Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

هيدروجيل الجسيمات النانوية حصاد البلازما أو البول للكشف عن وفرة البروتينات منخفضة

Published: August 7, 2014 doi: 10.3791/51789
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1
1Center for Applied Proteomics and Molecular Medicine, George Mason University, 2Ceres Nanosciences
* These authors contributed equally

Abstract

اكتشاف العلامات البيولوجية رواية يلعب دورا حاسما في توفير أكثر حساسية ومحددة كشف المرض. للأسف كثير من المؤشرات الحيوية منخفضة الوفرة التي توجد في السوائل البيولوجية لا يمكن الكشف عنها بسهولة مع مطياف الكتلة أو المناعية لأنها موجودة في تركيز منخفض جدا، هي عطوب، وغالبا ما يخفيها وفرة البروتينات عالية مثل الألبومين أو المناعي. الطعم تحتوي على بولي (N-isopropylacrylamide) (NIPAm) النانوية استنادا قادرة على التغلب على هذه الحواجز الفسيولوجية. في خطوة واحدة أنها قادرة على التقاط، والتركيز والحفاظ على المؤشرات الحيوية من سوائل الجسم. منخفضة الوزن الجزيئي التحاليل تدخل جوهر جسيمات متناهية الصغر وأسرت من قبل مختلف الأصباغ الكيميائية العضوية، والتي تكون بمثابة الطعم تقارب عالية البروتين. النانوية قادرة على تركيز البروتينات من الاهتمام من قبل عدة أوامر من حجمها. هذا العامل هو تركيز كاف لزيادة مستوى البروتين مثل أن البروتينات هي ضمنحد الكشف من الطيف الحالية الكتلة، النشاف الغربي، والمناعية. يمكن تحضين النانوية مع مجموعة كبيرة من السوائل البيولوجية وأنها قادرة على تخصيب كثيرا من تركيز البروتينات منخفضة الوزن الجزيئي والببتيدات مع استبعاد الزلال وغيرها من البروتينات عالية الوزن الجزيئي. تظهر بياناتنا أن 10،000 التضخيم أضعاف في تركيز الحليلة معين لا يمكن أن يتحقق، مما الطيفي والمناعية للكشف عن المؤشرات الحيوية لا يمكن الكشف عنها سابقا.

Introduction

على الرغم من الانتهاء من تسلسل الجينوم البشري، لم يتم إحراز تقدم كبير في تحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية المرض مرحلة مبكرة، أو التي ترتبط مع نتائج علاجية، أو التكهن 1. وأحد أسباب ذلك عدم إحراز تقدم هو أن العديد من المؤشرات الحيوية الهامة المحتملة توجد بتركيز أقل من حد الكشف عن مطياف الكتلة التقليدية وغيرها من منصات اكتشاف العلامات البيولوجية. مطياف الكتلة (MS) ومتعددة رصد رد الفعل (MRM) لديهم حساسية الكشف عادة أكبر من 50 نانوغرام / مل في حين أن الغالبية العظمى من التحاليل المناعية تقاس في سقوط المختبر السريري في نطاق بين 50 جزء من الغرام / مل و 10 نانوغرام / مل . وهذا يعني أن العديد من المؤشرات الحيوية، وخاصة في المرحلة المبكرة من المرض لا يمكن الكشف عنها بواسطة MS التقليدية وMRM 2. وبالإضافة إلى ذلك وجود وفرة عالية من البروتينات مثل الألبومين والغلوبولين المناعي في السوائل البيولوجية المعقدة غالبا ما تخفي من مليار أضعاف مريض بالحبوفاق سطيف منخفضة وفرة، منخفضة الوزن الجزيئي البروتينات والببتيدات 3، 4، ولهذا السبب هناك حاجة العديد من الخطوات التحضيرية عينة قبل التسلسل الطيف الكتلي وتحديد الهوية. إحدى هذه خطوة تمهيدية توظف استنزاف البروتينات عالية فرة مع الأعمدة استنزاف المتاحة تجاريا 5-8. للأسف هذه الخطوة تؤدي إلى تخفيض العائد من المؤشرات الحيوية مرشح لأنها غالبا ما تكون مرتبطة تساهميا مع غير البروتينات الحاملة التي يتم إزالتها. ويمثل تحديا آخر من استقرار المؤشرات الحيوية مرشح فيفو السابقين مرة واحدة يتم جمع العينات. بروتينات قابلة للتحلل بواسطة البروتياز الذاتية أو الخارجية 9. يمكن النانوية هيدروجيل تجاوز هذه التحديات الحرجة عن طريق تضخيم تركيز العلامات البيولوجية المفترضة إلى مستوى ضمن نطاق الفحص، مع حماية البروتين من تدهور 10-13.

من المهم أن نلاحظ عشرفي LMW البروتينات في الدم هي مزيج من البروتينات سليمة الصغيرة وكذلك أجزاء كبيرة من البروتينات. البروتينات المشتقة من الأنسجة أكبر من 60 كيلو دالتون كبيرة جدا للدخول بشكل سلبي مجرى الدم من خلال الغشاء القاعدي الأوعية الدموية، ولكنها يمكن أن تمثل في الدم والببتيدات أو شظايا البروتين 14. هدفنا هو قياس المؤشرات الحيوية تعميم الرواية التي يمكن أن تكون مرشحة للكشف المبكر عن المرض، والطبقية المريض للعلاج، ومراقبة الاستجابة للعلاج. يتم إنشاء النانوية جهدنا لاستبعاد انتقائي المناعية وفرة عالية والزلال، في وقت واحد أثناء التقاط البروتينات والببتيدات الصغيرة والتركيز عليها ما يصل إلى 100 أضعاف اعتمادا على حجم انطلاق.

حددت مجموعتنا مجموعة من الأصباغ العضوية الصغيرة التي يمكن أن تعمل بنجاح تقارب عالية والطعوم الجزيئية للبروتينات والببتيدات. ويعتقد ملزم البروتين صبغ أن يكون نتيجة لمزيج من التفاعل مسعور وكهرباءق. الحلقات العطرية على صبغ تعشيق مع البروتينات عبر جيوب مسعور على سطح البروتين 11.

الطعوم، اعتمادا على الكيمياء، وتظهر تقارب معين لفئات مختارة من التحاليل. الطعوم تتنافس مع البروتينات الحاملة، مثل الزلال، على البروتينات أو الببتيدات. منخفضة الوزن الجزيئي البروتينات / الببتيدات تصبح المحاصرين في الجسيمات. يتم منع البروتينات عالية الوزن الجزيئي مثل الألبومين والغلوبولين المناعي من دخول الجسيمات بسبب القدرة النخل بسبب المسام تقييدا ​​من هيدروجيل 11 (الشكل 1).

وقد تم تجميع الجسيمات النانوية هيدروجيل من قبل هطول البلمرة التي بدأها بيرسلفات الأمونيوم 11. N-isopropylacrylamide (NIPAm)، يسمح شارك أحادية من حمض الاكريليك (AAC) وآليلامين (AA) وعبر رابط N، N'-Methylenebisacrylamide (BIS) للرد على 70 درجة مئوية لمدة 6 ساعة في ظروف المخففة 11، 13، وتقارب نسبة عالية من البروتين ملزمة من بولي (N-isopropylacrylamide-CO-حمض الاكريليك) (بولي (NIPAm-CO-AAC) nanoparticlesis من خلال دمج تساهميا الأصباغ التي تحتوي على الأمينية (أي.، والأصباغ sulfonatedanthraquinonetriazine) في الجسيمات النانوية من خلال تحقيق رد فعل amidation أجريت في المذيبات المائية أو العضوية تبعا ل/ خصائص ماء مسعور من 11 الأصباغ، يستخدم 13. استبدال أليف النواة للمجموعات الأمينات في جسيمات متناهية الصغر مع ذرة كلور لصبغ anthraquinonetriazine لخلق بولي تحتوي على صبغة (NIPAm -co-آليلامين) (AA) النانوية 11، 12. يتم استغلال عملية البلمرة من خطوتين لخلق الجسيمات النانوية هيدروجيل تحتوي على الغلاف الخارجي من حمض vinylsulfonic (VSA) 11، 13.

النانوية هيدروجيل يمكن تطبيقها على السوائل البيولوجية المختلفة، بما في ذلك الدم الكامل، والبلازما، المصل، السائل النخاعي، والعرق، والبول. في خطوة واحدة، في الحل، نanoparticles إجراء سريع (في غضون دقائق) عزل وتركيز منخفض الوزن الجزيئي التحاليل 10، 11، 13، 15-18. ومزال البروتينات في وقت لاحق من الجسيمات النانوية والكشف باستخدام ويسترن النشاف 19-21، مطياف 10، 11، 13، 15، 18، 22 كتلة (23 عاما) المناعية / ELISA 10، 11، 15، 18، أو مرحلة عكس البروتين ميكروأري 16، 24 المقايسات. النانوية بين functionalized مع الطعم الكيميائية، وتقديم الأساسية أو الأساسية قذيفة الهندسة المعمارية، والتقاط وتركز البروتينات على أساس الخصائص الفيزيائية الطعم / شل. لذا سوف الأصباغ المختلفة دمجها في التقاط الجسيمات النانوية مجموعات فرعية مختلفة من البروتينات مع اختلاف الكفاءة على أساس تقارب صبغ، ودرجة الحموضة من الحل، وحضور / غياب المنافسة بروتينات عالية وفيرة 13. وعلاوة على ذلك، فإن كمية الجسيمات النانوية فيما يتعلق حجم الحل يؤثر على العائد البروتين من الجسيمات النانوية. هذه الجوانب منوأظهرت هيدروجيل حصاد جسيمات متناهية الصغر باستخدام ثلاثة جسيمات متناهية الصغر الطعوم المختلفة للبروتينات الحصاد من عينات البلازما التي تحتوي على كميات عالية من البروتين، وعينات من البول والتي عادة لا تحتوي على كميات كبيرة من البروتين. في هذا البروتوكول نظهر الحصاد والتركيز عامل نخر الورم ألفا (TNFα) من عينات البلازما باستخدام بولي (NIPAm-CO-AAC)، بولي (NIPAm / صبغ)، وقذيفة النانوية الحدقة (بولي (NIPAm-CO-VSA)) . وتظهر بولي (NIPAm / صبغ) الجسيمات النانوية للتركيز المستضد الأنواع المتفطرة التي تم إضافتها إلى عينات البول الإنسان، لتقليد السل المتفطرة الأفراد المصابين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تم جمع البلازما البشرية والبول من المانحين المتطوعين صحية، مع الموافقة المسبقة الخطية، بعد الموافقة عليها جامعة جورج ميسون مجلس المراجعة المؤسسية البروتوكولات. تم توزيع المانحين بالتساوي بين الذكور والإناث القوقاز الذين تتراوح أعمارهم بين 25 و 42. عينات تم تحليلها بشكل فردي، ولم تجميع.

1. جسيمات متناهية الصغر تجهيز المصل أو البلازما عينات

يتم التقاط المؤشرات الحيوية المحتملة وفيرة منخفضة في البلازما، في الحل، مع الجسيمات النانوية هيدروجيل. تضاف الجزيئات إلى البلازما، والمحتضنة، مفصولة الطرد المركزي، وغسلها، ومزال البروتينات القبض عليه. يتم تجفيفها البروتينات مزال تحت تدفق النيتروجين لالمصب الشامل تسلسل الطيف وتحديد الهوية.

  1. تمييع 500 ميكرولتر من المصل 1: 2 مع 50 ملي TrisHCl درجة الحموضة 7 (500 ميكرولتر مصل + 500 ميكرولتر TrisHCl) في أنبوب microcentrifuge.
  2. إضافة 500 ميكرولتر من بولي (NIPAm / AAC) nanop الأساسيةالمقالات. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
  3. تدور العينة في 16،100 x ج، 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في جهاز للطرد المركزي مجهزة الدوار زاوية ثابتة. إزالة وتجاهل طاف.
  4. إضافة 500 ميكرولتر ثيوسيانات الصوديوم (25 ملم) لبيليه. Resuspend والجسيمات النانوية من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا عدة مرات.
  5. تدور العينة في 16،100 x ج، 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في جهاز للطرد المركزي مع الدوار زاوية ثابتة. إزالة وتجاهل طاف.
  6. إضافة 500 ميكرولتر من المياه MilliQ إلى بيليه جسيمات متناهية الصغر. Resuspend والجسيمات النانوية من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا عدة مرات.
  7. تدور العينة في 16،100 x ج، 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في جهاز للطرد المركزي مع الدوار زاوية ثابتة. إزالة وتجاهل طاف.
  8. إعداد شطف العازلة الطازجة: إضافة 700 ميكرولتر أسيتونتريل إلى 300 هيدروكسيد الأمونيوم ميكرولتر في أنبوب نظيفة. الحذر: هيدروكسيد الأمونيوم غير قابلة للتآكل. مع استخدام التهوية المناسبة. ملاحظة: يجب أن يكون شطف العازلة الإعداديةعرب كورب فورا قبل الاستخدام. لا تقم بتخزين شطف العازلة.
  9. إضافة 300 ميكرولتر من شطف العازلة لبيليه جسيمات متناهية الصغر. Resuspend والجسيمات النانوية من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا عدة مرات. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
  10. تدور العينة في 16،100 x ج، 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في جهاز للطرد المركزي مع الدوار زاوية ثابتة. إزالة وحفظ شطافة في نظيفة، وصفت أنبوب microcentrifuge.
  11. كرر الخطوات 1،9 حتي 1،10. الجمع بين اثنين الى واحد eluates أنبوب microcentrifuge.
  12. تجفيف eluates تحت تدفق النيتروجين في مشعب المبخر النيتروجين في 42.1 درجة مئوية، مع وضع تدفق الهواء إلى 8 (الشكل 2F).
  13. تخزين شطافة المجففة في RT لO / N التخزين، أو في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل، وذلك قبل مطياف الكتلة، النشاف الغربي، أو فحوصات ELISA (اختياري).

2. تصنيع جسيمات متناهية الصغر من عينات البول

يحتوي البول الطبيعي أقل من 30 ملغ / ديسيلتر البروتين وأقل من 1+ الدم. ومع ذلك، كثير من الأمراض / الأحكام قد يغير مستويات طبيعية من بروتين البول والدم. للمساعدة في تحديد حجم الأمثل للالنانوية إضافة إلى عينة البول، ويتم إجراء تحليل البول قبل الحصاد جسيمات متناهية الصغر. قد توجد البول المؤشرات الحيوية في تركيزات منخفضة للغاية، والتي قد تتطلب تحسين نسبة الجسيمات النانوية إلى حجم البول. يصف هذا الإجراء تجميع جسيمات متناهية الصغر من عينات البول لتحليل لطخة المصب الغربي.

  1. جمع عينات البول في نظيفة، كوب من البلاستيك الجاف. مطلوب 22 مل حجم الحد الأدنى. عينات البول المخزن في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للتحليل.
  2. ذوبان الجليد البول المجمدة في RT أو عند 4 درجة CO / N. مزيج لفترة وجيزة على خلاط دوامة. صب لا يقل عن 22 مل من البول إلى قاع مخروطي 50 مل أنبوب البولي بروبلين.
  3. تدور البول في جهاز للطرد المركزي مع الدوار سوينغ التدريجي في 3،700 x ج لمدة 15 دقيقة. صب البول، من دون إزعاج بيليه، إلى أسفل نظيفة polypr 50 مل المخروطيةأنبوب opylene. تجاهل بيليه.
  4. إجراء تحليل البول باستخدام متعددة الحليلة "البول مقياس" الشريط الكاشف. ملاحظة: تخزين أشرطة الكاشف في حاوية مغلقة بإحكام بعيدا عن أشعة الشمس المباشرة والرطوبة 17 و 18.
    1. وضع الشريط الكاشف، وجها حتى، على نظيفة، منشفة ورقية جافة.
    2. استخدام ماصة المتاح لنضح 1 مل من البول أعدت في الخطوة 2.3.
    3. تحديد توقيت لمدة 2 دقيقة ولكن لا تشغيله. الاستغناء بسرعة 1 - 2 قطرات من البول في كل لوحة اختبار الشريط الكاشف. بدء فورا في الموقت. ملاحظة: لا يغرق قطاع كاشف مباشرة في الحاوية البول. المؤشرات صبغ / الكيميائية في قطاع كاشف يحتمل أن يتسرب من قطاع كاشف في وعاء البول.
    4. في الوقت المشار إليه على الحاوية الشريط الكاشف، تسجيل النتائج النوعية للالتحاليل المختلفة على الشريط الكاشف بمقارنة لون الشرائط كاشف الفردية إلى مرمزة المقابل إنديكاالاختصاصات على الحاوية كاشف. نموذجية نتائج البول طبيعية هي: (عادي أو سلبية) للدماء، والبروتين، الكريات البيض، النتريت، والجلوكوز، كيتون، البيليروبين، ويوروبيلينوجين. درجة الحموضة البول (5،5-7،0). الثقل النوعي (1،001-1،020). ملاحظة: مستويات عالية من البروتين في عينة البول قد يتنافس مع البروتين من الفائدة للمواقع على الجسيمات النانوية ملزمة. لتعظيم حصاد بروتين مع الجسيمات النانوية، وحجم جسيمات متناهية الصغر / نسبة حجم البول يمكن تعديلها إما المنافسة الحد من وفرة البروتينات عالية، أو يمكن أن يكون الأمثل لحصاد البروتينات التي توجد في تركيزات منخفضة للغاية. إذا كانت قيمة بروتين البول هي 1+ أو أكثر، وإضافة وحدات 2X النانوية في الخطوة 2.5 أدناه. إذا الحليلة الاهتمام هو وفرة البروتين المنخفض جدا، قد يكون من الضروري زيادة حجم الجسيمات النانوية لتصل إلى 2 مل (الشكل 3).
  5. نقل 20 مل من البول أوضح من الخطوة 2.3 إلى تنظيف قاع مخروطي 50 مل أنبوب البولي بروبلين. لاتخل أي حطام / بيليه التي قد تكون في الجزء السفلي من أنبوب البول. إضافة 200 ميكرولتر من الجسيمات النانوية لعينة البول 20 مل. مزيج لفترة وجيزة على خلاط دوامة. ملاحظة: إذا كانت قيمة بروتين البول هي 1+ أو أكثر، إضافة 400 ميكرولتر من الجسيمات النانوية إلى 20 مل البول.
  6. احتضان الخليط البول / جسيمات متناهية الصغر لمدة 30 دقيقة في RT، دون هزاز / الاختلاط.
  7. تدور تعليق البول / جسيمات متناهية الصغر في جهاز للطرد المركزي مجهزة الدوار سوينغ التدريجي في 3،700 x ج لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: إذا كان بيليه هو غير مرئي الطرد المركزي يلي، وتدور في عينات لعدد إضافي من 2-7 دقيقة.
  8. إزالة وتجاهل طاف. إضافة الماء 500 ميكرولتر MilliQ إلى بيليه جسيمات متناهية الصغر.
  9. Resuspend والجسيمات النانوية من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا عدة مرات. نقل الحل إلى جسيمات متناهية الصغر نظيفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge.
  10. تدور الجسيمات النانوية في أجهزة الطرد المركزي مجهزة الدوار زاوية ثابتة في 16،100 x ج لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: إذا كان بيليه ليس فل مرئيةخوار الطرد المركزي، وتدور في عينات لعدد إضافي من 2-7 دقيقة.
  11. إزالة وتجاهل طاف.
  12. كرر الخطوات من 2.8 و 2.11 (مرتين) مع 200 ميكرولتر 18 MilliQ المياه لغسل النانوية.
  13. إعداد شطف العازلة الطازجة: إضافة 970 ميكرولتر أسيتونتريل إلى 30 هيدروكسيد الأمونيوم ميكرولتر في أنبوب نظيفة. الحذر: هيدروكسيد الأمونيوم غير قابلة للتآكل. مع استخدام التهوية المناسبة. ملاحظة: يجب أن يكون مستعدا المخزن المؤقت شطف فورا قبل الاستخدام. لا تقم بتخزين شطف العازلة.
  14. إضافة 20 ميكرولتر شطف العازلة لبيليه جسيمات متناهية الصغر. Resuspend والجسيمات النانوية من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا عدة مرات. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
  15. تدور العينات جسيمات متناهية الصغر في 16،100 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة وحفظ طاف في نظيفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. لا تعطيل بيليه جسيمات متناهية الصغر. تجاهل بيليه في سلة المهملات واقية.
  16. وضع العينات في رف في غطاء الدخان الكيميائي. فتح القبعات والمؤتمر الوطني العراقيأوباتي في RT لمدة 30 دقيقة. بدلا من ذلك، وضع العينات تحت تدفق النيتروجين عند 40 درجة مئوية حتى الجافة (1 - 2 ساعة).
  17. إضافة 15 ميكرولتر تريس، جليكاين العازلة عينة SDS (2X) للعينات. الحرارة عند 100 درجة مئوية في كتلة الحرارة الجافة لمدة 5 دقائق مع قبعات مفتوحة أو حتى حجم اليسار في أنبوب ليس أكثر من 20 ميكرولتر. ملاحظة: عدم استخدام حمام الماء المغلي. فإن الرطوبة من حمام الماء يمنع تبخر المخزن المؤقت.
  18. وضع غطاء على الأنابيب. إزالة أنابيب من كتلة الحرارة. ويمكن تخزين العينة في -80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لالمصب تحليل لطخة الغربي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هيدروجيل الجسيمات النانوية الحجم والتوحيد

وقد تم إنتاج بولي (NIPAm-AAC) الجسيمات مع ارتفاع العائد للغاية والتكاثر بين وداخل دفعات. الجسيمات الغروية لها الاستقرار جيدة جدا في RT خلال الوقت اللازم لالتقاط وتخزين وشطف من البروتينات (لا يقل عن 48 ساعة)، ولم يلاحظ هطول جسيمات متناهية الصغر (الشكل 1) 11. قد يكون الاستقرار الغروية مهم جدا لسرعة امتصاص بروتين / الببتيد بواسطة النانوية.

المؤشرات الحيوية المحتملة منخفضة فرة تحصد من البلازما

دمج الطعم صبغ يحرك امتصاص الجزيئات في الحل ويؤكد أن يتم الاحتفاظ جزيئات تم الاستيلاء عليها من التدهور 13، 15، 18، 25، ولهذا السبب، ليست هناك حاجة مثبطات الأنزيم البروتيني خلال عينة ما قبل المعالجة. هذه السمة من الجسيمات النانوية يجعلها ياليuitable كتقنية المحافظة لجمع العينات في الميدان وللشحن من السوائل البيولوجية في RT.

ويمكن إدراج جزيء الطعم في الجسيمات هيدروجيل بواسطة البلمرة أو التساهمية ملزم لمجموعات وظيفية موجودة في جسيمات متناهية الصغر. كمثال على ذلك، شيدت بولي (NIPAm-CO-AAC) الجسيمات النانوية مع الأمينية التي تحتوي على الأصباغ عبر طول صفري ردود الفعل يشابك amidation، في حين تم إنشاؤها النانوية مع القشرة الخارجية التي تحتوي على حمض vinylsulfonic (VSA) كوبوليمر من رد فعل البلمرة الثاني 10-13. أنواع مختلفة من الجسيمات النانوية يمكن أن تنتج من خلال دمج صبغة كيميائية مختلفة داخل جسيمات متناهية الصغر وبالتالي تعزيز الحصاد فئات معينة من البروتينات. مفهوم هام من التكنولوجيا لدينا هو أن الطعوم المختلفة يمكن أن تظهر تقارب تفضيلية للبروتينات مختلفة لأن التفاعل صبغ البروتين يعتمد أساسا على مجموعة من التفاعلات مسعور، 3-D ينتراكستعقد وقوات كهرباء. وقد لاحظنا أن بعض التحاليل يمكن التقاط مع تقارب عالية من الأصباغ المختلفة كيميائيا بسبب تعقيد القوات ملزمة. رؤية Tamburro آخرون تفسيرا والأمثلة واسعة من هذا المبدأ 13. على سبيل المثال، تم استخدام أربعة أنواع مختلفة من التقاط الطعم (النانوية) لحصاد TNFα من البلازما باستخدام 200 ميكرولتر من جزيئات البلازما و 200 ميكرولتر لكل نوع من جسيمات متناهية الصغر. في جميع الحالات بعد العلاج مع النانوية، كان TNFα لا يمكن كشفها في طاف بواسطة SDS-PAGE مع الفضة تلطيخ، في حين كان TNFα كشفها في شطافة جسيمات متناهية الصغر (الشكل 1C). (لين 1 = TNFα المؤتلف (MW 17،000 دا)، والممرات 2 و 3 و 4 و 5 و 6 و 7 و 8 و 9 وتمثل نتائج لأربعة أنواع مختلفة من الطعوم جسيمات متناهية الصغر على التوالي؛ C = السيطرة، S = طاف، P = جسيمات متناهية الصغر شطافة).

الجرعة والاستجابة لزراعية مختلفةأنواع الإيجار من anoparticles N

من أجل إجراء منحنى المعايرة، وبالتالي تقييم المحصول والدقة، وتحتاج التجارب التي يتعين القيام بها مع البروتينات ارتفعت في التركيز المعروفة. النتائج المنشورة لمجموعة متنوعة من سوائل الجسم والتحاليل تثبت كيف يحافظ على جسيمات متناهية الصغر ما قبل المعالجة الخطي للمقايسة ويحدد منحنى المعايرة مع تعزيز الحد الفعال لكشف 10 و 16 و 26. لقد نشرت أيضا دراسات من الدقة بين المختبر استخدام الجسيمات النانوية لإجراء رد فعل متعدد رصد الطيف الكتلي مع تعزيز حساسية 27.

لمقارنة IL-17 كفاءة الحصاد بواسطة أنواع مختلفة من جسيمات متناهية الصغر، وأضيف المؤتلف IL-17 (17.5 كيلو دالتون) لعينات البلازما التي إما بولي (NIPAm-CO-AAC) أو بولي تم إضافة (NIPAm-CO-VSA) النانوية في وقت لاحق . تم إعداد مجموعتين من أربعة التخفيفات المسلسل من 100 نانوغرام من المؤتلف IL-17 في 10081؛ ل البلازما (100 نانوغرام / 100 ميكرولتر، 50 نانوغرام / 100 ميكرولتر، 25 نانوغرام / 100 ميكرولتر و 12.5 نانوغرام / 100 ميكرولتر). أضيفت بولي (NIPAm-CO-AAC) أو بولي (NIPAm-CO-VSA) الجسيمات للعينات البلازما منها في 1: 1 (ت / ت) الجسيمات: نسبة البلازما. وأجريت الطيفي فحص البروتين الكلي على عينات طاف. تم إجراء النشاف الغربية مع المضادة للأرنب بولكلونل IL-17 في 20 ميكروغرام من طاف البلازما (S) بعد الحصاد جسيمات متناهية الصغر وeluates جسيمات متناهية الصغر (P) (الشكل 4). كلا النوعين جسيمات متناهية الصغر حصاد كاف وتتركز IL-17 في كل التخفيف. العصابات إضافية على لطخة غربية تمثل ألبومين المصل البشري والغلوبولين المناعي التي تتفاعل العابرة مع الضد الثانوية. (جسيمات AAC: دروب 1 & 2 = 1 نانوغرام / ميكرولتر IL-17، والممرات 3 و 4 = 0.50 نانوغرام / ميكرولتر، حارات 5 و 6 = 0.25 نانوغرام / ميكرولتر، والممرات 7 و 8 = 0.125 نانوغرام / ميكرولتر، لين 9 = IL-17؛ جزيئات VSA: حارات 1 و 2 = 1 نانوغرام / ميكرولتر IL-17، والممرات 3 و 4 = 0.50 نانوغرام / ميكرولتر،الممرات 5 و 6 = 0.25 نانوغرام / ميكرولتر، والممرات 7 و 8 = 0.125 نانوغرام / ميكرولتر).

الكشف عن البروتينات التشخيص المحتمل في البول

عينات البول الإنسان، تم الحصول عليها من المتبرعين المتطوعين صحية مع الموافقة المسبقة الخطية، وارتفعت مع الأنواع المتفطرة المؤتلف مستضد البروتين الهدف المبكر إفرازية السل المتفطرة (ESAT-6) لتقليد السل المتفطرة الأفراد المصابين. تم إضافة 1 ميكروغرام لكل من ESAT-6 (15 كيلو دالتون) وIL-2 (15.5 كيلو دالتون) إلى 1 مل aliquots من البول البشري جمعت من المانحين المتطوعين صحية. تم إجراء تحليل البول على عينات مع قطاع البول الكاشف لتحديد النسبة المثلى من الجسيمات النانوية إلى البول، والذي استند إلى وجود / غياب البروتينات البولية. استخدمت بولي (NIPAm / صبغ) النانوية لحصاد البروتينات من عينات البول المعالجة وغير المعالجة. تم إجراء أحادي البعد الكهربائي للهلام eluates جسيمات متناهية الصغر وollowed من الفضة تلطيخ. العينات في U4 و U6 الممرات تمثل eluates جسيمات متناهية الصغر من ESAT-6 و IL-2 عينات البول المعالجة، تظهر بوضوح فرق بارزة في 15 كيلو دالتون (الشكل 5). مطياف الكتلة لتحديد eluates ESAT-6 (UniProt الانضمام POA567، 84.0 التغطية، والببتيدات 9) وIL-2 (UniProt الانضمام P60568، 38.56 التغطية، والببتيدات 3). ويرد البول دون حصاد جسيمات متناهية الصغر في الممر المسمى "الخام".

الشكل 1
الرقم 1. النانوية الحصاد والتركيز فرة البروتينات منخفضة من السوائل البيولوجية المعقدة. (A) سير العمل للبروتينات الحصاد. مجموع وقت المعالجة حوالي 1.5 ساعة. وتتركز البروتينات في حل من الدم والمصل والبلازما والبول والعرق واللعاب، أو سوائل الجسم الأخرى (تركيز 1،000 أضعاف يصور). (B)دفعة دفعة للمقارنة تبين حجم موحد النانوية. القوة الذرية الميكروسكوب على الميكا معارض التوحيد من حجم (0.7 ميكرون قطر) وعدم وجود تكتل على دفعتين الجسيمات النانوية. (C) 1-D الكهربائي للهلام، مع احقة تلطيخ الفضة، من عامل نخر الورم ألفا (TNFα) المحتبسة من البلازما. الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. جسيمات متناهية الصغر إجراء الحصاد من البلازما / مصل المصب لتحليل الطيف الكتلي (A) النانوية لا تزال معلقة في محلول (بولي (NIPAm / صبغ) معروضة). يتم إضافة (B) النانوية على عينة البلازما المخفف. (C) و جسيمات متناهية الصغر البلازما تعليق طق نسج في جهاز للطرد المركزي لفصل الجسيمات النانوية من طاف. (D) بعد الطرد المركزي، والجسيمات النانوية تشكل بيليه واضح في الجزء السفلي من الأنبوب. (E) بعد غسل النانوية، تتم إزالة شطافة تحتوي على البروتينات حصادها وحفظها . لتحليل المصب (F) يجفف تحت شطافة تدفق النيتروجين في المبخر عند 42.1 درجة مئوية، وتدفق الهواء 8، ل1 - 2 ساعة قبل قياس الطيف الكتلي الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. تحليل البول باستخدام شرائط متعددة الحليلة كاشف لمراقبة جودة العينة. (A) ومشربة كل لوحة على الشريط الكاشف مع الأصباغ والمواد الكيميائية، والإنزيمات، و / أو مؤشر التي تتفاعل مع تختلفالأنف والحنجرة البول تحليلها (على سبيل المثال، الجلوكوز، البيليروبين، كيتون، الثقل النوعي، الدم، ودرجة الحموضة، البروتين، يوروبيلينوجين، النتريت، و / أو استريز الكريات البيض). وأوضح البول بواسطة الطرد المركزي. يضاف قطرة من البول إلى كل لوحة على الشريط الكاشف. (B) تتم مقارنة لون كل لوحة بصريا إلى كتل اللون على الحاوية، في الوقت المحدد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الشكل 4.   حصاد IL-17 من البلازما باستخدام الأساسية (AAC) أو الأساسية قذيفة (VSA) الجسيمات النانوية. 1-D الكهربائي للهلام والغربية النشاف مع مكافحة IL-17 يوضح قدرة حمض الاكريليك (AAC) وVSA النانوية قذيفة الأساسية لحصاد المختلفة بغية دراسته واقرارهntrations من IL-17 من البلازما. (S = طاف بعد الحصاد جسيمات متناهية الصغر، والجسيمات P = جسيمات متناهية الصغر شطافة AAC: حارات 1 و 2 = 1 نانوغرام / ميكرولتر IL-17، والممرات 3 و 4 = 0.50 نانوغرام / ميكرولتر، حارات 5 و 6 = 0.25ng / ميكرولتر، الممرات 7 و 8 = 0.125 نانوغرام / ميكرولتر، لين 9 = IL-17؛ جزيئات VSA: حارات 1 و 2 = 1 نانوغرام / ميكرولتر IL-17، والممرات 3 و 4 = 0.50 نانوغرام / ميكرولتر، حارات 5 و 6 = 0.25 نانوغرام / ميكرولتر، والممرات 7 و 8 = 0.125 نانوغرام / ميكرولتر) يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. استرداد مستضد المتفطرة السل وخلوى IL-2 من البول باستخدام الجسيمات النانوية هيدروجيل. تلطيخ الفضة التالية 1-D زش الكهربائي لعينات البول. العينات في الممرات U4 و U6 تمثل eluates من عينات البول التي تحتوي على المؤتلف ESAT-6 و IL-2، والتي تبين بوضوح العصابات بارزة في 15 كيلو دالتون. مطياف الكتلة لتحديد eluates ESAT-6 (UniProt الانضمام POA567، 84.0 التغطية، والببتيدات 9) وIL-2 (UniProt الانضمام P60568، 38.56 التغطية، والببتيدات 3). (RAW = البول دون حصاد جسيمات متناهية الصغر، U1، U2، U3، U5، U7، U8 = البول تفتقر المؤتلف ESAT-6 و IL-2 بعد الحصاد جسيمات متناهية الصغر). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

: 311px؛ "> نطاق الأسرة EF-ناحية، D2 عضو 115px؛ "> 100 GHT = "21"> مقصف؛ "> غير معروف
اسم البروتين GI عدد بروتين التركيز في المصل / البلازما [نانوغرام / مل] إشارة
ABL-interactor ل1 على شكل الإسوي 61743942 غير معروف
AMP تنشيط بروتين كيناز gamma2 فرعية على شكل الإسوي 33186925 غير معروف
CAS-BR-M (الفئران) ecotropic فيروسات تحويل تسلسل 52426745 غير معروف
chemokine (CC عزر) يجند 18 (الرئوية وتنشيط التنظيم) 4506831 30 34
chemokine (CC عزر) يجند 5 22538814 1.5 31
chondroadherin 153251229 غير معروف
كروموسوم 16 إطار القراءة المفتوحة 80 8392875 غير معروف
Consortin 213021160 غير معروف
defensin، ألفا 4، corticostatin 4503303 غير معروف
20149675 غير معروف
بروتين سكري الأولى ب (الصفائح الدموية)، ببتيد بيتا 4504073 غير معروف
جوانين النوكليوتيدات ملزم البروتين (بروتين G)، ف ببتيد 40254462 غير معروف
Heparanase 148746204 غير معروف
عامل النمو الذي يشبه الانسولين 2 (سوماتوميدين A) 189083846 30
lacritin 15187164 غير معروف
الكريات البيض الخلايا المشتقة من chemotaxin 2 59806345 200،000 33
lipocalin 2 (24p3 الجين الورمي) 38455402 0.05 28
أحادي الغليسريد الليباز، CRA_b شكل الإسوي 6005786 غير معروف
N-ethylmaleimide تراعي بروتين عامل المرفق، ALPHو 47933379 غير معروف
واحد قطع homeobox 2 119220564 غير معروف
الألياف الكثيفة الخارجي من ذيول الحيوانات المنوية 4 171184433 غير معروف
الحنك والرئة والأنف ظهارة المرتبطة 18765705 غير معروف
البروتين الاعتراف ببتيدوغليكان 2 156616294 غير معروف
77695917 4 29
CASC3 البروتين 15721939 غير معروف
RAB27B، RAS عضو الجين الورمي الأسرة 5729997 غير معروف
جمعية رأس (RalGDS / AF-6) نطاق الأسرة 6 وشكل الإسوي 29789443 غير معروف
رأس المتعلقة البروتين RAB10 ملزم GTP 33695095 غير معروف
حلقة البروتين إصبع 166 30520320 غير معروف
استجابة الحرمان المصل (البروتين ملزمة فسفاتيديل) 4759082 غير معروف
المذاب الناقل الأسرة 33 (نقل الاسيتيل جنة الزراعة)، عضو 1 4757708 غير معروف
ST6 بيتا galactosamide ألفا 2،6-1 sialyltranferase على شكل الإسوي 27765091 15 32
مثل ثيموسين 3 34013530 غير معروف
مثل transducin محسن من الانقسام 3 (E (sp135) homolog، ذبابة الفاكهة) 157384982 غير معروف
ناقلة الغلوتامين 1 4507475 غير معروف
WD تكرار المجال 1 9257257 غير معروف
WD تكرار نطاق 91 222080092
تكرار تحتوي على 2 شين الأكتين ملزم 119372317 غير معروف

الجدول 1. مثال البروتينات وفرة منخفضة تحصد النانوية من المصل / البلازما. (PeptideAtlas peptidome مطياف الكتلة) 28-34 بتصرف مع الإشارة permissionfrom 13 (Tamburro، D. آخرون متعدد الوظائف الأساسية قذيفة النانوية:. اكتشاف المؤشرات الحيوية غير مرئية سابقا J آم كيم سوك، 133، 19178-19188، (2011 )) جميع الحقوق محفوظة 2011 الجمعية الكيميائية الأمريكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الصلة السريرية

ويعتقد أن المصل أو البلازما عينة لاحتواء منخفضة وفرة البروتينات والببتيدات المنتشرة التي يمكن أن توفر مصدرا غنيا للمعلومات عن حالة الكائن الحي ككل. على الرغم من الوعد البروتينات في الدم، وهناك ثلاثة حواجز الفسيولوجية الأساسية والخطيرة إحباط اكتشاف العلامات البيولوجية والترجمة لفائدة سريرية 10، 11، 16، 25.

قد توجد 1. المؤشرات الحيوية التشخيصية هامة في وفرة منخفضة للغاية (تركيز) في الدم. مرحلة مبكرة الأنسجة المريضة، مثل الآفات السرطان النقيلي قبل، قد تشكل أقل من عدد قليل مم 3. سوف تصبح مخففة للغاية تسلط المؤشرات الحيوية في الدورة الدموية من هذا النسيج حجم صغير في حجم الدم كله. قد توجد التحاليل ذات الصلة دون حدود الكشف عن مطياف الكتلة والمناعية التقليدية.

2. المؤشرات الحيوية وفرة منخفضة /وملثمين البروتينات من خلال وجود وفرة عالية من البروتينات مثل الألبومين والغلوبولين المناعي، والتي تمثل ما يصل إلى 90٪ من بروتيوم البلازما 14.

3. البروتينات والببتيدات عرضة للتدهور من proteinases الداخلية والخارجية التالية بزل الوريد وعينة النقل / التخزين. تدهور البروتين يمكن أن يؤدي إلى نتائج سلبية أو إيجابية كاذبة كاذبة 35.

وقد وضعت النانوية هيدروجيل كما مسامية، مزدهرة، والبوليمرات التي تحتوي على الأصباغ anthraquinonetriazine و / أو قذائف حمض vinylsulfonic للبروتين الببتيد والحصاد والحفاظ عليها في سوائل الجسم 11 و 13. مجموعتنا تصنيعه واختباره النانوية هيدروجيل بين functionalized مع مجموعة كبيرة من الأصباغ العضوية (أي. أو المسلفنة والأصباغ غير sulfonatedanthraquinonetriazine) وأظهرت الانتماءات تفضيلية لعدة البروتين التحاليل 11 و 13. أنشأنا أيضا بروتوكولات لاكتشاف العلامات البيولوجية التي تستخدمالنانوية هيدروجيل مع الليمفاوية، اللعاب، السائل النخاعي، والعرق والبول والبلازما والدم، أو مصل عينات 11، 13، 23، 24، 26.

الاستفادة المثلى من المعلمات حصاد جسيمات متناهية الصغر قبل الحصاد من البروتينات الثمينة العينات السريرية / البحوث أمر ضروري لتحقيق نتائج مثالية. يجب أن يكون كميا كمية البروتين في عينات لتحديد النسبة المثلى من الجسيمات النانوية لحجم العينة. للالتحاليل تركيز معروف، منحنى الاستجابة للجرعة باستخدام البروتينات المؤتلف يوفر المعلومات المتعلقة بحدود الكشف. إذا كان هناك عينة كافية، وأنواع مختلفة من الجسيمات النانوية يمكن استخدامها لتحديد جسيمات متناهية الصغر مثالية لتحليلها وعينة.

تحليل البول قبل الحصاد جسيمات متناهية الصغر يوفر اختبار مراقبة الجودة عينة البول. تقارب من الطعم جسيمات متناهية الصغر الصبغة يعتمد على نقطة تساوي الكهربية من البروتين من الفائدة ودرجة حموضة الوسط المحيط. البول الرقم الهيدروجيني تكونتوين 5.5 و 7.0 هو الأمثل للحصاد البروتين مع بولي (NIPAm / صبغ) الجسيمات النانوية. وجود خلايا الدم الحمراء أو hemolyzed سليمة (1+ الدم على الشريط الكاشف) لا تتداخل مع حصاد جسيمات متناهية الصغر.

في هذا البروتوكول ركزنا على تطبيق النانوية هيدروجيل لحصاد البروتينات من الدم والبول. يمكن أن تشمل التطبيقات المستقبلية سوائل الجسم الأخرى مثل السائل الزجاجي للعين، أو السائل الزليلي. المحتملة في التطبيقات الجسم الحي يمكن تصور للمستقبل الذي يتم حقن جزيئات النانو إلى الأنسجة المريضة لجمع الجزيئات الحيوية. كما أن تركز العمل في المستقبل على تطوير أجهزة جديدة لالتقاط والحفاظ على المؤشرات الحيوية، مثل رقعة الجلد القائم على جسيمات متناهية الصغر لتحليل بروتيوم رشحة الجلد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

مايكل هنري، جامعة مدينة دبلن، يرجى المساعدة في جمع البيانات وتحليلها هو مبين في الشكل 5. وأيد هذا العمل جزئيا من قبل (1) جامعة جورج ماسون، (2) الإيطالية IstitutoSuperiore دي سانيتا "في إطار ايطاليا / الولايات المتحدة الأمريكية اتفاقية تعاون بين وزارة الصحة والخدمات الإنسانية، جامعة جورج ماسون، والوزارة الإيطالية للصحة العامة، (3) NIH، برنامج المنح IMAT 1R21CA137706-01 و1R33CA173359-01 إلى LAL، و (4) سيريس العلوم النانوية، وشركة .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogel nanoparticles Ceres Nanoscience CS003 NanoTrap ESP particles
18 MΩ-cm water Type 1 reagent grade water
Tris HCl, 50 mM pH 7.0 VWR IC816116 50 mM, pH 7
Acetonitrile BDH BDH1103-4LP Available from VWR
Ammonium Hydroxide NH4OH BDH BDH3014 Available from VWR, assayed at 28-30% NH3
Sodium thiocyanate 25 mM Acros Organics 419675000 For serum/plasma samples
Multi-analyte Urine Reagent Strips Siemens 2161 For urine samples
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) Life Technologies LC2676 Use at RT to prevent SDS from precipitating
Dry bath incubator (100 oC) with heating block Barnstead 11-715-125DQ Do not substitute a boiling water bath
Nitrogen evaporator manifold Organomation Associates Microvap118 For serum/plasma samples
Centrifuge, swing-out rotor Sorvall Legend series 50 ml tube capacity, rcf 3,700 x g
Centrifuge, fixed angle rotor Eppendorf 5424 1.7 ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g
50 ml conical centrifuge tubes Fisher Scientific 14-432-22 With screw caps for urine samples
1.5 ml microcentrifuge tubes Eppendorf 22363204
Vortex mixer Fisher Scientific 50-949-755
Timer Fisher Scientific S04782 Seconds/minutes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
  2. Gerszten, R. E., et al. Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).
  3. Merrell, K., et al. Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry. J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).
  4. Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery. Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).
  5. Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood. Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).
  6. Geho, D., et al. Fractionation of serum components using nanoporous substrates. Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).
  7. Sennels, L., et al. Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads. J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).
  8. Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer. J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).
  9. Marshall, J., et al. Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction. J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).
  10. Fredolini, C., et al. Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles. Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).
  11. Luchini, A., et al. Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation. Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).
  12. Patanarut, A., et al. Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).
  13. Tamburro, D., et al. Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers. J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).
  14. Anderson, N. L., Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
  15. Fredolini, C., et al. Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH. Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).
  16. Longo, C., et al. Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers. PLoS One. 4 (3), e4763 (2009).
  17. Luchini, A., et al. Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).
  18. Luchini, A., et al. Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals. J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).
  19. Eslami, A., Lujan, J., Western, blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
  20. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
  21. Penna, A., Cahalan, M., , Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (7), 264 (2007).
  22. Bosch, J., et al. Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results. J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).
  23. Fredolini, C., et al. Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology. AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).
  24. Longo, C., et al. A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum. Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).
  25. Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F. 3rd, Liotta, L. A. Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).
  26. Douglas, T. A., et al. The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease. Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).
  27. Prakash, A., et al. Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies. J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).
  28. Choi, K. M., et al. Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease. Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).
  29. Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle. Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).
  30. Izycki, T., et al. Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy. Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).
  31. Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis. Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).
  32. Kitazume, S., et al. Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo. Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).
  33. Saito, T., et al. Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).
  34. Struyf, S., et al. PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia. Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).
  35. Michael, I. P., et al. Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression. J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 90، العلامات البيولوجية، هيدروجيل، وفرة منخفضة، مطياف الكتلة، جسيمات متناهية الصغر، والبلازما والبروتين والبول
هيدروجيل الجسيمات النانوية حصاد البلازما أو البول للكشف عن وفرة البروتينات منخفضة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Magni, R., Espina, B. H., Liotta, L. … More

Magni, R., Espina, B. H., Liotta, L. A., Luchini, A., Espina, V. Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins. J. Vis. Exp. (90), e51789, doi:10.3791/51789 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter