Abstract
Roman biyomarkör keşif daha duyarlı ve özgül hastalık tespiti sağlayan çok önemli bir rol oynar. Biyolojik sıvılarda mevcut Ne yazık ki çok düşük miktardaki biyolojik göstergeler kolayca kütle spektrometrisi ya da çok düşük bir konsantrasyonda mevcut olan değişken ve çoğu zaman, albümin veya immünoglobülin gibi proteinler, yüksek miktardaki maskelendiğinden, çünkü bağışıklık ile tespit edilemez. Bait içeren poli (N-izopropil akrilamid) (Nipam) göre nanopartiküller bu fizyolojik engelleri aşmak mümkün. Bir adım olarak onlar yakalama konsantre ve vücut sıvılarından biyomarkerları korumak mümkündür. Düşük molekül ağırlıklı analitler nanopartikül çekirdeğini girip daha yüksek bir afiniteye proteini yemler etki gösteren farklı organik kimyasal boyalar tarafından yakalanır. Nanopartiküller büyüklükte birkaç emir tarafından ilgi proteinlerin konsantre edebiliyoruz. Bu konsantrasyon faktörü proteinleri içindedir böylece protein seviyesini yükseltmek için yeterlidirGeçerli Massenspektrometer, batı lekeleme ve immunoassay'lerin saptama sınırı. Nanopartiküller biyolojik sıvıların bir bolluk ile inkübe edilebilir ve albümin ve diğer yüksek molekül ağırlıklı proteinler hariç ederken, büyük ölçüde düşük molekül ağırlıklı proteinler ve peptidlerin konsantrasyonu arttırmakta edebiliyoruz. Bizim veriler, belirli bir analit konsantrasyonunun 10,000 kez amplifikasyon önceden belirlenemeyen biyolojik işaretleri tespit etmek için kütle spektrometrisi ve immün sağlayarak elde edilebileceğini göstermektedir.
Introduction
Insan genomu dizileme tamamlanmasına rağmen, önemli ilerlemeler erken evre hastalığın öngörü belirlenmesi biyomarkerlerindeki yapılmamıştır, ya da tedavi sonucu veya prognoz 1 ile ilişkilidir. Bu ilerleme olmaması için bir nedeni olarak birçok potansiyel önemli belirteçler konvansiyonel kütle spektrometresi ve diğer biyobelirteç keşif platformlarda saptama sınırının altında bir konsantrasyonda mevcut olduğunu. Kütle spektrometrisi (MS) ve çoklu reaksiyon takip işlemi (MRM), tipik olarak, bir algılama hassasiyeti daha büyük olan 50 ng / ml olarak ise 50 pg / ml ve 10 ng / ml arasında değişen bir klinik laboratuar düşme ile ölçülen bağışıklık analitlerin çoğunluğu . Bu, özellikle bir hastalığın erken evrede pek biyomarkırlar, geleneksel MS ve MRM 2 ile tespit edilemez anlamına gelir. Ayrıca bu gibi kompleks biyolojik sıvılarda albümin ve immunoglobülin gibi yüksek bolluk proteinlerin varlığı genellikle milyar kat exc ile maskeesini düşük miktardaki, düşük molekül ağırlıklı proteinler ve peptitler 3, 4. bu nedenle birçok örnek hazırlık adımları kütle spektrometrisi sekanslama ve kimlik önce gerekmektedir. Bu gibi bir hazırlık aşaması ticari olarak temin edilebilen tükenme sütunlar 5-8, yüksek miktardaki proteinlerin tükenmesi kullanmaktadır. Genellikle kovalent olmayan bir şekilde kaldırılmakta olan taşıyıcı proteinler ile ilişkili olduğundan, ne yazık ki, bu adım aday biyobelirteç verim azalmaya yol açar. Örnekler toplandığı bir zamanlar başka bir meydan aday biyomarkerların ex-vivo stabilitesi ile temsil edilmektedir. Proteinler, endojen veya eksojen proteazlar 9 ile degradasyona tabi tutulur. Bozulması 10-13 protein korurken hidrojel nanopartiküller, tahlilin aralığı içinde bir düzeye farazi biyolojik işaretleyici konsantrasyonunu yükselterek bu kritik zorlukları aşmak olabilir.
Bu th dikkat etmek önemlidirLMW, kanda proteinlerin küçük sağlam proteinler ile birlikte, bu büyük proteinlerin parçalarının bir karışımı bulunmaktadır. 60 kDa'dan daha büyük bir Doku türevli proteinler pasif vasküler bazal zar boyunca kan akışına girmesine kadar büyük, ancak peptidler veya protein parçacıkları 14 kanın temsil edilebilir. Amacımız Hastalığın erken teşhisi, tedavisi için hasta tabakalaşma ve tedaviye yanıtın izlenmesinde için aday olabilir roman dolaşan biyomarkerları ölçmektir. Bizim nanopartiküller anda küçük proteinler ve peptidler yakalama ve başlangıç hacmine göre 100 kat kadar onları konsantre olurken seçici, yüksek bolluk immünoglobinlerin ve albumin dışlamak için oluşturulur.
Bizim grup başarıyla proteinler ve peptidler için yüksek afinite moleküler yemler hareket edebilen küçük organik boyaların bir dizi tanımlanır. Protein boya bağlama bağlı olarak, hidrofobik ve elektrostatik etkileşimin bir kombinasyonu olduğu düşünülmektedirs. Boya üzerindeki aromatik halkalar protein yüzey 11 ile hidrofobik cepleri proteinleri ile dönüşümlü olarak çalışır.
Yemler, kimyalarına bağlı olarak seçilmiş analitlerin sınıfları için özel bir çekim gücü gösterirler. Yemler proteinler veya peptidlere, örneğin albumin gibi, taşıyıcı proteinler ile rekabet eder. Düşük molekül ağırlıklı proteinler / peptidler parçacık içinde sıkışır. , Albümin ve immunoglobülin gibi yüksek molekül ağırlıklı proteinler nedeniyle hidrojel 11 (Şekil 1) yer alan sınırlayıcı gözenek çünkü eleme yeteneğinin parçacık girmesini engellenir.
Hidrojel nanopartiküller amonyum persülfat 11 tarafından başlatılan çöktürme polimerizasyonu ile sentezlenir. N-izopropil (Nipam), akrilik asit (AAC) ve alilamin (AA) ve çapraz bağlayıcı, N, N'-metilenbisakrilamid (BIS) eş-monomerler arasında 1 seyreltik koşullar içinde, 6 saat boyunca 70 ° C'de reaksiyona girmesine imkan verilir1, 13. Poli yüksek protein bağlanma afinitesi (N-izopropil akrilamid-ko-akrilik asit) kovalent (amino içeren boya maddelerinin katılmasıyla, yani., Sulfonatedanthraquinonetriazine boyalar) nanopartiküllerin içine yoluyla elde (poli (Nipam-ko-AAC) nanoparticlesis Boyaların hidrofobik / hidrofilik özelliklere bağlı olarak, sulu ya da organik çözücü maddelerin içinde, bir amidasyon reaksiyonu 11, bir anthraquinonetriazine boyanın klorür atomu ile nanopartikül amin grubuna ait 13. nükleofilik ikamesi, boya ihtiva eden poli (Nipam oluşturmak için kullanılmaktadır CO-allilamin) (AA) 11 12 nanoparçacıklar. iki aşamalı polimerizasyon işlemi vinilsülfonik asit (VSA), 11, 13, bir dış kabuk içeren hidrojel nano-tanecikleri oluşturmak için kullanılır.
Hidrojel nanopartiküller, tam kan, plazma, serum, serebrospinal sıvı, ter ve idrar dahil olmak üzere çeşitli biyolojik sıvılar, uygulanabilir. Bir adım olarak, çözelti içinde, nanoparticles (birkaç dakika içinde) hızlı bir haciz ve düşük moleküler ağırlığa sahip konsantrasyonu, 10, 11, 13, 15-18 analitlerini gerçekleştirin. Proteinler daha sonra kullanılarak nanopartiküller yıkanır ve tespit edilir batı spektrometrisi 10, 11, 13, 15, 18, 22 kütle, 19-21 lekeleme, 23, bağışıklık / ELISA 10, 11, 15, 18, ya da ters faz, protein mikro-dizi 16 24 deneyleri. Nanopartiküller, kimyasal yem ile fonksiyonalize ve bir çekirdek ya da çekirdek-kabuk mimari, yakalama sunulması ve yem / kabuk fizikokimyasal özelliklerine göre proteinlerin konsantrasyonu. Nanopartiküller dahil farklı boyaların bu nedenle boya afinitesi göre verimlilik, çözeltinin pH değeri ve yüksek miktardaki proteinlerin 13 rakip varlığını / yokluğunu değişen proteinlerin, farklı alt çekecektir. Bundan başka, çözeltinin hacmi ile ilgili olarak nanopartiküllerin miktarı nanopartiküller gelen protein verimi etkileyecektir. Bu yönleriHidrojel nanoparçacık hasat Yüksek miktarda protein içeren plazma numuneleri hasat proteinleri için üç farklı nanopartikül yemler kullanılarak gösterilebilir, ve tipik olarak yüksek miktarda protein içermeyen idrar örnekleri vardır. Bu protokolde, hasat ve poli (Nipam-ko-AAC), Poli (Nipam / boya) ve çekirdek-kabuk nano-tanecikleri kullanılarak plazma numuneleri, tümör nekroz faktörü alfa (TNFa) konsantre göstermektedir (Poli (Nipam-ko-VSA)) . Poli (Nipam / boya) nanopartiküller Mycobacterium tuberculosis ile enfekte bireyler taklit insan idrar örneklerinde eklendi Mycobacterium türleri antijeni, konsantre gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan plazma ve idrar George Mason Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu onaylanan protokollerde aşağıdaki, bilgilendirilmiş yazılı onayı ile, sağlıklı gönüllü vericilerden toplanmıştır. Bağışçılar eşit ayrı ayrı analiz edildi 25 ve 42. Numune yaş arası Kafkas kadınlar ve erkekler arasında dağıtılmış ve havuza değil.
Serum veya Plazma Örneklerinin 1. Nanoparçacık İşleme
Plazma potansiyel biyo-düşük miktarda hidrojel nanopartiküller ile, çözelti içinde yakalanır. Tanecikleri, yıkandı, santrifüj ile ayrılmış plazma kuluçkaya yatırılır, ilave edilir ve çekilen proteinleri elüte edilir. Elüsyona tâbi tutulmuş proteinler alt-kütle spektrometrisi sekanslama ve tanımlanması için azot akışı altında kurutulur.
- Mikrosantrifüj tüp içinde 50 mM TrisHCI pH 7 (500 ul serum + 500 ul TrisHCI) 2: serumun 1 500 ul sulandırmak.
- 500 mcL poli (Nipam / AAc) çekirdek nanop Eklemakaleler. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Sabit açılı rotor ile donatılmış bir santrifüj içinde 10 dakika boyunca, 16,100 x g hızında 25 ° C örnek dönerler. Çıkarın ve süpernatant atın.
- Topağa 500 ul sodyum tiyosiyanat (25 mM) eklenir. Kuvvetlice pipetleme ve birden çok kez aşağı nanopartiküller süspanse.
- Sabit açılı rotor ile bir santrifüj içinde 10 dakika boyunca, 16,100 x g hızında 25 ° C örnek dönerler. Çıkarın ve süpernatant atın.
- Nanopartikül pelet MiliQ suyu içinde 500 ul ilave edin. Kuvvetlice pipetleme ve birden çok kez aşağı nanopartiküller süspanse.
- Sabit açılı rotor ile bir santrifüj içinde 10 dakika boyunca, 16,100 x g hızında 25 ° C örnek dönerler. Çıkarın ve süpernatant atın.
- Taze elüsyon tamponu hazırlayın: temiz bir tüp içinde 300 ul amonyum hidroksite ul asetonitril 700 ekleyin. Dikkat: Amonyum hidroksit aşındırıcı olduğunu. Uygun havalandırma ile kullanın. Not: Yıkama tamponu, preparatif olmalıdırared kullanımdan hemen önce. Elüsyon tamponu tutmayın.
- Nanopartikül pelet elüsyon tamponunun 300 ul ilave edin. Kuvvetlice pipetleme ve birden çok kez aşağı nanopartiküller süspanse. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Sabit açılı rotor ile bir santrifüj içinde 10 dakika boyunca, 16,100 x g hızında 25 ° C örnek dönerler. Çıkarın ve temiz, etiketlenmiş bir mikrosantrifüj tüpü içinde eluatın kaydedin.
- 1.10 - Tekrar 1.9 adımları. Bir mikrosantrifüj tüpe iki elüsyonların birleştirin.
- 8 (Şekil 2F) ayarlanmış hava akışı ile, 42.1 ° C 'de bir azot evaporatör manifoldunun, azot akışı altında sıvı kısımlar kurutun.
- O / N depolama için oda sıcaklığında kurutuldu eluatın saklayın, ya da uzun süreli depolama için -20 ° C, kütle spektrometresi, Western blotting, ELISA tahlilleri ya da (isteğe bağlı) öncesinde.
İdrar Örneklerinin 2. Nanoparçacık İşleme
Normal idrar az 30 mg / dl protein içerir ve1+ kandan daha az. Ancak, birçok hastalık / durumlar idrar protein ve normal kan seviyelerini değiştirebilir. Idrar örneği eklemek için nanopartiküllerin uygun hacminin belirlenmesinde yardımcı olmak için, bir idrar toplama nanopartikül önce gerçekleştirilir. İdrar biyolojik göstergeler idrar hacmi nanopartiküllerin oranını optimize gerektirebilir son derece düşük konsantrasyonlarda mevcut olabilir. Bu işlem alt Western blot analizi için idrar örnekleri nanopartikül hasat tarif etmektedir.
- Temiz, kuru bir plastik kap içinde idrar örnekleri toplamak. Bir 22 ml minimum hacim gereklidir. Analiz için hazır olana kadar mağazası idrar -80 ° C'de numune.
- Oda sıcaklığında ya da 4 ° de CO / N, dondurulmuş idrar çözülme. , Bir girdaplı karıştırıcı ile kısa bir süre karıştırılır. 50 ml'lik konik tabanlı polipropilen tüp içine idrar en az 22 ml dökün.
- 15 dakika boyunca 3700 x g'de dışarı salınan bir rotora sahip bir santrifüj içinde idrar dönerler. Temiz bir 50 ml'lik konik tabanlı polypr içine pelet bozmadan, idrar süzünopylene tüpü. Pelet atın.
- Bir multi-analit "idrar testi" reaktif şerit kullanarak idrar tahlili gerçekleştirin. Not: Doğrudan güneş ışığı ve nem 17, 18 uzak bir sıkıca kapalı bir kapta reaktif şeritler saklayın.
- Temiz, kuru bir kağıt havlu üzerine reaktif şerit, yüz-up, yatıyordu.
- Adım 2.3 hazırlanan idrar 1 ml aspire bir pipet kullanın.
- 2 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın ama başlamayın. Reaktif şerit her test pad üzerinde idrar 2 damla - Çabuk 1 dağıtın. Hemen sayacını başlatmak. Not: idrar konteyner doğrudan reaktif şerit batırmayın. Ayıraç şerit boya / kimyasal göstergeler potansiyel idrar kabına ayıraç şeridinin dışına yapışabilen.
- Reaktif şerit konteyner üzerindeki zamanda, karşılık gelen renk kodlu indica tek tek reaktif şeritlerin renk karşılaştırılarak bir ayıraç çubuğu üzerindeki çeşitli analitler için niteliksel neticelerin kayıtReaktif kabın üzerine monte edin. Tipik normal idrar Sonuçlar şu şekildedir: (normal veya negatif), kan, protein, lökosit, nitrit, glukoz, keton, bilirubin ve Ürobilinojen tayini için; İdrar pH (5,5-7,0); özgül ağırlığı (1,001-1,020). Not: Bir idrar örneğinde yüksek protein seviyelerinin nanopartiküller bağlanma alanlarında ilgilenilen protein ile rekabet edebilir. Nanopartiküller protein hasat üst düzeye çıkarmak için, nanopartikül hacim / hacim oranında idrar yüksek bolluk proteinlerinden ya da sınır rekabete ayarlanabilir ya da çok düşük konsantrasyonlarda mevcut proteinlerin toplanması için optimize edilebilir. Idrar protein değeri 1+ veya daha fazla ise, aşağıdaki adımda 2,5 nanopartiküllerinin 2x hacimlerini ekleyin. Ilgilenilen analit çok düşük bir miktarda bir protein ise, 2 ml (Şekil 3) 'e kadar nanopartiküllerin hacmini artırmak için gerekli olabilir.
- Aktarım, temiz 50 ml'lik konik tabanlı polipropilen tüp içine adım 2.3 açıklık idrar 20 mi. Yapamazidrar tüpün alt olabilecek herhangi bir artık / pelet rahatsız. 20 ml idrar numunesi ile nanopartiküller 200 ul ilave edin. , Bir girdaplı karıştırıcı ile kısa bir süre karıştırılır. Idrar protein değeri 1+ veya daha fazla ise, 20 mi idrara nanopartiküllerinin 400 ul ekleyin: edin.
- Sallanan / karıştırma olmadan, oda sıcaklığında 30 dakika için idrar / nanopartikül karışımı inkübe edin.
- 10 dakika boyunca 3700 x g'de dışarı salınan bir rotor ile donatılmış bir santrifüjde idrar / nanoparçacık süspansiyon dönerler. Not: pelet görünür ardından santrifüj değilse, ek bir 2 için örnekler dönmeye -, 7 dakika.
- Çıkarın ve süpernatant atın. Nanopartikül pelet 500 ul, MilliQ su ekleyin.
- Kuvvetlice pipetleme ve birden çok kez aşağı nanopartiküller süspanse. Temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne nanopartikül çözeltisini.
- 10 dakika boyunca 16.100 x g'de sabit açılı rotor ile donatılmış bir santrifüj içinde nano-tanecikleri dönerler. Not: pelet görünür vr değilse7 dakika - santrifüj iyice silinir, ek bir 2 için örnekler döndürün.
- Çıkarın ve süpernatant atın.
- Tekrar nanopartiküller yıkamak için 200 ul 18 MilliQ su ile (iki kez) 2.8 ve 2.11 adımları.
- Taze elüsyon tamponu hazırlayın: temiz bir tüp içinde 30 ul amonyum hidroksite ul asetonitril 970 ekleyin. Dikkat: Amonyum hidroksit aşındırıcı olduğunu. Uygun havalandırma ile kullanın. Not: Yıkama tamponu, kullanılmadan hemen önce hazırlanmış olmalıdır. Elüsyon tamponu tutmayın.
- Nanopartikül pelet 20 ul yıkama tamponu ilave edin. Kuvvetlice pipetleme ve birden çok kez aşağı nanopartiküller süspanse. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
- 10 dakika boyunca 16.100 x g'de nanopartikül örnekleri dönerler. Çıkarın ve temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü süpernatant kaydedin. Nanoparçacık pelet bozmayan. Biohazard çöpe pelet atın.
- Bir kimyasal davlumbaz rafa örnekleri yerleştirin. Kapaklar açın ve inc30 dakika boyunca oda sıcaklığında Ubate. (- 1, 2 saat) Alternatif olarak, kuru hale gelinceye kadar 40 ° C'de azot akışı altında örnekleri yer.
- Örnekler 15 ul Tris-glisin SDS numune tamponu (2x) ekleyin. Isı 100 ° C'de Açık veya boru içinde kalan hacme kadar kapakları 5 dakika boyunca kuru ısı bloğu, ° C olarak en fazla 20 ul'dir. Not: Bir kaynar su banyosu kullanmayın. Su banyosu nem tampon buharlaşmasını engeller.
- Borular üzerinde kapağını yerleştirin. Isı bloğu tüpleri çıkarın. Numune -80 ° C'de saklandı veya alt Western blot analizi için hemen kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hidrojel Nanoparçacık Boyutu ve tekdüzeliği
Poli (Nipam-AAC) partikülleri ile kümeler içinde son derece yüksek verim ve üretkenlik ile üretilmiştir. Parçacıklar yakalama, depolama ve proteinlerin elüsyonu (en az 48 saat) için gerekli olan süre boyunca, oda sıcaklığında çok iyi bir stabiliteye sahip kolloidal ve nano partiküler çökeltme (Şekil 1) 11 gözlenmemiştir. Koloidal stabilite nanopartiküller ile hızlı bir şekilde, protein / peptid alımı için çok önemli olabilir.
Plazma dan Hasat Potansiyel Düşük-bereket Biyobelirteçler
Boya yem dahil edilmesi çözelti içinde molekül alımını sürer ve yakalanan moleküller bozulması 13, 15, 18, 25 ya da korunmuş olmasını sağlar. Bu nedenle, proteaz inhibitörleri, numune ön-işleme sırasında gerekli değildir. Nanopartiküllerin Bu özellik onları s yaparalanda numune toplama için ve oda sıcaklığında, biyolojik sıvı nakli için bir koruma tekniği olarak dizayn edilmiş.
Yem molekül nanopartiküle bulunan fonksiyonel gruplara bağlanma kopolimerizasyona veya kovalent hidrojel parçacığa dahil edilebilir. Vinilsülfonik asit (VSA) kopolimer ihtiva eden bir dış kılıf ile donatılmış nanopartiküller, ikinci bir polimerizasyon reaksiyonu tarafından oluşturulmuş 10-13 iken, bir örnek olarak, poli (Nipam-ko-AAC) nanopartiküller, sıfır uzunlukta bir çapraz bağlama reaksiyonları vasıtasıyla amidasyon amino içeren boyaları ile inşa edilmiştir. Nanopartiküllerin farklı türleri proteinlerinin spesifik sınıfları hasat artırmak ve böylece nanopartiküle içinde farklı bir kimyasal boya içeren ve üretilebilir. Teknoloji bizim diğer bir yaklaşım, boya-protein etkileşimi, 3-B etkileşimin, hidrofobik etkileşimlerin bir arada esas olarak bağlı olduğu için, farklı yemler farklı proteinler için tercih edilen bir çekim gücü gösterirler olmasıdırleri ve elektrostatik kuvvetler. Bazı analitler nedeniyle bağlayıcı kuvvetlerin karmaşıklığı kimyasal olarak farklı boyalar ile yüksek afinite ile çekilebilir gözledik. Tamburro ark bakın. Bu ilke 13 geniş bir açıklama ve örnekler için. Örneğin, yakalama yem (nanopartiküllerin) dört çeşit parçacıkların 200 ul ve nanoparçacık her bir tipi için, 200 ul plazma kullanılarak plazmadan TNFa hasat etmek için kullanıldı. TNFa nanopartikül ayrılmış malzeme (Şekil 1C) olarak tespit edilebilir iken, nanopartiküller ile tedavi edildikten sonra her durumda, TNFa, gümüş lekeleme ile SDS-PAGE ile yüzer saptanabilir değildi. (Şerit 1 = rekombinan TNFa (MW 17.000 Da), kuşak 2 ve 3, 4 ve 5, 6 ve 7 ve 8 ve 9, sırasıyla nanopartikül yemler için dört farklı sonuçlar temsil eder, C = kontrol S = yüzer, p = nanopartikül Eluat).
Yönün için doz-yanıtN anoparticles kira Türleri
Verim ve hassas bir kalibrasyon eğrisi gerçekleştirmek ve böylece değerlendirmek için deneyler bilinen konsantrasyonda kirpi-proteinler ile yapılması gerekir. Vücut sıvıları ve analitlerin çeşitli açıklanan sonuçlara nanopartikül ön işleme deneyinin doğrusallığını sağlar ve tayin için, 10, 16, 26 etkin sınırını artırırken, bir kalibrasyon eğrisi nasıl kurduğunu göstermektedir. Ayrıca laboratuarlar arası hassas çalışmalar yayınlanmıştır nanopartiküller kullanarak gelişmiş hassasiyet 27 ile kütle spektrometresi izleme çoklu reaksiyonu yürütmek için.
Nanoparçacık farklı IL-17 hasat verimliliğini karşılaştırmak için, rekombinant IL-17 (17.5 kDa), plazma numunesi ya da hangi poli (Nipam-ko-AAC) ya da poli (toplam Nipam-ko-VSA), nanopartiküller ilave edilmiştir eklendi . Rekombinant IL-17, 100 ng seri halde dört sulandırılmış iki ayrı 100 içinde hazırlandı81. Örnek l plazma (100 ng / 100 ul, 50 ng / 100 ul, 25 ng / 100 ul ve 12.5 ng / 100 ul). 1 (h / h), partikül: Plazma oranında poli (Nipam-ko-AAC) ya da poli (Nipam-ko-VSA), partikülleri, 1 olarak ilgili plazma örnekleri ilave edildi. Spektrofotometrik toplam protein tahlili süpernatan numuneler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Anti-tavşan poliklonal IL-17 ile Western lekeleme nanoparçacık hasat ve nanopartikül yıkama sıvılarından (P) (Şekil 4) sonra plazma sıvı (S), 20 ug uygulandı. Her iki tip yeterli bir nanoparçacık hasat edildi ve her bir dilüsyonda, IL-17, konsantre edildi. Western blot üzerinde ilave bantların ikincil antikor ile çapraz reaksiyona girmesi, insan serum albümini ve immünoglobulin temsil eder. (AAc parçacıklar: Geçitler 1 & 2 = 1 ng / ul IL-17, Geçitler 3 & 4 = 0.50 ng / ul, Geçitler 5 ve 6 = 0.25 ng / ul Lanes 7 ve 8 = 0.125 ng / ul Lane 9 = IL-17; VSA parçacıklar: 1 & 2 = 1 ng / IL-17, Lanes 3 & 4 = 0.50 ng / ul ul Lanes,Geçitler 5 & 6 = 0.25 ng / ul Lanes 7 ve 8 = 0.125 ng / ml).
İdrarda Potansiyel Teşhis Proteinlerin Algılama
Bilgilendirilmiş yazılı onayı ile sağlıklı gönüllü donörlerden elde edilen insan idrar numuneleri, Mycobacterium tuberculosis ile enfekte bireyler taklit Erken Salgı Hedef Mycobacterium Tüberküloz proteini (ESAT-6) antijen bir rekombinant Mycobacterium türleri ile tutturuldu. 1 ug, ESAT-6 (15 kDa) ve IL-2 (15.5 kDa) her bir sağlıklı gönüllü vericilerden toplanan insan idrar, 1 ml'lik porsiyonlar ilave edildi. İdrar analizi üriner protein varlığında / yokluğunda dayalı idrara nanopartiküllerin, en uygun oranını belirlemek için bir idrar reaktif şerit ile numuneler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Poli (Nipam / boya) nanopartiküller, işlenmiş ve işlenmemiş idrar örnekleri proteinleri hasat etmek için kullanıldı. Nanoparçacık elüsyonların Tek boyutlu jel elektroforezi f yapıldıgümüş boyama ile ollowed. U4 ve U6 hatlarının Örnekleri açıkça 15 kDa (Şekil 5) belirgin bantları gösteren, ESAT-6 ve IL-2 tedavisi idrar örneklerinden nanoparçacık elüsyonların temsil eder. , ESAT-6 (UniProt katılım POA567, 84.0 kapsamı, peptidler 9) ve IL-2 (UniProt katılım P60568, 38.56 kapsamı, 3 peptidleri) tanımlanan yıkama sıvılarından kütle spektrometrisi. Nanoparçacık hasat edilmeden idrar "Ham" etiketli şeritte gösterilir.
Şekil 1. Nanoparçacıklar hasat ve karmaşık biyolojik sıvılarda düşük bolluk proteinleri konsantre. Hasat proteinler (A) İş Akışı. Toplam işlem süresi yaklaşık 1,5 saattir. Çözelti içinde proteinler, kan, serum, plazma, idrar, ter, tükürük veya diğer vücut sıvılarının (1000-kat konsantrasyon gösterilmektedir) için konsantre edilir. (B) 'Nanopartiküllerin üniforma boy gösteren toplu karşılaştırmak için Toplu. Mika Atomik Kuvvet Mikroskopi nanopartiküllerin büyüklüğü iki grup halinde (0.7 um çap) ve topaklanma olmaması oranda benzerliğini gösterir. (C) 1-D jel elektroforezi, Tümör Nekroz Faktörü alfa daha sonra gümüş lekeleme ile (TNFa) 'nın plazmada sekestre. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Alt-kütle spektrometre analizi için plazma / serum Şekil 2: Nanopartikül hasat işlemi (A). Nanopartiküller çözelti içinde asılı kalacaktır (Poli (Nipam / boya) olarak gösterilmiştir). (B) nanopartiküllerin seyreltilmiş plazma numunesi ilave edilir. (C) nanoparçacık plazma süspansiyon,süpernatanından nano-tanecikleri ayırmak için bir santrifüj içinde döndürülmüştür s. (D) Bir santrifüj, nanotanecikler, tüpün alt belirgin bir pelet oluşturur. (E) nano-tanecikleri yıkandıktan sonra, hasat proteinleri içeren ayrılmış ve elüat kaydedilir Eluat 42.1 ° C, 1 hava akımı 8, bir buharlaştırıcı azot akışı altında kurutulur alt analizi için (F) -.. öncesinde kütle spektrometresi 2 saat bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Numune kalite kontrolü için multi-analit reaktif şeritler kullanılarak Şekil 3. İdrar tahlili. (A) bir ayıraç çubuğu üzerindeki her bir ped, bir diferansiyel ile reaksiyona giren kimyasal maddeler, enzimler, ve / veya renk göstergeleri ile emprenye edilirent idrar analit (örneğin,., glikoz, bilirubin, keton, özgül ağırlık, kan, pH, protein, ürobilinojen, nitril ve / veya lökosit esteraz). İdrar santrifüj ile berraklaştırılır. Idrar bir damla reaktif şerit her pad eklenir. (B) Her ped renk görsel kabın üzerindeki renk blokları ile karşılaştırıldığında, belirtilen saatte. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Hasat IL-17 çekirdek (AAc) ya da çekirdek-kabuk (VSA) nanopartiküller kullanarak plazmadan. Anti-IL-17 ile lekeleme 1-D jel elektroforezi ve Western çeşitli konsan hasat akrilik asit (AAC) VSA çekirdek-kabuk nanopartiküllerin yeteneğini göstermektedirplazmadan IL-17 ntrations. Nanoparçacık hasat sonrası (S = süpernatant, p = nanoparçacık Eluat AAc parçacıklar:. Geçitler 1 & 2 = 1 ng / IL-17, Geçitler 3 & = 0.50 4 ng / ul, Geçitler 5 ve 6 = 0.25ng / ul, Lanes ul 7 & = 0.125 8 ng / ul Lane 9 = IL-17; VSA parçacıklar: Geçitler 1 & 2 = 1 ng / IL-17, Lanes 3 & 4 = 0.50 ng / ul, Lanes ul 5 & 6 = 0.25 ng / ul, Lanes 7 ve 8 = 0.125 ng / ml) , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5,. Kurtarma Mycobacterium tuberculosis antijeni ve sitokin, IL-2 hidrojel nano-tanecikleri ile idrar ila. 1-B, aşağıdaki g gümüş boyamaidrar örneklerinin el elektroforezi. Kuşak U4 ve U6 numuneler yeniden birleştirici, ESAT-6 ve IL-2 açık bir şekilde 15 kDa önemli bant yok içeren yıkama sıvıları, idrar örnekleri temsil eder. , ESAT-6 (UniProt katılım POA567, 84.0 kapsamı, peptidler 9) ve IL-2 (UniProt katılım P60568, 38.56 kapsamı, 3 peptidleri) tanımlanan yıkama sıvılarından kütle spektrometrisi. (RAW = nanoparçacık hasat edilmeden idrar; rekombinant ESAT-6 ve IL-2 aşağıdaki nanoparçacık hasat eksik U1, U2, U3, U5, U7, U8 = idrar). , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Protein adı | GI protein numarası | Yoğunlaşma serum / plazma [lOng / ml] | Referans |
| abl-interaktör 1 izoformu | 61743942 | Bilinmeyen | |
| AMP-aktive protein kinaz alt-birimi Gamma2 izoformu | 33186925 | Bilinmeyen | |
| CAS-Br-M (faregiller) ekotropik retroviral dönüştürme sekansı | 52426745 | Bilinmeyen | |
| kemokin (CC motifi) ligandı 18 (pulmoner ve aktivasyon düzenlenmiş) | 4506831 | 30 | 34 |
| kemokin (CC motifi) ligandı 5 | 22538814 | 1.5 | 31 |
| chondroadherin | 153251229 | Bilinmeyen | |
| Kromozom 16 açık okuma çerçevesi 80 | 8392875 | Bilinmeyen | |
| Consortin | 213021160 | Bilinmeyen | |
| defensin, alfa 4, corticostatin | 4503303 | Bilinmeyen | |
| 20149675 | Bilinmeyen | ||
| glikoprotein Ib (trombosit), beta polipeptid | 4504073 | Bilinmeyen | |
| guanin nükleotidi bağlayan bir proteindir (G proteini), k polipeptit | 40254462 | Bilinmeyen | |
| Heparanaz | 148746204 | Bilinmeyen | |
| insülin benzeri büyüme faktörü 2 (somatomedin A) | 189083846 | 115px; "> 10030 | |
| lacritin | 15187164 | Bilinmeyen | |
| lökosit hücre-türevli kemotaksin 2 | 59806345 | 200.000 | 33 |
| lipokalin 2 (onkogen 24p3) | 38455402 | 0.05 | 28 |
| Monogliserid lipaz, izoform CRA_b | 6005786 | Bilinmeyen | |
| N-etilmaleimit duyarlı faktörü bağlama proteini, AlfaBir | 47933379 | Bilinmeyen | |
| bir kesik homeoboks 2 | 119220564 | Bilinmeyen | |
| Sperm kuyrukları 4 dış yoğun fiber | 171184433 | Bilinmeyen | |
| damak, akciğer ve nazal epitel ilişkili | 18765705 | Bilinmeyen | |
| peptidoglikan tanıma proteini 2 | 156616294 | Bilinmeyen | |
| 77695917 | 4 | 29 | |
| Protein CASC3 | 15721939 | Bilinmeyen | |
| RAB27B, üye RAS onkogen aile | 5729997 | Bilinmeyen | |
| Ras derneği (RalGDS / AF-6) alanı aile 6 izoformu | 29789443 | Bilinmeyen | |
| ras ile ilintili olanlar GTP bağlayıcı protein RAB10 | 33695095 Bilinmeyen | ||
| yüzük parmak protein 166 | 30520320 | Bilinmeyen | |
| , serum yoksunluğu tepkisi (fosfatidilserin protein bağlayıcı) | 4759082 | Bilinmeyen | |
| çözünen taşıyıcı ailesi 33 (asetil-CoA taşıyıcı), üye 1 | 4757708 | Bilinmeyen | |
| ST6 beta galactosamide alfa-2,6-sialyltranferase 1 izoformu | 27765091 | 15 | 32 |
| timozin-3 gibi | 34013530 | Bilinmeyen | |
| bölünmüş 3 transdusin benzeri arttırıcı (E (sp135) homoloğu, Drosophila) | 157384982 | Bilinmeyen | |
| transglütaminazın 1 | 4507475 | Bilinmeyen | |
| WD tekrar alanı 1 | 9257257 | Bilinmeyen | |
| WD tekrar alanı 91 | 222080092 | px; "> Bilinmeyen||
| Xin 2 içeren tekrar aktin bağlayıcı | 119372317 | Bilinmeyen |
Serum / plazmadan nanopartiküller ile toplandı Tablo 1. Örnek, düşük sayıdaki proteinleri. (PeptideAtlas kütle spektrometrisi peptidomu) 28-34 permissionfrom referans 13 (Tamburro, D. ve arkadaşları uyarlanmıştır Çok fonksiyonlu olarak çekirdek-kabuk nanopartiküller.:.. Önceden görünmeyen biyobelirteç Keşif J Am Chem Soc, 133, 19178-19188, (2011 ).) Copyright 2011 American Chemical Society.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Klinik Uygunluk
Bir serum ya da plazma numunesi, bir bütün olarak organizmanın durumu ile ilgili bilgiler için zengin bir kaynak temin edebilmektedir proteinler ve peptidler, dolaşımdaki düşük bol miktarda içerir düşünülmektedir. Serum proteomik söze rağmen, klinik yarar 10, 11, 16, 25 biyomarkır keşif ve çeviri thwarting üç temel ve ciddi fizyolojik engeller vardır.
1. Önemli teşhis biyomarkerler kanda çok düşük bulunan (konsantrasyon) olarak mevcut olabilir. Bu tür ön-metastatik kanseri lezyonlarının erken aşama hastalıklı doku, bir kaç mm'den daha az 3 teşkil edebilir. Böyle küçük bir doku hacminden dolaşıma döken Biyobelirteçler yüksek tüm kan hacminin seyreltilmiş hale gelecektir. İlgili Analitler kütle spektrometresi ve konvansiyonel immunoassay'lerin saptama limitlerinin altında bulunabilir.
2. Düşük bereket biyomarkırlar /proteinler, plazma proteome'una 14% 90 kadarını temsil eder, albümin ve immunoglobülin gibi yüksek miktarda proteinlerin mevcudiyeti ile maskelenir.
3. Protein ve peptitler ve örnek olarak damar delinerek taşıma / depolamadan sonra iç ve dış proteazlar tarafından bozunmaya hassastırlar. Protein yıkımı, yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçların 35 yol açabilir.
Hidrojel nanopartiküller. Vücutta protein ve peptid hasat ve korunması için anthraquinonetriazine boyalar ve / veya vinilsülfonik asit ihtiva eden gözenekli kabukları, kaldırma, polimerler 11, 13 sıvıları ile geliştiği grubu sentezlenmiştir ve örneğin, organik boyalar bir bolluk (nano partikülleri ile işlevselleştirilmiş hidrojel test edilmiştir. sülfonatlanmakta ve non-sulfonatedanthraquinonetriazine boyalar) ve birkaç protein için tercihli akrabalıklar 11, 13, analitlerini gösterdi. Biz de kullanmak biyomarkör keşif için protokolleri kurulanlenf, tükürük, beyin omurilik sıvısı, ter, idrar, plazma, kan, serum ile hidrojel nanopartiküller 11, 13, 23, 24, 26, ve numune.
Değerli / klinik araştırma örneklerden önce hasat proteinlere nanopartikül hasat parametrelerinin en doğru sonuçları için gereklidir. Numunelerin içindeki protein miktarı, örnek hacmi nanopartiküllerin optimum oranını belirlemek için sayısal olmalıdır. Bilinmeyen konsantrasyon analitleri için, rekombinant proteinler, bir doz-yanıt eğrisi tespit limitleri ile ilgili bilgi sağlar. , Yeterli numune varsa, nanopartiküller çeşitli analit ve örnek için ideal bir nanopartikul belirlemek için kullanılabilir.
Nanoparçacık hasat öncesinde idrar tahlili idrar örneği kalite kontrol denetimi sağlar. Nanopartikül boya yem afinitesi ilgilenilen protein ile çevreleyen ortamın pH izoelektrik noktasına bağlıdır. İdrar pH'si olmakara 5.5 ve 7.0 poli (Nipam / boya) nanopartiküller protein hasat için en uygunudur. Hemolize ya da dokunulmamış, kırmızı kan hücrelerinin varlığı (ayıraç çubuğu üzerinde 1+ kan) nanopartikül hasat ile karışmaz.
Bu protokolde, plazma ve idrar proteinlerini hasat etmek üzere hidrojel nanopartiküllerin uygulanmasına odaklanmış. Gelecekteki uygulamalar, göz vitrözüne, ya da sinoviyal sıvı gibi diğer vücut sıvıları içerebilir. In vivo uygulamaları için potansiyel nanopartiküller biyomoleküllerin toplamak hastalıklı dokuya enjekte edildiği gelecek için öngörülebilir. Gelecek çalışmalar aynı zamanda cilt transudatif proteome'una analizi için bir nano-bazlı cilt yama olarak yakalama ve biyomarkerlerin korunması, yeni cihazların geliştirilmesi üzerinde durulacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nazik Şekil 5'te gösterilen veri toplama ve analizi ile destekli Michael Henry, Dublin City University,. Bu çalışma ile kısmen desteklenmiştir (1) George Mason Üniversitesi, (2) İtalya / ABD çerçevesinde İtalyan IstitutoSuperiore di Sanita ' ABD Sağlık Bakanlığı ve İnsan Hizmetleri, George Mason Üniversitesi ve Halk Sağlığı İtalyan Bakanlığı, (3) NIH, IMAT programı hibe 1R21CA137706-01 ve LAL için 1R33CA173359-01, ve (4) Ceres Nanobilimler, Inc arasında işbirliği anlaşması .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
| 18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
| Tris HCl, 50 mM pH 7.0 | VWR | IC816116 | 50 mM, pH 7 |
| Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | Available from VWR |
| Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | Available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
| Sodium thiocyanate 25 mM | Acros Organics | 419675000 | For serum/plasma samples |
| Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | For urine samples |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | Use at RT to prevent SDS from precipitating |
| Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | Do not substitute a boiling water bath |
| Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | For serum/plasma samples |
| Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50 ml tube capacity, rcf 3,700 x g |
| Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7 ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | With screw caps for urine samples |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
| Timer | Fisher Scientific | S04782 | Seconds/minutes |
References
- Aebersold, R., Mann, M.
- Gerszten, R. E., et al. Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).
- Merrell, K., et al. Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry. J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).
- Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery. Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).
- Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood. Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).
- Geho, D., et al. Fractionation of serum components using nanoporous substrates. Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).
- Sennels, L., et al. Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads. J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer. J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).
- Marshall, J., et al. Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction. J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).
- Fredolini, C., et al. Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles. Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).
- Luchini, A., et al. Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation. Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).
- Patanarut, A., et al. Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).
- Tamburro, D., et al. Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers. J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).
- Anderson, N. L., Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
- Fredolini, C., et al. Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH. Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).
- Longo, C., et al. Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers. PLoS One. 4 (3), e4763 (2009).
- Luchini, A., et al. Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).
- Luchini, A., et al. Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals. J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).
- Eslami, A., Lujan, J., Western, blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Penna, A., Cahalan, M., , Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (7), 264 (2007).
- Bosch, J., et al. Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results. J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).
- Fredolini, C., et al. Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology. AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).
- Longo, C., et al. A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum. Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).
- Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F. 3rd, Liotta, L. A. Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).
- Douglas, T. A., et al. The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease. Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).
- Prakash, A., et al. Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies. J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).
- Choi, K. M., et al. Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease. Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).
- Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle. Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).
- Izycki, T., et al. Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy. Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).
- Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis. Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).
- Kitazume, S., et al. Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo. Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).
- Saito, T., et al. Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).
- Struyf, S., et al. PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia. Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).
- Michael, I. P., et al. Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression. J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).
