Summary
Leukocytter krydser endotelmonolaget hjælp den paracellulære eller transcellulær vej. Vi udviklede en simpel analyse at følge fordelingen af endogent forbindelsesepitop VE-cadherin og PECAM-1 under leukocyt transendotel migration under fysiologiske flow til at skelne mellem de to sjælevandring ruter.
Abstract
Under betændelse, leukocytter forlade cirkulation og krydse endotel at bekæmpe invaderende patogener i underliggende væv. Denne proces er kendt som leukocyt transendotel migration. To ruter for leukocytter til at krydse den endotele monolag er blevet beskrevet: den paracellulære rute, dvs gennem celle-celle kryds og transcellulær vej, dvs gennem endotelcelle kroppen. Det har imidlertid været teknisk vanskeligt at skelne mellem stk og transcellulær rute. Vi har udviklet en enkel in vitro-assay til at undersøge fordelingen af endogent VE-cadherin og PECAM-1 i neutrofil transendothel migrering under fysiologiske flow betingelser. Forud for neutrofil perfusion blev endotelceller behandles kortvarigt med fluorescens-mærkede antistoffer mod VE-cadherin og PECAM-1. Disse antistoffer ikke forstyrre funktionen af begge proteiner, som blev bestemt ved elektrisk celle-substraTe impedansfølende FRAP målingerne. Ved hjælp af denne analyse, var vi i stand til at følge fordelingen af endogent VE-cadherin og PECAM-1 under transendothelial migration under strømning og skelne mellem de para- og transcellulær trækruter af leukocytter på tværs af endotel.
Introduction
Effektiv og stramt kontrolleret leukocyt transendotel migration (TEM) er af afgørende betydning i fysiologiske processer, såsom immun overvågning og akut inflammation. Under visse patofysiologiske betingelser, ukontrolleret og overdreven TEM observeres resulterer i kroniske inflammatoriske sygdomme (fx rheumatoid arthritis, atherosklerose, astma). Også under tumorcellemetastase, processen transendothelial migration er afgørende for tumorceller at forlade kredsløbet til at metastasere 1-3. For specifikt at gribe ind med overdreven leukocyt eller tumor celle TEM er en detaljeret forståelse af reguleringen af denne proces kræves.
Det menes, at TEM proces sker gennem forskellige trin. Skelsættende undersøgelser, revideret to årtier siden af Butcher og Springer, førte til flertrins model, der beskriver processen med TEM 4,5. Denne model gælder stadig, selv om nogle annonceBetingede trin er medtaget 6. Alon et al. Beskrevet behovet for tilstedeværelsen af immobiliserede chemokiner på overfladen af endothelet 7. For nylig, viste de, at endotel selv genererer kemokiner, som præsenteres på endotel apikale overflade 8. Desuden den samme gruppe fremsat betydningen af strømningsforhold under TEM 7. For nylig, kan flere publikationer, der fokuserer på de to forskellige ruter leukocytter tage på det endelige diapedesis etape af TEM. De kan enten gå via celle-celle vejkryds, dvs ruten paracellulære migration, eller krydse gennem endothelcelle kroppen, kendt som transcellulær trækrute 9. Carman og kolleger studerede disse veje i detaljer og konkluderede, at leukocytter fortrinsvis vælger paracellulære trækrute (90%) over transcellulær rute (10%), når de passerer en navlestrengsvenen endotelmonolaget 10.Men når endotelceller fra andre kilder blev anvendt, fx hjernen eller mikrovaskulaturen flere leukocytter anvendes transcellulær vej (30%) 11. Den Vestweber gruppe viste for nylig, at når celle-celle kryds var i stand til at adskille fra hinanden ved hjælp af en knock-in-dyremodel, der erstatter endogene VE-cadherin for VE-cadherin-alpha-catenin kimæren blev leukocyt TEM fuldt blokeret 12 . Overraskende forfatterne bemærkede, at TEM blev blokeret i flere, men ikke alle, væv. Samlet set har disse elegante eksperimenter indikerede, at leukocytter foretrak paracellulære rute over transcellulær rute, selv om de regulatoriske signaler, der udløser denne beslutning, er stadig ukendt.
Selv om de fleste af leukocytterne foretrækker ruten paracellulære migration, er det stadig svært at skelne mellem de to veje. Hertil kommer, at, på trods af flere undersøgelser, der fokuserer på den rolle, endotelcelle-celle-junctioner, dynamikken i disse vejkryds, især forbindelsemotiver proteiner VE-cadherin og PECAM-1, i løbet af leukocyt overfarten er stadig under debat. Vi har udviklet en forholdsvis enkel assay, hvor disse junction molekyler kan monitoreres i realtid under leukocyt diapedese under fysiologiske flow betingelser under anvendelse af fluorescens-mærkede antistoffer. Disse antistoffer ikke forstyrre eller blokere forbindelsesepitop integritet eller mobiliteten af de målrettede proteiner. Dette assay giver os mulighed for at følge dynamikken af forbindelsesepitoper proteiner under processen af paracellulær TEM. Derudover denne analyse giver også skelne mellem para- og transcellulær trækruter.
Protocol
Neutrofiler blev isoleret fra raske frivillige, som har underskrevet et informeret samtykke. Forskningen er blevet udført i overensstemmelse med de institutionelle og nationale retningslinier for menneskelig velfærd.
1. Belægning og vedligeholdelse for Human navleveneendotelceller
- Kultur Humant navleveneendotelceller (HUVEC'er) ifølge producentens anvisninger. Grow HUVEC'er på fibronektin (FN) -behandlet retter (10 ug / ml, opløst i demineraliseret vand) ved hjælp af medier (Endotel Basal Medium (EBM-2) medium suppleret med Endotel vækstmedium (EGM-2) singlequots). Brug cellekultur mellem 4-8 passager til eksperimenter.
- Dag 1: Frakke flow-kamre med 100 pi fibronectin (10 ug / ml i PBS) i mindst 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Dag 2: Når celler nå 80-90% konfluens Trypsinisér cellerne efter omhyggelig vask med RT phosphatbufret saltvand (PBS) pH 7,4, centrifugeres ved 800 xg og resuspender på 800.000 celler / ml ved hjælp af medier. Plade 80.000 celler i hver enkelt kanal af fn-belagte flow-kamre og pipettér forsigtigt cellesuspensionen op og ned. Kultur O / N i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Dag 3: Opdater medierne i flowet-kammer dias ved langsomt at vippe slæden i en 45 ° vinkel. (Se figur 1A).
BEMÆRK: Det anbefales at kun fjerne mediet i reservoirerne og ikke i selve kanalen. Fjernelse af medierne i kanalerne kan resultere i endothel celletab og død på grund af den trække kraft media forårsaget af pipettering. - Kontroller ved fasekontrastmikroskopi hvis endotelceller har dannet et monolag (dvs. 100% konfluente). Hvis cellerne ikke er 100% sammenflydende, ændre medierne to gange om dagen, indtil de når 100% konfluens.
- Når cellerne har nået konfluens, stimulere cellerne med medier (se trin1.1) indeholdende inflammatorisk mediator (TNF-α (10 ng / ml)). Stimulering HUVEC'er O / N-(dvs. 12 timer) med TNF-α resulterer i en inflammatorisk fænotype endotel, dvs., Opregulering af celleadhæsionsmolekyler såsom ICAM-1 og VCAM-1-13.
2. polymorfonukleare Leukocyte Isolering Brug Percoll Gradients
- Forbered N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsyre (HEPES) -buffer (herefter benævnt: flow-puffer) før isolering af polymorfkernede leukocytter (PMN). Flow-buffer benyttes til at vaske isolerede PMN'er og som buffer i strømmen analysen. Til fremstilling flow-buffer: fortynd 7,72 g NaCl (132 mM), 4,76 g HEPES (20 mm), 0,45 g KCl (6 mM), 0,25 g MgSO4 • 7H 2 O (1 mM), K 2 HPO 4 • 3H 2 O (1,2 mM) i 1 liter demineraliseret vand og justeres til pH 7,4 (denne bestand kan opbevares ved 4 ° C i flere uger).
- Tilføj friske 100 ul 1 M CaCl2 & #160, (1 mM), 2,5 ml humant albumin fra en 200 g / l stamkoncentration (0,5% v / v) og 0,1 g glucose til 100 ml (0,1% w / v) flow-puffer. Dernæst filtreres flow-buffer ved hjælp af et 0,45 um filter. BEMÆRK: Denne strøm-buffer skal forberedes frisk i hvert forsøg.
- Før isolering af PMN, fremstilling af 10% trinatriumcitrat (TNC) opløsning i PBS, pH 7,4.
- Saml 20 ml fuldblod i natrium heparin vacuettes fra en rask frivillig. Fortynd fuldblod 1: 1 med 10% PBS / TNC i 50 ml rør og pipette 20 ml fortyndet blod forsigtigt på 12,5 ml Percoll (en 23% (w / w), kolloid opløsning i vand med en massefylde på 1.130 g / ml) i en ny 50 ml rør. Placer forsigtigt rørene i centrifugen og spin i 20 minutter ved 800 xg med lav acceleration og ingen pause indstillet på RT.
BEMÆRK: Når du tilføjer den fortyndede blod til Percoll, vippe Percoll-holdige rør i en vinkel på 45 ° og pipettér forsigtigt den fortyndede blod i røret Vidh langsomste pipetten dreng indstilling. - Fjern al væske og efterfølgende fylde røret med iskold erythrocyt-lysis-puffer (4,15 g NH4Cl [0,155 M], 0,5 g KHCO3 [0,01 M] og 18,5 mg EDTA (triplex III) [0,1 mM] til 500 ml iskold H2O) for at lysere erythrocytter. Efterlad rør på is, lejlighedsvis vende røret, indtil suspensionen bliver mørk rød, efterfulgt af centrifugering 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C med pauser aktivt.
BEMÆRK: fraktionen Pillen indeholder PMN'er (neutrofiler, eosinofiler, basofiler) Sammen med erytrocytter. - Fjern supernatanten og vask pellet to gange i iskold lysis-buffer ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Pellet resuspenderes med flow-buffer ved stuetemperatur og bestemme PMNs koncentration ved hjælp af enten et hæmocytometer eller automatiseret celle tæller. Hæng PMN'er i flow-buffer ved 1 x 10 6 celler / ml og holde ved stuetemperatur.
3. Mærkning af Endotel Junctional VE-cadherin og PECAM-1
- Tilsæt PECAM Alexa Fluor 647-antistof (klon WM59) ved en 1: 100 fortynding, og calcium-uafhængig VE-cadherin-FITC-antistof (klon 55-7H1) ved en fortynding på 1:50 til HUVEC dyrkningsmedium (se trin 1.1), og inkuberes i 30 minutter før start strømmen eksperiment for at visualisere forbindelsesepitoper dynamik endotelceller under neutrofil transmigration under fysiologiske flow betingelser.
BEMÆRK: Før du tilføjer det direkte mærkede antistoffer til strømmen-kamre, sørge for, at mængden i hver kanal ikke overstiger 100 ul. Dette hjælper med at holde antistof udgifter så lave som muligt.
4. PMN TEM Assay Under Flow
- Placer PMN'er i et vandbad i 15 minutter ved 37 ° C før injektion af dem i flow-system.
- Tilslut slangen til en tom flow-kammer og fyldes med varm (f.eks 37 ° C) strømning-buffer (se trin 4.3) for at forhindre dannelse af luft-bobler ved opsætning the flow-system.
- Slut den ene side af en tom flow-kammer til sprøjtepumpen flow-system ved hjælp af silikone slange, der indeholder en 20 ml sprøjte, og sætte flow-kammer i mikroskopbordet.
- Tilslut den anden side af et tomt flow-kammer til reservoiret kolben fyldt med 37 ° C flow-buffer (figur 1B), og starte sprøjten pumpe for at fylde alle de slanger med flow-buffer. Pumpen vil trække strøm-puffer fra reservoiret gennem flow-kammer i sprøjten. BEMÆRK: Denne slange indeholder også en in-line Luer injektionsport, som giver PMN'er skal injiceres med en nål ind i en kørende eksperiment uden at standse strømmen og skabe luftbobler.
- Udskift den tomme flow-kammer med strømmen-kammer indeholdende TNF-α-behandlede HUVEC'er tilslutte strøm-buffer-holdige slanger og læg det i mikroskopbordet (figur 1C). Knib off rørene før afbryde og tilslutte denm til kamrene, der indeholder HUVEC'er, som ikke klemme start, kan resultere i dannelsen af luftbobler inde i slangen og / eller flow-kamre.
- Justér flowet hastigheden til 1 dyn / cm 2, i overensstemmelse med fysiologisk flow hastighed i post kapillære venuler (1-5 dyn / cm 2).
- Optag Differential interferens kontrast (DIC), FITC (488 nm), og Alexa Fluor 647 (647 nm) samtidigt ved hjælp af et konfokalt laserscanningmikroskop.
- Injicer PMN'er (trin 4.1) langsomt i strømmen-systemet via in-line Luer indsprøjtningsåbning (figur 1D) under anvendelse af 1 ml sprøjter.
- Efter et par minutter, vises leukocytter, overholde, og der vandrer. Stop eksperimentet på ethvert ønsket tidspunkt af slangen fra strømmen-kammer og pipettering fiksativ (3,7% formaldehyd i PBS) frakobling i flow-kammer. Tillad fiksering i 10 minutter, efterfulgt af vask med PBS. Data analyseres ved hjælp af imaging-software (se materialer og udstyr tabel).
BEMÆRK: Udfør han eksperiment ved hjælp af et konfokalt laserscanningmikroskop udstyret med et klimakammer med en konstant temperatur ved 37 ° C, 5% CO2, og en 63X olie-mål.
Representative Results
Vi først afprøvet hvis antistofferne ikke interferere med barrierefunktion endotel. Vi målte modstand endotheliale enkeltlag ved anvendelse af elektrisk celle-substrat impedansfølende (ECIS). For detaljer, se Van Buul et al. 13 Ingen ændring i modstanden blev observeret, når anti-VE-cadherin fluorescens-mærket antistof blev sat til cellerne (figur 2A). Et anti-VE-cadherin antistof, der er velkendt for at blokere VE-cadherin funktion reduceret modstand dramatisk (Figur 2A). Også de anvendte antistoffer til billeddannelse ikke ændrer dynamikken i VE-cadherin, som blev vurderet ved at måle fluorescerende bedring efter fotoblegning (FRAP) af VE-cadherin-GFP (figur 2B).
Efter 1-2 minutter, neutrofiler klæbet til den aktiverede endotelmonolaget som kunne visualiseres i DIC kanal (figur 3A). Efter at gennemgå, for 5-30 SEc størstedelen af neutrofiler transmigrated gennem endotelmonolaget gennem celle-celle vejkryds, der var mærket med antistoffer rettet mod PECAM-1 og VE-cadherin. Under processen med diapedese, fordelingen af VE-cadherin og PECAM-1 blev fulgt i realtid (figur 3B). På steder med neutrofil diapedese, VE-cadherin var lokalt afbrudt og PECAM-1 viste en mere ringlignende struktur. Efter afslutning af diapedese, knudepunkter tætte og VE-cadherin og PECAM-1 tydeligt flyttet på stederne for diapedese (figur 3C). Bemærk, at dele af anti-PECAM-1-antistof blev detekteret på overfladen af neutrofil når neutrofil nåede baso-laterale side af endotel. Men dette ikke forhindre neutrofiler at krydse endotel. De observerede dynamik VE-cadherin i real-tid under neutrofil transendotel migration var i overensstemmelse med det arbejde, som Shaw og kolleger, derviste, ved hjælp af konfokal mikroskopi og VE-cadherin-GFP-transficerede endothelceller, som VE-cadherin-GFP diffust sideværts når leukocytter krydsede endotheliale celle-celle kryds 14. Arbejder også af Su og kolleger understreget vore observationer af PECAM-1. De viste, at ved siden af lateral VE-cadherin diffusion ved leukocyt passage blev PECAM-1 lokalt omfordeles til en ring omkring transmigrating neutrofile 15.
Figur 1. In vitro-strømningskammeret. (A) Pilen viser reservoiret, hvorfra mediet skal opdateres. (B) Silikone slange, der forbinder strømningskammeret med in-line Luer indsprøjtningsåbning anvendes til injektion af PMN'er uden slangen (pilespids) frakobling. (C) Connfdeling af en tom flow-kammeret til reservoiret kolbe fyldt med 37 ° C strøm-puffer (pilespids). (D) Tilslutning af strøm-kammer med TNF-α-behandlede HUVEC'er til flow-puffer indeholdende rør og anbringes i mikroskopbordet (pilespids).
Figur 2. VE-cadherin antistoffer ikke interfererer med forbindelsesepitoper dynamik eller funktion. (A) Endotel cellemonolag impedans måles under anvendelse af ECIS. Y-aksen udtrykker impedans i ohm og x-aksen repræsenterer tiden i timer. VE-cadherin antistof klon 55-7H1, mærket med ALEXA647 (blå linje) eller isotype IgG-ALEXA647 kontrol (rød linje) ikke ændrer endothelcelle monolag impedans, mens VE-cadherin blokerende antistof CL75 (sort linje) ikke reducere impedans . (B
Figur 3. VE-cadherin og PECAM-1 fordeling under neutrofil TEM i realtid. (A) neutrofile (markeret med hvid linje) vedhængende på endotelet og passerer celle-celle krydset uden at påvirke fordelingen af VE-cadherin og PECAM -1. (B) neutrofile krydser endotelmonolaget gennem celle-celle-knudepunkter. En lokal spredning af VE-cadherin kan observeres og PECAM-1, når en neutrofil rager gennem celle-celle kryds. Hvid linie illustrerer neutrofil tilstedeværelse stadig oven på endotel. Gul linje viser neutrofil membran THAt er allerede under endotel. (C) Neutrophil har fuldt krydset endotelmonolaget. VE-cadherin og PECAM-1 er flyttet på steder med diapedese. Gule linje illustrerer grænser transmigrated neutrofil. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Til denne protokol, er det afgørende at forhindre dannelsen af luftbobler i strømmen-kamre, da dette vil resultere i celle apoptose og en forstyrret monolag. For at undgå dette, vil vi gerne understrege at betale særlig interesse for trin 4.2 og 4.5, hvor rørene er forbundet til strøm-kammer. Et andet kritisk trin i protokollen er den priming af PMN'er, der holdes ved RT ved at inkubere dem i 15-30 min ved 37 ° C, inden injektion dem til strømmen-kammer (trin 4.1). Dette resulterer i priming af leukocyt integriner, tillader dem at holde sig til adhæsionsmolekyler, såsom ICAM-1 eller VCAM-1 på endotel.
Denne protokol er ikke begrænset til at undersøge transmigration neutrofiler. Også andre leukocyt typer såsom monocytter eller lymfocytter kan anvendes. Bemærk, at trin 4.1, dvs priming leukocytterne kan variere mellem leukocyt-typer. Der kan også anvendes andre typer af endotelceller. Til dette er det fortsat kritiskat stimulere endotelceller med passende inflammatoriske stimuli, såsom TNF-α eller IL-1β. Hvis neutrofiler ikke reagerer i transmigrating, kan man overveje behandling af neutrofiler kortvarigt (5 min) med N-formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanin (fMLP) peptid 16. Det vil stimulere neutrofiler, navnlig deres integriner, endnu mere, hvilket gør dem mere tilbøjelige til at holde sig til endotel.
Typisk 1 dyn / cm 2 flow-hastighed bruges. Dette flow hastighed er målt i post-kapillære venuler, steder hvor de fleste leukocyt transendotel migration opstår 17. Ved hjælp af de beskrevne flow-kamrene, er det muligt at øge strømningshastigheden op til 10 dyn / cm 2. Imidlertid er det ikke anbefales at forøge forskydning yderligere. Det kan resultere i uønsket lækage af slangen og frigørelse af cellerne fra flowet-kammer.
De i figur 3 resultater viser, at disseantistoffer kan anvendes til at visualisere og studere dynamikken i endotel celle-celle kryds under leukocyt diapedesis. Især i tillæg til de eksisterende transmigration assays denne protokol gør det muligt at skelne paracellulær fra transcellulær migrering under fysiologiske flow betingelser i realtid. Da antistofferne plette celle-celle kryds, kan man score det antal leukocytter, der krydser ve-cadherin / PECAM-1-positive kryds versus nonpositive VE-cadherin / PECAM-1 steder. Denne måde, transcellulær migration kan skelnes fra paracellulær indvandring.
Det er vigtigt at understrege, at disse antistoffer ikke forstyrrer funktionen af de proteiner, de binder til: den PECAM-1 antistof, der anvendes i denne undersøgelse er rettet mod det andet ekstracellulære domæne. Endotelceller, der var udpladet i nærvær af antistoffet ikke viser nogen fejl i at sprede eller dannelse af et monolag, hvilket tyder på, at antistoffet mindst ikkeforstyrre homotypiske interaktioner mellem endotelceller. i tillæg til det, gør begge antistoffer ikke påvirke evnen af neutrofiler til at migrere gennem endotelmonolaget. Derudover er antallet af neutrofiler, der der vandrer på tværs af endotelmonolaget i fravær eller nærvær af antistofferne ikke ændret (data ikke vist). Vigtigere, konfokal laserscanning mikroskopi giver os mulighed for at registrere forskellige fluorescerende kanaler og DIC samtidigt.
Således dette assay tillader at studere dynamikken i VE-cadherin og PECAM-1 på samme tid, når en neutrofil krydser endotelcelle-celle krydset og vil hjælpe til at forstå, hvorfor leukocytter vælge en rute over den anden, dvs paracellulær versus transcellulær.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| μ-Slide VI | IBIDI | 80606 | Flow-chamber |
| 0.45 μm filter | Whatman/GE Lifesciences | 10462100 | |
| 1 ml Syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| 20 ml Syringe | BD Discardit II | 366296 | |
| 21 G Needle | BD Microlance | 301155 | |
| Albumin | Sanquin | 15522644 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Merck | 1009245000 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 + CC-4176 | media |
| EDTA (Titriplex III) | Merck | 1370041000 | |
| Falcon tubes | Corning Life Sciences | 352096 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-2MG | FN |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| In-line Luer injection port | IBIDI | 10820 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4•7H2O) | Merck | 105886 | |
| PECAM-1-ALEXA-647 | BD Pharmingen | 561654 | clone WM59 |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-09 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fresenius Kabi Nederland | M090001/01NL | PBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium hydrogen carbonate (KHCO3) | Merck | 1048540500 | |
| Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Silicone Tygon 3350 tubing | VWR | 228-4331 | tubing |
| Sodium chloride (NaCl) | Calbiochem (Millipore) | 567441 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | model number 55-5920 | |
| TNF-α | Peprotech | 300-01A | tumor necrosis factor |
| Trisodium citrate | Merck | 1.06447.5000 | TNC |
| Vacuettes | Greiner, Germany | 980044 | |
| VE-Cadherin-FITC | BD Pharmingen | 560411 | clone 55-7H1 |
| Zeiss LSM510 META | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany | ||
| Zen Software 2008 | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany |
References
- Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
- Szekanecz, Z., Koch, A. E. Vascular involvement in rheumatic diseases: ' vascular rheumatology. Arthritis Res. Ther. 10, 224 (2008).
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67, 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76, 301-314 (1994).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Cinamon, G., Shinder, V., Shamri, R., Alon, R. Chemoattractant signals and beta 2 integrin occupancy at apical endothelial contacts combine with shear stress signals to promote transendothelial neutrophil migration. J. Immunol. 173, 7282-7291 (2004).
- Shulman, Z., Cohen, S. J., Roediger, B., et al. Transendothelial migration of lymphocytes mediated by intraendothelial vesicle stores rather than by extracellular chemokine depots. Nat. Immunol. 13, 67-76 (2012).
- Carman, C. V., Springer, T. A. Trans-cellular migration: cell-cell contacts get intimate. Curr. Opin. Cell Biol. 20, 533-540 (2008).
- Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J. Cell Biol. 167, 377-388 (2004).
- Millan, J., Hewlett, L., Glyn, M., et al. Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains. Nat. Cell Biol. 8, 113-123 (2006).
- Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).
- Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells. J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).
- Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium. J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).
- Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium. Blood. 100, 3597-3603 (2002).
- Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model. J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).
- Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium. Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).
