Abstract
Novel biomarkører spiller en avgjørende rolle i å gi mer sensitiv og spesifikk sykdom deteksjon. Dessverre mange med lav overflod biomarkører som finnes i biologiske væsker kan ikke være lett oppdages med massespektrometri eller immunologiske analyser fordi de er tilstede i svært lav konsentrasjon er labil, og er ofte maskert av høy overflod proteiner som albumin eller immunglobulin. Agn som inneholder poly (N-isopropylacrylamide) (NIPAm) basert nanopartikler er i stand til å overvinne disse fysiologiske barrierer. I ett trinn er de i stand til å fange opp, konsentrere seg og bevare biomarkører fra kroppsvæsker. Lav-molekylvekt analytter går inn i kjernen av det nanopartikkel og fanges opp av ulike organiske kjemiske fargestoffer, som virker som høy affinitet protein agn. Nanopartiklene er i stand til å konsentrere proteiner av interesse ved flere størrelsesordener. Dette konsentrasjonsfaktoren er tilstrekkelig til å øke protein-nivå, slik at proteinene er innenfordeteksjonsgrense av dagens massespektrometre, western blotting, og immunologiske analyser. Nanopartiklene kan bli inkubert med et mangfold av biologiske fluider, og de er i stand til i høy grad øke konsentrasjonen av lav-molekylvekt proteiner og peptider, mens unntatt albumin og andre høy-molekylære proteiner. Våre data viser at en 10.000 ganger forsterkning i konsentrasjonen av en bestemt analytt kan oppnås, slik at massespektrometri og immunoanalyser for å detektere tidligere upåviselige biomarkører.
Introduction
Til tross for gjennomføring av human genom-sekvensering, har betydelige fremskritt blitt gjort for å identifisere biomarkører prediktive for tidlig sykdom, eller som korrelerer med terapeutisk resultat, eller en prognose. En årsak til denne mangelen på fremgang er at mange potensielt signifikante biomarkører eksisterer med konsentrasjoner under deteksjonsgrensen på konvensjonell massespektrometri og andre biomarkører plattformer. Massespektrometri (MS) og Multiple Reaction Monitoring (MRM) har en følsomhet typisk større enn 50 ng / ml, mens de fleste av analytter målt ved immunoanalyser i et klinisk laboratorium fall i området mellom 50 pg / ml og 10 ng / ml . Dette betyr at mange biomarkører, spesielt i tidlig stadium av en sykdom som ikke kan påvises ved konvensjonell MS og MRM 2. I tillegg er tilstedeværelsen av høy overflod proteiner slik som albumin og immunoglobulin i komplekse biologiske væsker ofte mask av milliarder gangers eksess lav-overflod, lavmolekylære proteiner og peptider med 3, 4. Av denne grunn er flere eksempler forberedende trinn er nødvendig før massespektrometri sekvensering og identifisering. En slik forberedende skritt syssels uttømming av høy overflod proteiner med kommersielt tilgjengelige uttømming kolonner 5-8. Dessverre er dette trinnet fører til reduksjon av utbyttet av kandidat biomarkører fordi de ofte er ikke-kovalent assosiert med bærerproteiner som blir fjernet. En annen utfordring er representert ved stabiliteten av kandidat biomarkører ex-vivo når prøvene er samlet. Proteiner er gjenstand for nedbrytning av endogene eller eksogene proteaser ni. Hydrogel nanopartikler kan overskride disse kritiske utfordringene ved å forsterke den antatte biomarkør konsentrasjon til et nivå innenfor området av analysen, og samtidig beskytte proteinet fra nedbrytning 10-13.
Det er viktig å merke thved LMW proteiner i blodet er en blanding av små intakte proteiner, så vel som fragmenter av større proteiner. Tissue-avledede proteiner som er større enn 60 kDa er for store til passivt inn i blodstrømmen gjennom det vaskulære basalmembran, men de kan være representert i blodet som peptider eller proteinfragmenter 14. Vårt mål er å måle romanen sirkulerende biomarkører som kan være kandidater for tidlig påvisning av sykdom, pasientutvelgelse for terapi, og overvåking av behandlingsrespons. Våre nanopartikler er skapt for selektivt å utelukke høy overflod immunglobuliner og albumin, med fangst av mindre proteiner og peptider og konsentrere dem opp til 100 ganger høyere, avhengig av startvolumet.
Vår gruppe identifisert et sett av små organiske fargestoffer som kan lykkes fungerer som høyaffinitet molekylære agn for proteiner og peptider. Protein-dye binding er antatt å være på grunn av en kombinasjon av hydrofobe og elektrostatisk interaksjons. De aromatiske ringer på fargestoff flette med proteiner via hydrofobe lommer på proteinflaten 11.
De agn, avhengig av deres kjemi, viser en spesiell affinitet for valgte klasser av analytter. De agn konkurrere med bærerproteiner, slik som albumin, for proteiner eller peptider. De lav-molekylvekt proteiner / peptider bli fanget i partikkelen. Høymolekylære proteiner slik som albumin og immunglobulin er forhindret fra å komme inn i partikkel på grunn av siktekapasitet på grunn av den begrensende pore av hydrogel 11 (figur 1).
Hydrogel nanopartikler er syntetisert av nedbør polymerisasjon initiert av ammoniumpersulfat 11. N-isopropylacrylamide (NIPAm), er ko-monomerer av akrylsyre (AAC) og allylamin (AA) og tverrbindingsmidlet N, N'-metylenbisakrylamid (BIS) anledning til å reagere ved 70 ° C i 6 timer i fortynnede betingelser ett1, 13. Med høy protein bindingsaffinitet av poly (N-isopropylacrylamide-ko-akrylsyre) (poly (NIPAm-co-AAC) nanoparticlesis oppnås ved kovalent å innlemme amino-inneholdende fargestoffer (f.eks. Sulfonatedanthraquinonetriazine, fargestoffer) til nanopartikler via en amideringsreaksjonen utføres i vandige eller organiske løsningsmidler, avhengig av de hydrofile / hydrofobe egenskapene til de fargestoffer 11, 13. nukleofil substitusjon av amingruppene i nanopartikkel med kloratom i et anthraquinonetriazine fargestoff er benyttet for å skape fargestoff-inneholdende poly (NIPAm -co-Allylamin) (AA) nanopartikler 11, 12. En to-trinns polymerisasjonsprosess benyttes til å lage hydrogel nanopartikler som inneholder et ytre skall av vinylsulfonic syre (VSA) 11, 13.
Hydrogel nanopartikler kan brukes til forskjellige biologiske fluider, inkludert fullblod, plasma, serum, cerebrospinalvæske, svette og urin. I ett trinn, i oppløsning, i nanoparticles utføre en hurtig (i løpet av minutter) binding og konsentrasjon av lav molekylvekt analytter 10, 11, 13, 15-18. Proteiner blir deretter eluert fra nanopartiklene og detektert ved hjelp av western-blotting 19-21, massespektrometri 10, 11, 13, 15, 18, 22, 23, immunoanalyser / ELISA 10, 11, 15, 18, eller reversfaseprotein microarray 16, 24 analyser. Nanopartikler functionalized med kjemisk agn, og presentere en kjerne eller kjerne shell arkitektur, fangst og konsentrere proteiner basert på agnet / skallet fysisk-kjemiske egenskaper. Forskjellige fargestoffer innarbeides i de nanopartikler vil derfor fange opp forskjellige undergrupper av proteiner med varierende effektivitet basert på fargestoff affinitet, pH til oppløsningen, og nærværet / fraværet av konkurrerende høy-rikt proteiner 13. Videre vil mengden av nanopartikler i forhold til volumet av oppløsningen påvirker proteinmengde fra nanopartiklene. Disse aspektenehydrogel nanopartikkel høsting blir demonstrert ved hjelp av tre forskjellige nanopartikkel agn for høsting proteiner fra plasmaprøver som inneholder store mengder protein, og fra urinprøver, som vanligvis ikke inneholder store mengder protein. I denne protokollen viser vi høsting og konsentrere tumor nekrose faktor alfa (TNF-alfa) fra plasmaprøver ved hjelp av poly (NIPAm-co-AAC), Poly (NIPAm / fargestoff), og kjerne-skallnanopartikler (Poly (NIPAm-co-VSA)) . Poly (NIPAm / fargestoff) nanopartikler er vist å konsentrere Mycobacterium arter antigen som ble lagt til menneskelig urinprøver, for å etterligne Mycobacterium tuberculosis infiserte individer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humant plasma og urin ble samlet fra friske frivillige givere, med skriftlig informert samtykke, etter George Mason University Institutional Review Board godkjente protokoller. Givere ble likt fordelt mellom kaukasiske menn og kvinner mellom 25 og 42. Prøvene ble analysert hver for seg og ble ikke slått sammen.
1. Nanoparticle Behandling av serum eller plasmaprøver
Potensielle lave rikelig biomarkører i plasma er fanget, i løsning, med hydrogel nanopartikler. Partiklene blir tilsatt til plasma, inkuberes, separert ved sentrifugering, vasket, og den fangede proteiner elueres. De eluerte proteiner ble tørket under en nitrogenstrøm for nedstrøms massespektrometri sekvensering og identifisering.
- Fortynn 500 pl av serum 1: 2 med 50 mM Tris-HCl pH 7, (500 pl serum + 500 pl Tris-HCl) i et mikrosentrifugerør.
- Legg 500 mL av poly (NIPAm / AAC) kjerne nanopartikler. Inkuber i 15 min ved RT.
- Spin prøven ved 16 100 xg, 25 ° C i 10 minutter i en sentrifuge utstyrt med en fast vinkelrotor. Fjern og kast supernatanten.
- Legg 500 mL natrium-tiocyanat (25 mM) til pelleten. Resuspender nanopartikler ved kraftig pipettering opp og ned flere ganger.
- Spin prøven ved 16 100 xg, 25 ° C i 10 minutter i en sentrifuge med en rotor med fast vinkel. Fjern og kast supernatanten.
- Tilsett 500 pl av MilliQ vann til nanopartikkel pellet. Resuspender nanopartikler ved kraftig pipettering opp og ned flere ganger.
- Spin prøven ved 16 100 xg, 25 ° C i 10 minutter i en sentrifuge med en rotor med fast vinkel. Fjern og kast supernatanten.
- Forbered frisk elueringsbuffer: Legg 700 mL acetonitril til 300 mL ammoniumhydroksyd i et rent rør. Forsiktig: Ammoniumhydroksid er etsende. Brukes med egnet ventilasjon. Merk: Elueringsbufferen må være prepared umiddelbart før bruk. Ikke oppbevar elueringsbuffer.
- Legg 300 ul elueringsbuffer til nanopartikkel pellet. Resuspender nanopartikler ved kraftig pipettering opp og ned flere ganger. Inkuber i 15 min ved RT.
- Spin prøven ved 16 100 xg, 25 ° C i 10 minutter i en sentrifuge med en rotor med fast vinkel. Ta ut og lagre eluatet i en ren, merket mikrosentrifugerør.
- Gjenta trinn 01.09 til 01.10. Kombiner de to eluater inn i et mikrosentrifugerør.
- Tørk de eluater under nitrogen i en nitrogenstrøm fordamperen manifold ved 42,1 ° C, og luftstrømmen er satt til 8 (figur 2F).
- Oppbevar tørket eluatet ved RT for O / N lagring, eller ved -20 ° C for langtidslagring, før massespektrometri, western blotting, eller ELISA-analyser (valgfritt).
2. Nanoparticle Behandling av Urinprøver
Normal urin inneholder mindre enn 30 mg / dl protein ogmindre enn 1 + blod. Men mange sykdommer / tilstander kan endre de normale nivåer av urinprotein og blod. For å hjelpe til med å bestemme den optimale volum av nanopartikler for å legge i urinprøven, er en urinanalyse utføres før nanopartikkel høsting. Urin biomarkører kan eksistere i ekstremt lave konsentrasjoner, som kan kreve optimalisering av forholdet av nanopartikler i urinvolum. Denne prosedyren beskriver nanopartikkel høsting av urinprøver for nedstrøms western blot analyse.
- Samle inn urinprøver i en ren, tørr plastkopp. En 22 ml minimumsvolum er nødvendig. Oppbevar urinprøver ved -80 ° C til den er klar til å analysere.
- Tine frossen urin ved romtemperatur eller ved 4 ° CO / N. Bland kort på en vortex mixer. Hell over i det minste 22 ml urin i et 50 ml konisk bunn polypropylenrør.
- Snurr urin i en sentrifuge med en swing-out rotor på 3700 xg i 15 min. Dekanter urin, uten å forstyrre pelleten, i en ren 50 ml konisk bunn polypropylene tube. Kast pellet.
- Utføre urinanalyse ved hjelp av en multi-analytt "urin peilepinnen" reagensstrimmelen. Merk: lagre reagens strimler i en tett lukket beholder unna direkte sollys og fuktighet 17, 18.
- Lå reagensstrimmelen, ansikt-up, på et rent, tørt tørkepapir.
- Bruk en engangspipette til å suge 1 ml av urin fremstilt i trinn 2.3.
- Sett en timer for 2 min, men ikke starte den. Raskt dispensere 1 - 2 dråper av urin på hvert testputen av reagenset stripe. Umiddelbart starter tidtakeren. Merk: Ikke senk reagensstrimmelen direkte i urinbeholderen. Fargestoffet / kjemiske indikatorer i reagensstrimmelen potensielt kan lekke ut av reagensen strimmelen inn i urinbeholderen.
- På tidspunktet vist på reagensstrimmelen beholderen, registrerer de kvalitative resultater for de forskjellige analytter i reagensstrimmelen ved å sammenligne fargen av de enkelte reagens-strimler til den tilsvarende fargekodede indicatorer på reagensbeholderen. Typiske vanlige urin resultater er: (normal eller negativ) for blod, protein, leukocytter, nitritt, glukose, keton, bilirubin, urobilinogen, og; Urin pH (5,5 til 7,0); egenvekt (1,001 til 1,020). Merk: Høy protein nivåer i en urinprøve kan konkurrere med protein av interesse for bindingssteder på nanopartikler. For å maksimere protein høsting med nanopartikler, kan de nanopartikkel volum / urinvolumforholdet justeres til enten begrense konkurransen fra proteiner overflod, eller kan bli optimalisert for å høste proteiner som finnes i svært lave konsentrasjoner. Hvis urinen protein verdi er 1 + eller høyere, legger 2x volumer av nanopartikler i trinn 2.5 nedenfor. Dersom analytten av interesse er en svært lav rikelig protein, kan det være nødvendig å øke volumet av nanopartikler opp til 2 ml (figur 3).
- Overfør 20 ml av den klarede urin fra trinn 2.3 i en ren 50 ml konisk bunn polypropylenrør. Ikkeforstyrre eventuelle rester / pellet som kan være i bunnen av urinrøret. Tilsett 200 pl av nanopartikler i 20 ml urinprøve. Bland kort på en vortex mixer. Merk: Hvis urinen protein verdi er 1 + eller høyere, tilsett 400 mL av nanopartikler til 20 ml urin.
- Inkuber urinen / nanopartikkel blandingen i 30 min ved RT, uten at gynge / blanding.
- Snurr urin / nanopartikkel suspensjon i en sentrifuge utstyrt med en swing-out rotor på 3700 xg i 10 min. Merk: Hvis en pellet er ikke synlig etter sentrifugering, spinne prøvene for en ekstra 2 - 7 min.
- Fjern og kast supernatanten. Tilsett 500 ul MilliQ vann til nanopartikkel pellet.
- Resuspender nanopartikler ved kraftig pipettering opp og ned flere ganger. Overfør nanopartikkel-løsning til et rent 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Spinn nanopartikler i en sentrifuge utstyrt med en fast vinkelrotor ved 16.100 xg i 10 min. Merk: Hvis en pellet er ikke synlig folgende sentrifugering, spinne prøvene for en ekstra 2 - 7 min.
- Fjern og kast supernatanten.
- Gjenta trinn 2.8 og 2.11 (to ganger) med 200 ul 18 MilliQ vann for å vaske de nanopartikler.
- Forbered frisk elueringsbuffer: Legg 970 mL acetonitril til 30 mL ammoniumhydroksyd i et rent rør. Forsiktig: Ammoniumhydroksid er etsende. Brukes med egnet ventilasjon. Merk: elueringsbuffer må tilberedes umiddelbart før bruk. Ikke oppbevar elueringsbuffer.
- Tilsett 20 ul elueringsbuffer til nanopartikkel pellet. Resuspender nanopartikler ved kraftig pipettering opp og ned flere ganger. Inkuber i 15 min ved RT.
- Spinn nanopartikkel prøver på 16 100 xg i 10 min. Ta ut og lagre supernatanten i en ren, 1,5 ml mikro tube. Ikke forstyrre nanopartikkel pellet. Kast pellet i biohazard søppel.
- Plasser prøvene i et rack i avtrekkskap. Åpne caps og økUbate ved RT i 30 min. Alternativt kan plassere prøvene under nitrogen ved 40 ° C til den er tørr (1 - 2 timer).
- Tilsett 15 mL Tris-glysin SDS prøvebuffer (2 x) til prøvene. Oppvarm til 100 ° C i en tørr varmeblokk i 5 minutter med lokkene åpne eller inntil volumet etterlatt i røret ikke er mer enn 20 mikroliter. Merk: Ikke bruk et kokende vannbad. Fuktigheten fra vannbadet vil forhindre fordamping av bufferen.
- Plasser lokk på rørene. Fjern rørene fra varmeblokken. Prøven kan oppbevares ved -80 ° C eller brukes umiddelbart nedstrøms for western blot analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hydrogel Nanoparticle Størrelse og Uniformity
Poly (NIPAm-AAC) Partiklene er laget med ekstremt høy yield og reproduserbarhet mellom og innen grupper. Partiklene har svært god kolloidal stabilitet ved RT i løpet av den tid som er nødvendig for opptak, lagring og eluering av proteiner (minst 48 timer), og nanopartikkel ventet har ikke blitt observert (figur 1) 11. Den kolloidale stabiliteten kan være svært viktig for rask protein / peptid opptak av nanopartikler.
Potensielle Low-overflod Biomarkører Høstet fra Plasma
Inkorporering av fargestoffet agn driver opptaket av molekyler i oppløsning, og sikrer at fangede molekyler bevares mot nedbryting 13, 15, 18, 25. Av denne grunn, er protease-inhibitorer ikke nødvendig under prøven pre-prosessering. Denne egenskap av nanopartikler gjør dem suitable som en bevaring teknologi for prøvetaking i felten og for transport av biologiske fluider ved RT.
Agnet molekyl kan bli innlemmet i hydrogelen partikkel ved kopolymerisering eller kovalent binding til funksjonelle grupper tilstede i nanopartikkel. Som et eksempel, ble poly (NIPAm-co-AAC), nanopartikler konstruert med amino-inneholdende fargestoffer via null lengde amidering tverrbindingsreaksjoner, mens nanopartikler med et ytre skall som inneholder vinylsulfonic syre (VSA) kopolymeren er laget av et andre polymerisasjonsreaksjonen 10-13. Forskjellige typer av nanopartikler kan fremstilles ved å inkorporere en annen kjemisk fargestoff i nanopartikkel og således forbedre høsting av spesifikke klasser av proteiner. Et viktig konsept av teknologien er at forskjellige agn kan vise en preferensiell affinitet for forskjellige proteiner, fordi fargestoff-protein interaksjonen er avhengig hovedsakelig av en kombinasjon av hydrofobe interaksjoner, 3-D interacsjoner, og elektrostatiske krefter. Vi har observert at enkelte analyser kan fanges med en høy affinitet ved kjemisk ulike fargestoffer på grunn av kompleksiteten av bindingskrefter. Se Tamburro et al. For en omfattende forklaring, og eksempler på dette prinsipp 13. For eksempel ble fire forskjellige typer av fangst agn (nanopartikler) som brukes til å høste TNFa fra plasma ved å bruke 200 pl av partikler og 200 pl plasma for hver type nanopartikkel. I alle tilfeller etter behandling med nanopartikler, TNFa var ikke detekterbart i supernatanten ved hjelp av SDS-PAGE med sølvfarging, mens TNFa var detekterbar i nanopartikkel eluatet (figur 1C). (Lane 1 = rekombinant TNF-alfa (MW 17.000 Da), Lanes 2 & 3, 4 og 5, 6 og 7 og 8 og 9 representerer resultater for fire forskjellige typer nanopartikkel agn henholdsvis; C = kontroll, S = supernatant, P = nanopartikkel Eluatet).
Dose-respons for Praktfull avslappende tidleie Typer N anoparticles
For å utføre en kalibreringskurve, og derved vurdere utbytte og presisjon, eksperimenter må utføres med piggete-proteiner med kjent konsentrasjon. Publiserte resultater for en rekke forskjellige kroppsvæsker og analytter demonstrere hvordan nanopartikkel-forbehandlende opprettholder lineariteten av analysen og etablerer en kalibreringskurve og samtidig forbedre den effektive deteksjonsgrense 10, 16, 26. Vi har også publisert studier av mellom-laboratoriepresisjons ved hjelp av nanopartikler til å utføre multi-reaksjon overvåking massespektrometri med forbedret sensitivitet 27.
Å sammenligne IL-17 Fangsteffektiviteten av forskjellige typer nanopartikler, ble rekombinant IL-17 (17,5 kDa) lagt til plasmaprøver som enten poly (NIPAm-co-AAC) og poly (NIPAm-co-VSA) nanopartikler ble senere lagt . To sett med fire serielle fortynninger av 100 ng av rekombinant IL-17, ble fremstilt i 10081; l plasma (100 ng / 100 mL, 50 ng / 100 mL, 25 ng / mL og 100 ng 12.5 / 100 mL). poly (NIPAm-co-AAC), eller poly (NIPAm-co-VSA) partikler ble tilsatt til de respektive plasmaprøver i et 1: 1 (volum / volum) partikkel: plasma-forhold. En spektrofotometrisk total protein-analyse ble utført på supernatantprøvene. Western blotting med anti-kanin polyklonalt IL-17 ble utført på 20 pg av plasma supernatant (S) etter nanopartikkel høsting og nanopartikkel eluater (P) (figur 4). Begge nanopartikkel typer tilstrekkelig høstet og konsentrert IL-17 på hver fortynning. De ekstra band på western blot representerer humant serumalbumin og immunoglobulin som kryssreagerer med det sekundære antistoff. (AAC partikler: Lanes 1 & 2 = 1 ng / mL IL-17, Lanes 3 & 4 = 0,50 ng / mL, Lanes 5 & 6 = 0,25 ng / mL, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / mL, Lane 9 = IL-17; VSA partikler: Søyle 1 & 2 = 1 ng / mL IL-17, Felt 3 & 4 = 0,50 ng / pl,Lanes 5 & 6 = 0,25 ng / mL, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / mL).
Gjenkjenning av potensielt Diagnostiske protein i urinen
Menneskeurinprøver, innhentet fra friske frivillige givere med skriftlig informert samtykke, ble tilsatt et rekombinant Mycobacterium arter antigen Tidlig Sekretorisk Target Mycobacterium tuberculosis protein (ESAT-6) for å etterligne Mycobacterium tuberculosis infiserte individer. 1 ug hver av ESAT-6 (15 kDa) og IL-2 (15.5 kDa) ble tilsatt til 1 ml alikvoter av human urin oppsamlet fra friske frivillige givere. Urinanalyse ble utført på prøver med urin reagensstrimmelen for å bestemme det optimale forholdet av nanopartikler til urin, som var basert på tilstedeværelse / fravær av urinproteiner. Poly (NIPAm / fargestoff) nanopartikler ble anvendt til å høste proteiner fra behandlede og ubehandlede urinprøver. En-dimensjonal elektroforese av nanopartikkel eluatene ble utført followed av sølv flekker. Prøver i U4 og U6 baner representerer nanopartikkel eluatene fra ESAT-6 og IL-2 behandlede urinprøver, som tydelig viser fremtredende band ved 15 kDa (figur 5). Massespektrometri av eluatene identifiserte ESAT-6 (Uniprot tiltredelse POA567, 84,0 dekning, 9 peptider) og IL-2 (Uniprot tiltredelse P60568, 38.56 dekning, tre peptider). Urin uten nanopartikkel høsting er vist i kjørefeltet merket "Raw".
Figur 1. Nanopartikler innhøsting og konsentrere lav overflod proteiner fra komplekse biologiske væsker. (A) Arbeidsflyt for høsting proteiner. Total behandlingstid er ca 1,5 time. Proteiner i oppløsningen er konsentrert fra blod, serum, plasma, urin, svette, spytt eller andre kroppsvæsker (1000 gangers konsentrasjon avbildet) (B).Parti til parti sammenligning viser den ensartede størrelse av nanopartikler. Atomic Force Microscopy på glimmer viser ensartet størrelse (0,7 mikrometer i diameter), og fravær av klumper i to grupper av nanopartikler. (C) 1-D-gel-elektroforese, med etterfølgende sølvfarging, av tumornekrosefaktor alfa (TNFa) isolert fra plasma. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Nanoparticle høsting prosedyren fra plasma / serum for nedstrøms massespektrometri analyse. (A) Nanopartikler forbli suspendert i løsning (Poly (NIPAm / fargestoff) vist). (B) Nanopartikler er lagt til den fortynnede plasmaprøve. (C) nanopartikkel-plasma suspensjon is spunnet i en sentrifuge for å separere de nanopartikler fra supernatanten. (D) Post sentrifugering, nanopartikler danner en distinkt pellet i bunnen av røret. (E) Etter vasking av nanopartikler, blir eluatet inneholdende de høstede proteiner fjernet og lagret . for genetisk analyse (F) Eluatet er tørket med nitrogen i en fordamper ved 42,1 ° C, luftstrøm 8, for 1 -. 2 timer før massespektrometri Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Urinanalyse ved hjelp av multi-analyse reagent strips for prøve kvalitetskontroll. (A) Hver blokk på reagensstrimmelen er impregnert med kjemikalier, enzymer, og / eller indikatorfargestoffer som reagerer med en forskjelligent urin analytt (f.eks., glukose, bilirubin, keton, spesifikk vekt, blod, pH, protein, urobilinogen, nitritt og / eller leukocytt-esterase). Urin er avklart ved sentrifugering. En dråpe urin blir lagt til hver pad på reagensstrimmelen. (B) Fargen på hver pad sammenlignes visuelt til de fargeblokkene på container, på det angitte tidspunktet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Høsting IL-17 fra plasma ved hjelp av kjerne (AAC) og kjerne-skall (VSA) nanopartikler. 1-D-gel-elektroforese og Western blotting med anti-IL-17 demonstrerer evnen av akrylsyre (AAC) og VSA kjerne skallnanopartikler for å høste ulike concentrations av IL-17 fra plasma. (S = supernatant etter nanopartikkel høsting, P = nanopartikkel eluatet AAC partikler:. Lanes 1 & 2 = 1 ng / mL IL-17, Lanes 3 & 4 = 0,50 ng / mL, Lanes 5 & 6 = 0.25ng / mikroliter, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / mL, Lane 9 = IL-17; VSA partikler: Lanes 1 & 2 = 1 ng / mL IL-17, Lanes 3 & 4 = 0,50 ng / mL, Lanes 5 & 6 = 0,25 ng / pl, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / mL) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Gjenoppretting av Mycobacterium tuberculosis antigen og cytokin IL-2 fra urin ved hjelp av hydrogel nanopartikler. Sølvfarging etter 1-D gel elektroforese av urinprøver. Prøver i baner U4 og U6 representerer eluatene fra urinprøver som inneholder rekombinant ESAT-6 og IL-2, som tydelig viser fremtredende band ved 15 kDa. Massespektrometri av eluatene identifiserte ESAT-6 (Uniprot tiltredelse POA567, 84,0 dekning, 9 peptider) og IL-2 (Uniprot tiltredelse P60568, 38.56 dekning, tre peptider). (RAW = urin uten nanopartikkel høsting, U1, U2, U3, U5, U7, U8 = urin mangler rekombinant ESAT-6 og IL-2 følgende nanopartikkel høsting). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Protein navn | GI protein nummer | Konsentrasjon i serum / plasma [ng / ml] | Reference |
| ABL-Interactor en isoform en | 61743942 | Ukjent | |
| AMP-aktivert protein kinase gamma2 subenheten isoform en | 33186925 | Ukjent | |
| Cas-Br-M (murine) ecotropic retroviral transformerende sekvens | 52426745 | Ukjent | |
| chemokine (CC motiv) ligand 18 (lunge og aktivisering-regulert) | 4506831 | 30 | 34 |
| chemokine (CC motiv) ligand 5 | 22538814 | 1.5 | 31 |
| chondroadherin | 153251229 | Ukjent | |
| kromosom 16 åpen leseramme 80 | 8392875 | Ukjent | |
| Consortin | 213021160 | Ukjent | |
| defensin, alpha 4, corticostatin | 4503303 | Ukjent | |
| 20149675 | Ukjent | ||
| glykoprotein Ib (trombocytter), beta polypeptid | 4504073 | Ukjent | |
| guanin nukleotid-bindende proteiner (G-proteiner), q polypeptid | 40254462 | Ukjent | |
| Heparanase | 148746204 | Ukjent | |
| insulin-lignende vekstfaktor 2 (somatomedin A) | 189083846 | 115px; "> 10030 | |
| lacritin | 15187164 | Ukjent | |
| leukocytt celle-avledet chemotaxin 2 | 59806345 | 200.000 | 33 |
| lipokalin 2 (onkogen 24p3) | 38455402 | 0,05 | 28 |
| Monoglyserid lipase, isoform CRA_b | 6005786 | Ukjent | |
| N-etylmaleimid-sensitive faktor vedlegg protein, alphen | 47933379 | Ukjent | |
| ett kutt homeobox 2 | 119220564 | Ukjent | |
| ytre tett fiber av sperm haler 4 | 171184433 | Ukjent | |
| gane, lunge og neseepitel forbundet | 18765705 | Ukjent | |
| peptidoglycan anerkjennelse protein 2 | 156616294 | Ukjent | |
| 77695917 | 4 | 29 | |
| Protein CASC3 | 15721939 | Ukjent | |
| RAB27B, medlems RAS okogenet familie | 5729997 | Ukjent | |
| Ras Association (RalGDS / AF-6) domenefamilie 6 isoform en | 29789443 | Ukjent | |
| ras-relaterte GTP-bindende protein RAB10 | 33695095 Ukjent | ||
| ring finger protein 166 | 30520320 | Ukjent | |
| serum deprivasjon respons (phosphatidylserine bindende protein) | 4759082 | Ukjent | |
| oppløst stoff carrier familie 33 (acetyl-CoA transporter), medlem 1 | 4757708 | Ukjent | |
| ST6 beta-galactosamide alpha-2,6-sialyltranferase en isoform en | 27765091 | 15 | 32 |
| thymosin-lignende tre | 34013530 | Ukjent | |
| transducin lignende enhancer av split 3 (E (sp135) homolog, Drosophila) | 157384982 | Ukjent | |
| transglutaminase 1 | 4507475 | Ukjent | |
| WD gjenta domene 1 | 9257257 | Ukjent | |
| WD gjenta domene 91 | 222080092 | px; "> Unknown||
| xin aktin-bindende gjenta inneholder 2 | 119372317 | Ukjent |
Tabell 1. Eksempel lav overflod proteiner høstes av nanopartikler fra serum / plasma. (PeptideAtlas peptidome massespektrometri) 28-34 Tilpasset med permissionfrom referanse 13 (Tamburro, D. et al Multi-funksjonell kjerne-skall nanopartikler:... Oppdagelsen av tidligere usynlige biomarkører J Am Chem Soc, 133, 19178-19188, (2011 ).) Copyright 2011 American Chemical Society.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Klinisk relevans
Et serum-eller plasma-prøven er tenkt å inneholde lave overflod sirkulerende proteiner og peptider som kan gi en rik kilde for informasjon vedrørende tilstanden til organismen som helhet. Til tross for løftet om serum proteomikk, er det tre grunnleggende og alvorlige fysiologiske barrierer og hemmer biomarkører og oversettelse til klinisk nytte 10, 11, 16, 25.
1. Viktige diagnostiske biomarkører kan eksistere i ekstremt lav mengde (konsentrasjon) i blod. Tidlig stadium sykt vev, slik som pre-metastatisk kreft lesjoner, kan utgjøre mindre enn noen få mm 3. Biomarkører skur inn i sirkulasjon fra en så liten vevvolum vil bli sterkt fortynnet i hele blodvolumet. Relevante analytter kan eksistere under påvisningsgrensene for massespektrometri og konvensjonelle immunoassays.
2. Lave overflod biomarkører /proteiner er maskert av tilstedeværelse av høye rikelig proteiner slik som albumin og immunglobulin, som representerer opptil 90% av plasma proteom- 14.
3. Proteiner og peptider er utsatt for nedbrytning av endogene og eksogene proteinases etter venepunksjon og sample transport / lagring. Protein degradering kan føre til falske positive eller falske negative resultater 35.
Hydrogel nanopartikler ble utviklet som porøse, spenstig, polymerer som inneholder anthraquinonetriazine fargestoffer og / eller vinylsulfonic syre skall for protein og peptid høsting og bevaring i kroppsvæsker 11, 13. Vår gruppe syntetisert og testet hydrogel nanopartikler functionalized med en mengde av organiske fargestoffer (ie. , sulfonert og ikke-sulfonatedanthraquinonetriazine fargestoffer) og viste fortrinnsrett slektskap til flere protein analytter 11, 13. vi også etablert protokoller for biomarkører som brukerhydrogel nanopartikler med lymfe, spytt, cerebrospinalvæske, svette, urin, plasma, blod eller serumprøver 11, 13, 23, 24, 26.
Optimalisere nanoparticle høsting parametrene før høsting proteiner fra dyre klinisk / forskningsprøver er nødvendig for ideelle resultater. Mengden av protein i prøvene bør kvantifisert for å bestemme det optimale forhold av nanopartikler i prøvevolum. For analytter med ukjent konsentrasjon, en dose-respons-kurve ved hjelp av rekombinante proteiner gir informasjon om grensene for deteksjon. Hvis det er tilstrekkelig prøven, kan forskjellige typer av nanopartikler brukes til å bestemme den ideelle nanopartikkel for analytten og prøven.
Urinalysis før nanopartikkel høsting gir en urinprøve kvalitetskontroll. Affiniteten av det nanopartikkel fargestoff agn avhenger av det isoelektriske punkt for proteinet av interesse, og pH av det omgivende medium. Urin pH væretween 5.5 og 7.0 er optimal for protein fangst med poly (NIPAm / fargestoff) nanopartikler. Tilstedeværelsen av hemolyserte eller intakte røde blodlegemer (1 + blod på reagensstrimmelen) ikke forstyrrer nanopartikkel høsting.
I denne protokollen har vi fokusert på anvendelsen av hydrogel nanopartikler å høste proteiner fra plasma og urin. Fremtidige anvendelser kan omfatte andre kroppsvæsker slik som glasslegemet i øyet, eller leddvæske. Potensial in vivo-applikasjoner kan så for seg for fremtiden der nanopartikler som injiseres i sykt vev for å samle biomolekyler. Fremtidig arbeid vil også bli fokusert på utvikling av nye enheter for fangst og bevaring av biomarkører, for eksempel en nanopartikkel-baserte hud patch for analyse av huden transudate proteomet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Michael Henry, Dublin City University, ber vi bistått med datainnsamling og analyse vist i figur 5. Dette arbeidet ble delvis støttet av (1) George Mason University, (2) den italienske IstitutoSuperiore di Sanita 'i rammen av Italia / USA samarbeidsavtale mellom US Department of Health and Human Services, George Mason University, og den italienske Ministry of Public Health, (3) NIH, IMAT programmet gir 1R21CA137706-01 og 1R33CA173359-01 til LAL, og (4) Ceres Nanosciences, Inc .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
| 18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
| Tris HCl, 50 mM pH 7.0 | VWR | IC816116 | 50 mM, pH 7 |
| Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | Available from VWR |
| Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | Available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
| Sodium thiocyanate 25 mM | Acros Organics | 419675000 | For serum/plasma samples |
| Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | For urine samples |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | Use at RT to prevent SDS from precipitating |
| Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | Do not substitute a boiling water bath |
| Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | For serum/plasma samples |
| Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50 ml tube capacity, rcf 3,700 x g |
| Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7 ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | With screw caps for urine samples |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
| Timer | Fisher Scientific | S04782 | Seconds/minutes |
References
- Aebersold, R., Mann, M.
- Gerszten, R. E., et al. Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).
- Merrell, K., et al. Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry. J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).
- Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery. Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).
- Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood. Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).
- Geho, D., et al. Fractionation of serum components using nanoporous substrates. Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).
- Sennels, L., et al. Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads. J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer. J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).
- Marshall, J., et al. Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction. J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).
- Fredolini, C., et al. Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles. Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).
- Luchini, A., et al. Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation. Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).
- Patanarut, A., et al. Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).
- Tamburro, D., et al. Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers. J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).
- Anderson, N. L., Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
- Fredolini, C., et al. Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH. Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).
- Longo, C., et al. Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers. PLoS One. 4 (3), e4763 (2009).
- Luchini, A., et al. Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).
- Luchini, A., et al. Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals. J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).
- Eslami, A., Lujan, J., Western, blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Penna, A., Cahalan, M., , Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (7), 264 (2007).
- Bosch, J., et al. Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results. J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).
- Fredolini, C., et al. Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology. AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).
- Longo, C., et al. A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum. Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).
- Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F. 3rd, Liotta, L. A. Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).
- Douglas, T. A., et al. The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease. Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).
- Prakash, A., et al. Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies. J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).
- Choi, K. M., et al. Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease. Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).
- Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle. Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).
- Izycki, T., et al. Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy. Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).
- Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis. Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).
- Kitazume, S., et al. Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo. Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).
- Saito, T., et al. Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).
- Struyf, S., et al. PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia. Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).
- Michael, I. P., et al. Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression. J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).
