G nål på slutet av en 2 ml pipett genom att skära ett rutnät.
- Aspirera Matrigel från 96-brunnsplattor och ersätta med supplemterade CM-MEF media. Tvätta MEF i 48-hålsplattor 1 x med HBSS och add hESC medier.
- Med användning av en 200 | j, l pipett försiktigt överföra 1/3 av den dissekerade kolonin in i en 48-brunnars platta för expansion. Överför den andra 2/3 av den dissekerade koloni till en motsvarande 96-brunnars platta innehållande kompletterat CM-MEF medier.
- Behåll båda plattorna genom att ändra media dagligen (kompletterat CM-MEF media för 96 brunnar Matrigel belagda plattor och hESC media för 48-brunnsplattor innehållande MEF, båda kompletterade med 0,5 mikrogram / ml puromycin).
- Expand tills 96-brunnars plattor är 100% konfluenta och sedan initialt screena via PCR.
5. Screening och Expansion av positiva kloner
- För att förbereda iskt DNA (metod baserad på 11) ta bort alla media från plåtar genom att vända, sedan blot på hushållspapper.
- Skölj varje brunn två gånger med RT PBS (100 l / brunn varje tvätt), vänd och blot som för steg 5.1. Placera plattorna vid -80 ° C feller 1 - 2 tim för att hjälpa till cellysis (plattor kan lagras på obestämd tid så här).
- Medan cellerna är vid -80 ° C gör Sarcosyl Lysis Buffer (se tabell 4) (50 pl / brunn). För att lysera cellerna, varma plattorna under 5 min vid RT då pipetten lysbuffert till varje brunn. Täta kanterna på varje plåt med tejp, i en förslutbar behållare innehållande fuktiga pappershanddukar för att skapa fukt, och inkubera O / N vid 60 ° C.
- Efter inkubation till 150 l av 5M NaCl till 10 ml -20 ° C absolut etanol, blanda väl och tillsätt 100 l till varje brunn (Obs: etanol går grumlig när NaCl läggs). Knacka plattor försiktigt för att blanda (inte pipett) och låt stå i minst 30 minuter vid RT. Under denna tid lösningen kommer att gå klar och DNA fälls ut.
- Avlägsna lösningen som i steg 5,1 tillsätt sedan 150 | il 70% etanol till varje brunn. Vänd försiktigt plattan och blot som tidigare. Upprepa detta steg ytterligare 2x.
Notera: Eftersom det utfällda DNA naturligt adhEres till vävnadsodlingsplast den inte lossna under dessa tvättsteg.) - Efter den sista tvätten centrifugera kort plattorna vid toppfart att koncentrera DNA till botten av varje brunn sedan lufttorka vid rumstemperatur (eller 37 ° C) i minst 30 minuter.
- Lägg 40-50 pl T0.1E (pH 8,0) (se tabell 5) eller TE (pH 8,0) till varje brunn och placera plattorna vid 65 ° C i 1 timme eller vid 4 ° CO / N innan du använder för PCR. Resuspendera DNA genom att försiktigt knacka på sidorna av plattan. Använd 1-2 pl åter suspenderade DNA / 10 ul PCR-reaktionen.
- Använda Expandera Long Template PCR System med hPITX3 L arm allm. F och hPITX3 L arm GFP R primers utför initial screening av kloner vid 58 ° C glödgning, 45 sek förlängning, 35 cykler.
- Elektrofores prover med Hyperladder 1 kb i en 1% agarosgel innehållande GelRed vid 100 V under 45 min och detektera positiva kloner via UV-belysning.
- Validera PCR-positiva kloner genom att digerera genomiskt DNA från Expanded kloner (se nedan) med Hindlll- och hybridiserande sonder 5 'och 3' av vektorn homologiarmar till en Southern blöt (som tidigare beskrivits i 1). Prober genereras genom PCR med användning av primerpar hPITX3 5 'prob F och R-, och hPITX3 3' prob F och R, digererades med EcoRI och ligerades in i en allmän kloningsvektor.
- Beroende på antalet positiva kloner, förbereda två brunnar i en 6-brunnar genom för-plätering med MEF (2,0 x 10 4 celler per cm2).
- Nästa dag förbehandla positiva kloner i 48-brunnsplatta med 10 pM Y-27632 under minst 1 tim.
- Tvätta positiva kloner med HBSS och tillsätt 300 pl Accutase.
- När kolonier återges enskilda celler, tillsätt 1 ml hESC media och samla upp i 15 ml tub.
- Ändra media dagligen. På dag 2, kan Y-27.632 dras tillbaka och celler odlas i hESC medier.
- När kolonier är 70-80% konfluenta, subkultur och frysa resten av coloNY fragment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter samtidig elektroporering av specialdesignade PITX3 zinkfingerparet tillsammans med PITX3 - EGFP specifik DNA donatorvektor, och efterföljande puromycinselektion, var positiva hESC kloner ursprungligen upptäcktes via genomisk PCR-screening (Figur 1). Southern blot hybridisering av dessa PCR positiva kloner med 5 'och 3' specifika prober bekräftade målinriktad exon 1 i PITX3 locus (figur 2), med en verkningsgrad på 19%. Immunofluorescerande bilder som visas i Figur 3 demonstrerar EGFP expression driven av PITX3 promotorn följande differentiering med användning av en publicerad PA6 stromal celldifferentiering protokoll 12,13. Co-lokalisering av EGFP kunde observeras med markörer av mitthjärnan dopaminerga neuroner såsom FOXA2 (röd) (Figur 3A) och tyrosin hydroxylas (TH, röd) (Figur 3B), medan allt ingen samlokalisering c ould observeras med GABAergic markör, gamma-aminosmörsyra (GABA; röd) (Figur 3C).
Figur 1 Preliminär genomisk PCR-screening. Efter koloniplockning och expansion, preliminär genomisk PCR-screening upptäcks många positiva kloner som visas av PCR-produkten (band vid 984 bp). (Kloner sållades med användning av primers hPITX3 L arm allm. F, som ligger strax utanför den vänstra inriktning arm och hPITX3 L arm GFP R som ligger inom EGFP genen.) Höger och vänster körfält är en 1 kb stege. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 Validering av EGFP inriktning till hPITX3 locus användning av zinkfinger nukleaser i hESCs. (A) Schematisk bild av Southern blot strategi användes för att validera inriktning. Den övre panelen schematiska illustrerar infödda hPITX3 locus innan inriktning. Den nedre panelen schematiska visar hPITX3 locus efter korrekt insättning av EGFP transgenen. De röda linjerna under varje panel visar platserna där 5 'och 3' Southern blot prober binder, och motsvarar banden i figur 2B. (B) representant Southern blot korrekt riktade kolonier valda från PCR pre-screening. Förkortningar: EGFP, förbättrad grönt fluorescerande protein; PGK, mänsklig fosfoglycerolkinas promotor; PURO, puromycinresistensgenen. Andra funktioner: loxP platser, lila; polyadenyleringssekvens, blue, hPITX3 exoner, orange. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 hPITX3-EGFP hESCs differentierade enligt PA6 / LSB / SAG / FGF8 förhållanden. Immunofluorescerande bilder av EGFP märkta med (A) FOXA2 (röd), (B) TH (röd) och (C) GABA (röd). Motfärgades med DAPI (blå). Vågar barer, 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Efter samtidig elektroporering av specialdesignade PITX3 zinkfingerparet tillsammans med PITX3 - EGFP -specifika DNA-donatorvektor och efterföljande puromycinselektion, positiva hESC kloner initialt detekteras via genomisk PCR-screening (Figur 1). Southern blot hybridisering av dessa PCR positiva kloner med 5 'och 3' specifika prober bekräftade målinriktad exon 1 i PITX3 locus (figur 2), med en verkningsgrad på 19%. Immunofluorescerande bilder som visas i Figur 3 demonstrerar EGFP expression driven av PITX3 promotorn följande differentiering med användning av en publicerad PA6 stromal celldifferentiering protokoll 12,13. Co-lokalisering av EGFP kunde observeras med markörer av mitthjärnan dopaminerga neuroner såsom FOXA2 (röd) (Figur 3A) och tyrosin hydroxylas (TH, röd) (Figur 3B), medan allt ingen samlokalisering kunde observeras med GABAergic markör , gamma-aminosmörsyra (GABA; röd) (Figur 3C).
ontent "fo: keep-together.within-page =" always ">Figur 1 Preliminär genomisk PCR-screening. Efter koloniplockning och expansion, preliminär genomisk PCR-screening upptäcks många positiva kloner som visas av PCR-produkten (band vid 984 bp). (Kloner sållades med användning av primers hPITX3 L arm allm. F, som ligger strax utanför den vänstra inriktning arm och hPITX3 L arm GFP R som ligger inom EGFP genen.) Höger och vänster körfält är en 1 kb stege. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 Validering avEGFP inriktning till hPITX3 locus användning av zinkfinger nukleaser i hESCs. (A) Schematisk bild av Southern blot strategi användes för att validera inriktning. Den övre panelen schematiska illustrerar infödda hPITX3 locus innan inriktning. Den nedre panelen schematiska visar hPITX3 locus efter korrekt insättning av EGFP transgenen. De röda linjerna under varje panel visar platserna där 5 'och 3' Southern blot prober binder, och motsvarar banden i figur 2B. (B) representant Southern blot korrekt riktade kolonier valda från PCR pre-screening. Förkortningar: EGFP, förbättrad grönt fluorescerande protein; PGK, mänsklig fosfoglycerolkinas promotor; PURO, puromycinresistensgenen. Andra funktioner: loxP platser, lila; polyadenyleringssekvens, blå, hPITX3 exoner, orange. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3 hPITX3-EGFP hESCs differentierade enligt PA6 / LSB / SAG / FGF8 förhållanden. Immunofluorescerande bilder av EGFP märkta med (A) FOXA2 (röd), (B) TH (röd) och (C) GABA (röd). Motfärgades med DAPI (blå). Vågar barer, 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Substans | ml / 100 ml | Katalog nr (Säljes) |
| DMEM | 89 | 10566-016 (Life Technologies) |
| Fetalt bovint serum | 10 | 16140-071 (Life Technologies) |
| Pen / Strep | 1 | 15070-063 (Life Technologies) |
Tabell 1.
| Komponent | 100 mm skål | 60 mm skål | 6-brunnars | 48-brunnars | 96-brunnars | 75cm 2 kolv |
| HBSS | 5 ml | 2 ml | 1 ml | 0,5 ml | 0,1 ml | 8 ml |
| Accutase | 5 ml | 2 ml | 1 ml | 0,5 ml | 0,1 ml | 8 ml |
| Dispas | 5 ml | 2 ml | 1 ml | - | - | - |
| hESC medier | 10 ml | 6 ml | 3 ml | 0,5 ml | 0,2 ml | 15 ml |
| Matrigel | - | - | - | - | 0,1 ml | - |
Tabell 2.
| Substans | ml / 100 ml | Katalog nr (Säljes) | |
| DMEM / F12 | 80 | 11320-033 (Life Technologies) | |
| KSR | 20 | 10828-028 (Life Technologies) | |
| NEAA | 1 | 11140-050 (Life Technologies) | |
| GlutaMAX | 1 | 35050-061 (Life Technologies) | |
| Pen / Strep | 1 | 15070-063 (Life Technologies) | |
| ß-merkaptoetanol | 0,1 | 21985-023 (Sigma-Aldrich) | |
| rhFGF2 | 7 ng / ml [slutlig] | 233-FB-025 / CF (R & D Systems) |
| Substans | Koncentration | Katalog nr (Säljes) |
| N-lauroylsarkosin natriumsaltlösningen (Sarcosyl) | 0,5% (vikt / volym) | 61.747 (Sigma-Aldrich) |
| EDTA | 10,0 mM | E9884 (Sigma-Aldrich) |
| NaCl | 10,0 mM | S3014 (Sigma-Aldrich) |
| Tris-Cl (pH 7,5) | 10,0 mM | T3253 (Sigma-Aldrich) |
| Proteinas K | 1,0 mg / ml | BIO-37084 (Bioline Australien) |
Tabell 4.
| Substans | Koncentration | Katalog nr (Säljes) |
| Tris-Cl (pH 8,0) | 10,0 mM | T3253 (Sigma-Aldrich) |
| EDTA (pH 8,0) | 0,1 mM | E9884 (Sigma-Aldrich) |
Tabell 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genereringen av reporter cellinjer ger ett kraftfullt medel för att spåra, visualisera och isolera celler av intresse från en heterogen population härstammar från hESCs. Emellertid har genmålinriktning via konventionell homolog rekombination visat sig vara extremt ineffektivt för mänskliga ESCs 3. I detta protokoll beskriver vi en relativt enkel teknik för att införa en RP i exon ett av PITX3 locus, i hESCs med en allmänt tillgänglig målvektor tillsammans med ZFNs. I våra händer det genmålinriktning systemet är effektivt, med 19% av puromycin-resistenta kloner som innehåller en korrekt riktad PITX3 locus (liknande den som tidigare publicerats 6).
En begränsning med att använda ZFNs att underlätta genmålinriktning är svårigheten att utforma ZFNs från grunden på huset. Således, i detta protokoll använde vi specialdesignade kommersiellt tillgängliga ZFNs, vilket kan vara dyrt att skaffa. & #160; Mer nyligen har det TALEN systemet använts till genmålinriktning användning av homolog rekombination 9. Användningen av Talens kraftigt reducerar kostnaden för genen redigering och kan utformas in-house, påskynda processen. Även om det inte uttryckligen visat i denna studie, kan detta protokoll lätt modifieras för att införliva användningen av Talens som metodiken är densamma, förutom Talen plasmider används i steg 3,5 i stället för ZFN mRNA, som visas i 9.
När du använder den här tekniken är det absolut nödvändigt att se till att hPSCs är logfastillväxt, (t.ex. kulturer är inte 70% eller mer sammanflytande). Vi anser att detta är avgörande eftersom plasmiden får tillgång till kärnan efter kärnhöljet uppdelning under celldelningen. Dessutom kommer DNA-donatorvektor endast införliva i DNA efter DNA-syntes, eftersom detta förfarande utnyttjar homologi riktad reparation under division infoga givar-DNA in igenomet.
En annan potentiell begränsning med ZFN tillvägagångssätt är införandet av DNA-brott på andra ställen i genomet. Även Southern hybridisering med extern 5 'och 3' prober detekterar korrekt integration kommer det inte att upptäcka ytterligare händelser integration eller felbenägen reparationer på andra ställen i genomet. Extra integrationshändelser kan granskas av Southern hybridisering med hjälp av vektorspecifika prober (t.ex. EGFP) medan off-target klyvning av ZFN paren kan detekteras med hjälp av SELEX 3,6.
Även om vi inte ser några tydliga effekter i utvecklingen av mitthjärnan dopaminerga nervceller som direkt kunde hänföras till inaktiveringen av en PITX3 gen bör forskare ha i åtanke att varje inriktning händelse där en kopia av en gen störs kan vara skadligt för utveckling av den cellen och bör ta hänsyn till detta när man analyserar resultaten. Huruvida detta är fallet beror till stor delpå den gen som riktade och kan endast fastställas genom att utföra experimentet.
Med hjälp av en PA6 baserad differentiering protokoll 12,13 kunde vi bekräfta trohet reportern systemet genom immunofluorescens (Figur 3) och qPCR analys av EGFP positiva kontra negativa populationer efter fluorescensaktiverad cellsortering (data visas ej). Som PITX3 är en transkriptionsfaktor som är specifik för mitthjärnan dopaminerga neuroner 14, kommer konstruktionen av en human PITX3 reporter cellinjen underlätta användningen av PITX3 + mitthjärnan dopaminerga neuroner härledda från hESCs i studier av antingen in vitro PD modellering eller cellersättningsterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Arbetet beskrivs i detta protokoll har gjorts möjlig genom finansiering från den viktorianska regeringen som en del av ett samarbete allians med den kaliforniska Institutet för regenerativ medicin (CIRM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer - 40 μm | BD Biosciences | 352340 | |
| 33 mm - 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4 cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1 kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
References
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential. Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).
- Collin, J., Lako, M. Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells. Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).
- Carroll, D. Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents. Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).
- Boch, J., Bonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).
- Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).
- Smidt, M. P., et al. A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).
Tags
Molecular Biology Elektroporation mänskliga embryonala stamceller genomet redigering reporter cellinje mitthjärnan dopaminerga neuroner View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
