Abstract
Nieuwe biomarker discovery speelt een cruciale rol in het leveren van meer gevoelige en specifieke ziekten opsporen. Er is nog veel low-abundantie biomarkers die bestaan in biologische vloeistoffen niet gemakkelijk worden gedetecteerd met massaspectrometrie of immunoassays omdat ze in zeer lage concentratie, zijn labiel en vaak gemaskeerd door high-abundantie proteïnen zoals albumine en immunoglobuline. Aas die poly (N-isopropylacrylamide) (NIPAm) op basis van nanodeeltjes in staat zijn om deze fysiologische barrières te overwinnen. In een stap zij kunnen vangen, concentreren en bewaren biomarkers van lichaamsvloeistoffen. Laag moleculair gewicht analyten Voer de kern van de nanodeeltjes en weergegeven door verschillende organische chemische kleurstoffen, die fungeren als hoge affiniteit eiwitlokaas. De nanodeeltjes kunnen de eiwitten van belang te concentreren door verscheidene orden van grootte. Deze concentratie factor voldoende is om het eiwit te verhogen zodanig dat de eiwitten in dedetectielimiet van huidige massaspectrometers, western blotting en immunoassays. Nanodeeltjes kunnen worden geïncubeerd met een overvloed aan biologische vloeistoffen en zij kunnen sterk verrijken de concentratie van laagmoleculaire eiwitten en peptiden met uitsluiting albumine en andere hoogmoleculaire eiwitten. Onze gegevens tonen aan dat een 10.000-voudige amplificatie in de concentratie van een analyt kan worden bereikt, zodat massaspectrometrie en immunoassays eerder detecteerbare merkers opgespoord.
Introduction
Ondanks de voltooiing van het menselijk genoom, heeft aanzienlijke vooruitgang niet is gemaakt in het identificeren van biomarkers voorspellend vroeg stadium van de ziekte, of die correleren met therapeutisch resultaat, of prognose 1. Een reden voor dit gebrek aan vooruitgang is dat veel potentieel belangrijke biomarkers bestaan in een concentratie onder de detectiegrens van conventionele massaspectrometrie en andere biomarkers platforms. Massaspectrometrie (MS) en Multiple Reaction Monitoring (MRM) een detectiegevoeligheid typisch groter dan 50 ng / ml terwijl de meerderheid van de analyten gemeten immunoassays in een klinisch laboratorium daling in het traject van 50 pg / ml en 10 ng / ml . Dit betekent dat veel biomarkers, vooral in het vroege stadium van een ziekte niet kan worden gedetecteerd door conventionele MS en MRM 2. Ook de aanwezigheid van hoge-abundantie proteïnen zoals albumine en immunoglobuline in complexe biologische vloeistoffen vaak masker miljard maal excess lage abundantie laagmoleculaire eiwitten en peptiden 3, 4. daarom verschillende monsters voorbereidende stappen zijn voor massaspectrometrie sequentiebepaling en identificatie vereist. Een dergelijke voorbereidende stap gebruikt de uitputting van high-abundantie proteïnen in de handel verkrijgbare uitputting kolommen 5-8. Helaas deze stap leidt tot vermindering van de opbrengst aan kandidaat biomarkers omdat zij vaak niet-covalent geassocieerd met dragereiwitten die worden verwijderd. Een ander probleem wordt vertegenwoordigd door de stabiliteit van kandidaat biomerkers ex-vivo wanneer de monsters worden genomen. Eiwitten zijn onderhevig aan afbraak door endogene of exogene proteasen 9. Hydrogel nanodeeltjes kunnen deze kritische problemen overstijgen door het amplificeren van het vermoedelijke biomarker concentratie een niveau binnen het bereik van de assay, en beschermt het eiwit degradatie 10-13.
Het is belangrijk om ste merkenbij LMW eiwitten in bloed een mengsel van kleine intacte eiwitten en fragmenten van grote eiwitten. Weefsel afgeleide eiwitten groter dan 60 kDa te groot passief in de bloedstroom door het vasculaire basale membraan, maar ze kunnen in bloed peptiden of eiwitfragmenten 14 vertegenwoordigd. Ons doel is om nieuwe circulerende biomarkers die kandidaat zijn voor de vroegtijdige opsporing van de ziekte, de patiënt stratificatie voor therapie, en het bewaken van de respons op de therapie kan meten. Onze nanodeeltjes zijn gemaakt om selectief te sluiten hoge overvloed immunoglobulinen en albumine, terwijl tegelijkertijd het vastleggen van kleinere eiwitten en peptiden en concentreren ze tot 100 keer, afhankelijk van het uitgangspunt volume.
De fractie leverde een set kleine organische kleurstoffen die met succes kan fungeren als hoge affiniteit voor moleculaire lokaas eiwitten en peptiden. Eiwit-dye binding is waarschijnlijk te wijten aan een combinatie van hydrofobe interacties en elektrostatisches. De aromatische ringen op de kleurstof interleave met eiwitten via hydrofobe zakken op het eiwit oppervlak 11.
De lokmiddelen, afhankelijk van hun chemie, tonen een bijzondere affiniteit voor bepaalde klassen van analyten. De lokmiddelen concurreren met de dragereiwitten, zoals albumine, voor de eiwitten of peptiden. De laagmoleculaire eiwitten / peptiden worden gevangen in het deeltje. Hoogmoleculaire eiwitten zoals albumine en immunoglobuline verhinderd het deeltje door het zeven vermogen vanwege de restrictieve poriën van de hydrogel 11 (figuur 1).
Hydrogel nanodeeltjes worden gesynthetiseerd door precipitatie polymerisatie geïnitieerd door ammoniumpersulfaat 11. N-isopropylacrylamide (NIPAm), zijn co-monomeren van acrylzuur (AAc) en allylamine (AA) en vernetter N, N'-methyleenbisacrylamide (BIS) liet reageren bij 70 ° C gedurende 6 uur in verdunde omstandigheden 11, 13. Eiwitrijke bindingsaffiniteit van poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylzuur) (poly (NIPAm-co-AAc) nanoparticlesis bereikt door covalent integratie-amino bevattende kleurstoffen (dwz., Sulfonatedanthraquinonetriazine kleurstoffen) in de nanodeeltjes door een amideringsreactie uitgevoerd in waterige of organische oplosmiddelen, afhankelijk van de hydrofiele / hydrofobe eigenschappen van de kleurstoffen 11, 13. Nucleofiele substitutie van de aminegroepen in de nanodeeltjes met het chlooratoom van een anthraquinonetriazine kleurstof wordt gebruikt om kleurstof bevattende poly (NIPAm creëren -co- allylamine) (AA) nanodeeltjes 11, 12. een tweestaps polymerisatiewerkwijze wordt gebruikt om hydrogel nanodeeltjes die de buitenzijde van vinylsulfonzuur (VSA) 11, 13 te creëren.
Hydrogel nanodeeltjes kan op verschillende biologische vloeistoffen, zoals volbloed, plasma, serum, cerebrospinale vloeistof, zweet en urine. In een stap, in oplossing, de nanoparticles voeren een snelle (binnen minuten) sekwestratie en concentratie van laagmoleculaire analyten 10, 11, 13, 15-18. Eiwitten worden vervolgens geëlueerd van de nanodeeltjes en gedetecteerd met Western blotting 19-21, massaspectrometrie 10, 11, 13, 15, 18, 22, 23, immunoassays / ELISA 10, 11, 15, 18, of omgekeerde fase eiwit microarray 16, 24 assays. Nanodeeltjes gefunctionaliseerde met chemische aas, en het presenteren van een kern of kern shell architectuur, afvang en concentreer proteïnen, op basis van het aas / shell fysisch-chemische eigenschappen. Verschillende kleurstoffen opgenomen in de nanodeeltjes ook verschillende subsets van eiwitten vastleggen met verschillende efficiëntie op basis van de kleurstof affiniteit, pH van de oplossing en de aanwezigheid / afwezigheid van concurrerende high-overvloedige eiwitten 13. Bovendien zal de hoeveelheid nanodeeltjes in verband met het volume van de oplossing het eiwit opbrengst van de nanodeeltjes beïnvloeden. Deze aspecten vanhydrogel nanodeeltjes oogsten worden gedemonstreerd met behulp van drie verschillende nanodeeltjes aas voor het oogsten eiwitten uit plasma monsters die grote hoeveelheden van eiwit en urine monsters die doorgaans geen grote hoeveelheden eiwit. In dit protocol tonen we oogsten en concentreren tumornecrosefactor alfa (TNFa) van plasmamonsters met poly (NIPAm-co-AAc), Poly (NIPAm / kleurstof) en kern-shell nanodeeltjes (Poly (NIPAm-co-VSA)) . Poly (NIPAm / kleurstof) nanodeeltjes worden aangetoond dat Mycobacterium species antigeen die werd toegevoegd aan de menselijke urine monsters, concentreren om na te bootsen Mycobacterium tuberculosis geïnfecteerde individuen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menselijk plasma en urine werd verzameld van gezonde vrijwillige donoren, met schriftelijke informed consent, na George Mason University Institutional Review Board goedgekeurde protocollen. Donoren werden gelijk verdeeld tussen blanke mannen en vrouwen tussen de leeftijden van 25 en 42 monsters werden afzonderlijk geanalyseerd en werden niet samengevoegd.
1 Nanoparticle Verwerking van Serum of plasma
Potentiële laag overvloedige biomerkers in plasma worden gevangen, in oplossing, met hydrogel nanodeeltjes. De deeltjes worden toegevoegd aan het plasma, geïncubeerd, afgescheiden door centrifugeren, gewassen, en de gevangen eiwitten geëlueerd. De geëlueerde eiwitten werden gedroogd onder een stikstofstroom voor downstream massaspectrometrie sequentiebepaling en identificatie.
- Verdun 500 pi serum 1: 2 met 50 mM Tris-HCl pH 7 (500 pi serum + 500 pl Tris-HCl) in een microcentrifugebuis.
- Voeg 500 ul van poly (NIPAm / AAC) kern nanopartikelen. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Draai het monster bij 16.100 xg, 25 ° C gedurende 10 minuten in een centrifuge met vaste hoek rotor. Verwijder de bovenstaande vloeistof.
- Voeg 500 ul natriumthiocyanaat (25 mM) aan de pellet. Resuspendeer de nanodeeltjes door krachtig pipetteren en neer meerdere keren.
- Draai het monster bij 16.100 xg, 25 ° C gedurende 10 minuten in een centrifuge met vaste hoek rotor. Verwijder de bovenstaande vloeistof.
- Voeg 500 ul van MilliQ water om de nanodeeltjes pellet. Resuspendeer de nanodeeltjes door krachtig pipetteren en neer meerdere keren.
- Draai het monster bij 16.100 xg, 25 ° C gedurende 10 minuten in een centrifuge met vaste hoek rotor. Verwijder de bovenstaande vloeistof.
- Bereid vers elutiebuffer Voeg 700 ul acetonitril 300 gl ammoniumhydroxide in een schone buis. Let op: Ammoniumhydroxide is corrosief. Gebruik met geschikte ventilatie. Opmerking: De elutie buffer moet prep zijnared direct voor gebruik. Laat de elutie buffer opslaan.
- Voeg 300 ul elutiebuffer de nanodeeltjes pellet. Resuspendeer de nanodeeltjes door krachtig pipetteren en neer meerdere keren. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Draai het monster bij 16.100 xg, 25 ° C gedurende 10 minuten in een centrifuge met vaste hoek rotor. Verwijder en bewaar het eluaat op in een schone, gelabeld microcentrifugebuisje.
- Herhaal de stappen 1,9-1,10. Combineer twee eluaten in een microcentrifugebuis.
- Droog de eluaten onder een stikstofstroom in een stikstof verdamper verdeelstuk bij 42,1 ° C, met luchtstroom ingesteld op 8 (figuur 2F).
- Bewaar de gedroogde eluaat bij KT O / N opslag of bij -20 ° C voor lange termijn opslag, voorafgaand aan massaspectrometrie, western blotting of ELISA assays (optioneel).
2 Nanoparticle Verwerking van Urinemonsters
Normale urine bevat minder dan 30 mg / dl eiwit enminder dan 1 + bloed. Veel ziekten / aandoeningen kan de normale niveaus van urine-eiwit en bloed veranderen. Om te helpen bij het bepalen van de optimale hoeveelheid nanodeeltjes te voegen aan het urinemonster wordt urineonderzoek voor nanodeeltjes oogsten uitgevoerd. Urine biomarkers kunnen in zeer lage concentraties die aanleiding kunnen optimale verhouding nanodeeltjes urinevolume. Deze procedure beschrijft nanodeeltjes verzamelen van urine monsters voor downstream western blot analyse.
- Verzamel urine in een schone, droge plastic beker. Een 22 ml minimaal volume gewenst. Bewaren urine monsters bij -80 ° C tot klaar om te analyseren.
- Ontdooi de bevroren urine bij kamertemperatuur of bij 4 ° CO / N. Meng kort op een vortex mixer. Giet minstens 22 ml urine in een 50 ml conische bodem polypropyleen buis.
- Spin de urine in een centrifuge met een swing-out rotor bij 3700 xg gedurende 15 minuten. Schenk de urine, zonder de pellet te verstoren, in een schone 50 ml conische bodem polypropeenopylene buis. Gooi de pellet.
- Uitvoeren urineonderzoek behulp van een multi-analyt "urinepeilstok" reagens strip. Let op: bewaar de reagens strips in een goed gesloten verpakking uit de buurt van direct zonlicht en vocht 17, 18.
- Leg de reagens strip, face-up, op een schone, droge tissue.
- Gebruik een wegwerp pipet 1 ml van de volgens stap 2.3 urine zuigen.
- Stel een timer voor 2 min, maar niet starten. Snel afzien 1-2 druppels urine op elke test pad van het reagens strip. Onmiddellijk start de timer. Opmerking: Het reagens strip niet direct onderdompelen in de urine container. De kleurstof / chemische indicatoren in de reagens strip kan mogelijk uit de reagens strip lekken in de urine container.
- Ten tijde van de reagens strip houder aangegeven, nemen de kwalitatieve resultaten voor de verschillende analyten de reagens strip door vergelijking van de kleur van de afzonderlijke reagens strips de overeenkomstige gekleurde indicaren op het reagensreservoir. Typische normale urine resultaten zijn: (normaal of negatief) voor bloed, eiwit, leukocyten, nitriet, glucose, ketonen, bilirubine, en urobilinogeen; Urine pH (5,5-7,0); soortelijk gewicht (1,001-1,020). Opmerking: Hoge eiwitgehalten in een urinemonster kan concurreren met het eiwit van interesse voor bindingsplaatsen op de nanodeeltjes. Om eiwit oogsten met nanodeeltjes maximaliseren, kunnen de nanodeeltjes volume / volume-verhouding urine worden aangepast om ofwel grens concurrentie van de abundantie proteïnen, of kan worden geoptimaliseerd om eiwitten die bestaan in zeer lage concentraties oogsten. Als de urine eiwit waarde is 1 + of hoger, voeg 2x volumes van nanodeeltjes in stap 2.5. Als de analyt van belang een laag overvloedige eiwitten, kan het nodig zijn om het volume van nanodeeltjes te verhogen tot 2 ml (figuur 3).
- Breng 20 ml van de geklaarde urine uit stap 2.3 in een schone 50 ml conische bodem polypropyleen buis. Nietstoren vuil / pellet die mogelijk in de bodem van de urinebuis. Voeg 200 ul van nanodeeltjes aan de 20 ml urine monster. Meng kort op een vortex mixer. Opmerking: Als de urine eiwit waarde is 1 + of hoger, voeg 400 ul van nanodeeltjes tot 20 ml urine.
- Incubeer de urine / nanodeeltjes mengsel gedurende 30 min bij kamertemperatuur, zonder schokken / mixing.
- Spin de urine / nanodeeltjes suspensie in een centrifuge uitgerust met een swing-out rotor bij 3700 xg gedurende 10 minuten. Opmerking: Als de pellet niet zichtbaar na centrifugatie, draaien de monsters voor nog eens 2-7 minuten.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof. Voeg 500 ul MilliQ water de nanodeeltjes pellet.
- Resuspendeer de nanodeeltjes door krachtig pipetteren en neer meerdere keren. Breng de oplossing nanodeeltjes een schone 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Spin de nanodeeltjes in een centrifuge met vaste hoek rotor bij 16.100 xg gedurende 10 minuten. Opmerking: Als een pellet is niet zichtbaar folgende centrifugatie, draaien de monsters voor nog eens 2-7 minuten.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof.
- Herhaal stap 2.8 en 2.11 (tweemaal) met 200 ul 18 MilliQ water om de nanodeeltjes te wassen.
- Bereid vers elutiebuffer Voeg 970 ul acetonitril 30 gl ammoniumhydroxide in een schone buis. Let op: Ammoniumhydroxide is corrosief. Gebruik met geschikte ventilatie. Opmerking: De elutie buffer moet onmiddellijk voor het gebruik worden bereid. Laat de elutie buffer opslaan.
- Voeg 20 ul elutiebuffer de nanodeeltjes pellet. Resuspendeer de nanodeeltjes door krachtig pipetteren en neer meerdere keren. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Draai het nanodeeltje monsters bij 16.100 xg gedurende 10 minuten. Verwijder en bewaar het supernatant in een schone 1,5 ml microcentrifugebuis. Niet verstoren de nanodeeltjes pellet. Gooi de pellet in het biologisch afval.
- Plaats de monsters in een rek in een zuurkast. Haal de doppen en meerderUbate bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Alternatief plaats de monsters onder een stikstofstroom bij 40 ° C te drogen (1 - 2 uur).
- Voeg 15 pl Tris-glycine SDS monsterbuffer (2x) de monsters. Heat 100 ° C in een droge verwarmingsblok gedurende 5 min met de doppen geopend of totdat de hoeveelheid nog in de buis niet meer dan 20 pl. Let op: niet een bad met kokend water niet te gebruiken. De vochtigheid van het waterbad wordt verdamping van de buffer te voorkomen.
- Plaats de dop op de buizen. Haal de buizen uit het verwarmingsblok. Het monster kan bij -80 ° C bewaard of onmiddellijk voor downstream western blot analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hydrogel Nanoparticle Maat en Uniformiteit
Poly (NIPAm-AAC) deeltjes zijn geproduceerd met zeer hoge opbrengst en reproduceerbaarheid tussen en binnen partijen. De deeltjes hebben zeer goede colloïdale stabiliteit bij kamertemperatuur gedurende de tijd die nodig is voor het vastleggen, opslaan, en elutie van eiwitten (tenminste 48 uur), en nanodeeltjes neerslag is niet waargenomen (figuur 1) 11. De colloïdale stabiliteit kan zeer belangrijk zijn voor snelle eiwit / peptide opname door de nanodeeltjes.
Potentiële Low-overvloed Biomarkers geoogst van Plasma
De opname van de kleurstof aas drijft de opname van moleculen in oplossing en verzekert dat gevangen moleculen bewaard afbraak 13, 15, 18, 25. Daarom zijn proteaseremmers niet tijdens monstervoorbehandeling verwerking nodig. Dit kenmerk van de nanodeeltjes maakt ze seschikt als conservering technologie voor monstername in het veld en voor het transport van biologische vloeistoffen bij RT.
De aas molecuul kan in de hydrogel deeltje door copolymerisatie of covalente binding aan functionele groepen in het nanodeeltje worden opgenomen. Als voorbeeld werden poly (NIPAm-co-AAc) nanodeeltjes uitgevoerd met amino bevattende kleurstoffen via nullengte verknoping amideringsreacties, terwijl nanodeeltjes met een buitenste mantel die vinylsulfonzuur (VSA) copolymeer zijn gemaakt door een tweede polymerisatiereactie 10-13. Verschillende soorten nanodeeltjes kunnen worden geproduceerd door het opnemen van een andere chemische kleurstof in de nanodeeltjes en vergroot dus kap van specifieke klassen van eiwitten. Een belangrijk concept van onze technologie is dat verschillende lokazen een preferentiële affiniteit voor verschillende eiwitten kunnen geven omdat de interactie kleurstof-eiwit voornamelijk afhangt van een combinatie van hydrofobe interacties, 3-D interacties, en elektrostatische krachten. We hebben waargenomen dat sommige analyten kunnen worden vastgelegd met een hoge affiniteit van chemisch verschillende kleurstoffen vanwege de complexiteit van de bindende krachten. Zie Tamburro ea. Voor een uitgebreide uitleg en voorbeelden van dit principe 13. Zo werden vier verschillende capture aas (nanodeeltjes) gebruikt te oogsten TNFa uit plasma met 200 gl deeltjes en 200 gl plasma voor elk type nanodeeltjes. In alle gevallen na behandeling met de nanopartikels, TNFa was niet detecteerbaar in de supernatant door SDS-PAGE met zilverkleuring, terwijl TNFa was detecteerbaar in de nanodeeltjes eluaat (figuur 1C). (Lane 1 = recombinant TNFa (MW 17.000 Da), Banen 2 en 3, 4 en 5, 6 en 7 en 8 en 9 geven de resultaten van vier verschillende soorten nanodeeltjes aas respectievelijk C = controle, S = supernatant, P = nanodeeltjes eluaat).
Dosis-respons voor Diffehuur Soorten N anoparticles
Om een ijkkromme te voeren en aldus evalueren opbrengst en precisie moeten experimenten worden uitgevoerd met spiked in eiwitten van bekende concentratie. Gepubliceerde resultaten voor verschillende lichaamsvloeistoffen en analyten tonen hoe de nanodeeltjes voorverwerking houdt lineariteit van de test en wordt een kalibratiecurve gelijktijdige verbetering van de effectieve detectiegrens 10, 16, 26. We hebben ook gepubliceerde studies tussen-precisie het gebruik van de nanodeeltjes om multi-reactie uit te voeren monitoring van massaspectrometrie met verbeterde gevoeligheid 27.
Voor IL-17 oogstefficiëntie vergelijken door verschillende soorten nanodeeltjes, recombinant IL-17 (17.5 kDa) werd toegevoegd aan plasma monsters die hetzij poly (NIPAm-co-AAc) of poly (NIPAm-co-VSA) nanodeeltjes werden vervolgens toegevoegd . Twee sets van vier seriële verdunningen van 100 ng van recombinant IL-17 werden bereid in 10081, l plasma (100 ng / 100 ul, 50 ng / 100 ul, 25 ng / ul 100 en 12,5 ng / 100 ul). poly (NIPAm-co-AAc) of poly (NIPAm-co-VSA) deeltjes werden toegevoegd aan de respectievelijke plasmamonsters in een 1: 1 (v / v) deeltjes: plasmaratio. Een spectrofotometrische totaal eiwit assay werd uitgevoerd op het supernatant monsters. Western blotting met anti-konijnen polyklonaal IL-17 werd uitgevoerd op 20 ug plasma supernatans (S) na het oogsten nanodeeltjes en nanodeeltjes eluaten (P) (figuur 4). Beide types nanodeeltjes voldoende geoogst en geconcentreerd IL-17 bij elke verdunning. De aanvullende banden op Western blot vertegenwoordigt humaan serum albumine en immunoglobuline die kruisreageren met het secundaire antilichaam. (AAc deeltjes: Lanen 1 & 2 = 1 ng / ul IL-17, lanen 3 & 4 = 0,50 ng / ul, Lanes 5 & 6 = 0,25 ng / ul, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / ul, Lane 9 = IL-17, VSA deeltjes: Lanen 1 & 2 = 1 ng / ul IL-17, lanen 3 & 4 = 0,50 ng / ul,Lanen 5 & 6 = 0,25 ng / ul, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / ul).
Detectie van mogelijk Diagnostic Eiwitten in de urine
Menselijke urine monsters, afkomstig van gezonde vrijwillige donoren met schriftelijke informed consent, werden verrijkt met een recombinant Mycobacterium species antigeen Vroege Secretory Doel Mycobacterium Tuberculosis eiwit (ESAT-6) na te bootsen Mycobacterium tuberculosis geïnfecteerde individuen. 1 ug elk van ESAT-6 (15 kDa) en IL-2 (15,5 kDa) werden toegevoegd aan 1 ml aliquots van menselijke urine verzameld uit gezonde vrijwillige donoren. Urine werd uitgevoerd op de monsters met een urine reagens strip de optimale verhouding van nanodeeltjes urine, gebaseerd op de aanwezigheid / afwezigheid van urine-eiwitten bepalen. Poly (NIPAm / kleurstof) nanopartikels werden gebruikt om eiwitten uit behandelde en onbehandelde urinemonsters oogsten. Eendimensionale gelelektroforese van de nanodeeltjes eluaten werd uitgevoerd followed door zilverkleuring. Monsters U4 en U6 lanen vertegenwoordigen nanodeeltjes eluaten van ESAT-6 en IL-2 behandelde urine, waarop duidelijk zichtbare banden bij 15 kDa (Figuur 5). Massa spectrometrie van de eluaten geïdentificeerde ESAT-6 (UniProt toetreding POA567, 84,0 dekking, 9 peptiden) en IL-2 (UniProt toetreding P60568, 38,56 dekking, 3 peptiden). Urine zonder nanodeeltjes oogsten weergegeven in de baan label "raw".
Figuur 1 Nanodeeltjes oogst en concentreren geringe hoeveelheden eiwitten uit complexe biologische vloeistoffen. (A) Workflow voor het oogsten van eiwitten. Totale doorlooptijd is ongeveer 1,5 uur. Eiwitten in oplossing geconcentreerd uit bloed, serum, plasma, urine, zweet, speeksel of andere lichaamsvloeistoffen (1000-voudige concentratie afgebeeld). (B)Charges een vergelijking met de uniforme grootte van nanodeeltjes. Atomic Force Microscopy op mica toont homogene grootte (0,7 urn diameter) en afwezigheid van klonteren in twee batches van nanodeeltjes. (C) 1-D gel elektroforese, gevolgd zilverkleuring van Tumor Necrose Factor alfa (TNFa) afgezonderd uit plasma. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 Nanodeeltje oogstprocedure van plasma / serum voor downstream massaspectrometrie. (A) Nanodeeltjes blijven gesuspendeerd in oplossing (Poly (NIPAm / kleurstof) weergegeven). (B) Nanodeeltjes worden toegevoegd aan het verdunde plasma monster. (C) The nanodeeltjes-plasma schorsing is afgedraaid in een centrifuge om de nanodeeltjes te scheiden van het supernatant. (D) Voeg centrifugeren, de nanodeeltjes vormen een afzonderlijke pellet op de bodem van de buis. (E) Na wassen van de nanodeeltjes wordt eluaat geoogste eiwitten verwijderd en bewaard . voor downstream-analyse (F) Het eluaat wordt gedroogd onder een stikstofstroom in een verdamper bij 42,1 ° C, luchtstroom 8, voor 1 -. 2 uur voorafgaand aan massaspectrometrie Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3 Urineonderzoek met behulp van multi-analyt reagens strips voor specimen kwaliteitscontrole. (A) Elk pad op de reagens strip is geïmpregneerd met chemicaliën, enzymen en / of indicator kleurstoffen die reageren met een verschillendent urine analyt (bijvoorbeeld., glucose, bilirubine, ketonen, soortelijk gewicht, bloed, pH, eiwit, urobilinogeen, nitriet en / of leukocyten esterase). Urine wordt geklaard door centrifugatie. Een druppel urine wordt toegevoegd aan elke pad op de reagens strip. (B) De kleur van elke pad wordt visueel om de kleur blokken op de container vergelijking, op de opgegeven tijd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Oogsten IL-17 uit het plasma met behulp van kern (AAC) of core-shell (VSA) nanodeeltjes. 1-D gel elektroforese en Western blotting met anti-IL-17 toont het vermogen van acrylzuur (AAc) en VSA kern shell nanodeeltjes tot verschillende conce oogstenntrations van IL-17 uit plasma. (S = supernatant na nanodeeltje oogsten, P = nanodeeltjes eluaat AAc deeltjes:. Lanen 1 & 2 = 1 ng / ul IL-17, Lanes 3 & 4 = 0,50 ng / ul, Lanes 5 & 6 = 0.25ng / ul, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / ul, Laan 9 = IL-17, VSA deeltjes: Lanen 1 & 2 = 1 ng / ul IL-17, lanen 3 & 4 = 0,50 ng / ul, Lanes 5 & 6 = 0,25 ng / pl, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / ul) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Herstel van Mycobacterium tuberculosis antigen en cytokine IL-2 uit urine met behulp van hydrogel nanodeeltjes. Silver kleuring na 1-D gel elektroforese van urinemonsters. Monsters in lanen U4 en U6 vertegenwoordigen eluaten van urinemonsters die recombinant ESAT-6 en IL-2, waarop duidelijk zichtbare banden bij 15 kDa. Massa spectrometrie van de eluaten geïdentificeerde ESAT-6 (UniProt toetreding POA567, 84,0 dekking, 9 peptiden) en IL-2 (UniProt toetreding P60568, 38,56 dekking, 3 peptiden). (RAW = urine zonder nanodeeltjes oogsten, U1, U2, U3, U5, U7, U8 = urine ontbreekt recombinant ESAT-6 en IL-2 volgende nanodeeltjes oogsten). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Eiwit naam | GI eiwit nummer | Concentratie in het serum / plasma [ng / ml] | Referentie |
| ABL-interactor 1 isovorm een | 61743942 | Onbekend | |
| AMP-activated protein kinase gamma2 subunit isoform a | 33186925 | Onbekend | |
| Cas-Br-M (murine) ecotropische retrovirale sequentie transformeren | 52426745 | Onbekend | |
| chemokine (CC motief) ligand 18 (pulmonale en activatie-gereguleerde) | 4506831 | 30 | 34 |
| chemokine (CC motief) ligand 5 | 22538814 | 1.5 | 31 |
| chondroadherin | 153251229 | Onbekend | |
| chromosoom 16 open reading frame 80 | 8392875 | Onbekend | |
| Consortin | 213021160 | Onbekend | |
| defensin, alpha 4, cortistatine | 4503303 | Onbekend | |
| 20149675 | Onbekend | ||
| glycoproteïne Ib (bloedplaatjes), beta polypeptide | 4504073 | Onbekend | |
| guanine nucleotide bindend eiwit (G eiwit), q polypeptide | 40254462 | Onbekend | |
| Heparanase | 148746204 | Onbekend | |
| insuline-achtige groeifactor 2 (somatomedine A) | 189083846 | 115px; "> 10030 | |
| lacritin | 15187164 | Onbekend | |
| leukocyten cel afkomstige chemotaxine 2 | 59806345 | 200.000 | 33 |
| lipocalin 2 (oncogen 24p3) | 38455402 | 0.05 | 28 |
| Monoglyceride lipase, isovorm CRA_b | 6005786 | Onbekend | |
| N-ethylmaleimide-gevoelige factor attachment eiwit, alpheen | 47933379 | Onbekend | |
| een gesneden homeobox 2 | 119220564 | Onbekend | |
| buitenste dichte vezelstructuur sperma staarten 4 | 171184433 | Onbekend | |
| mond, longen en nasale epitheel geassocieerd | 18765705 | Onbekend | |
| peptidoglycaan erkenning eiwit 2 | 156616294 | Onbekend | |
| 77695917 | 4 | 29 | |
| Eiwit CASC3 | 15721939 | Onbekend | |
| Rab27B, lid RAS oncogen familie | 5729997 | Onbekend | |
| Ras vereniging (RalGDS / AF-6) domein familie 6 isovorm een | 29789443 | Onbekend | |
| ras-gerelateerde GTP-bindend eiwit RAB10 | 33695095 Onbekend | ||
| ringvinger eiwit 166 | 30520320 | Onbekend | |
| serumdeprivatie respons (fosfatidylserine bindend eiwit) | 4759082 | Onbekend | |
| opgeloste stof drager familie 33 (acetyl-CoA transporter), lid 1 | 4757708 | Onbekend | |
| ST6 beta-galactosamide alfa-2,6-sialyltransferase 1 isoform a | 27765091 | 15 | 32 |
| thymosine-achtige 3 | 34013530 | Onbekend | |
| transducine-achtige versterker van split 3 (E (SP135) homoloog, Drosophila) | 157384982 | Onbekend | |
| transglutaminase 1 | 4507475 | Onbekend | |
| WD herhaling domeinnaam 1 | 9257257 | Onbekend | |
| WD herhaling domeinnaam 91 | 222080092 | px; "> Onbekend||
| xin actine-bindende repeat bevattende 2 | 119372317 | Onbekend |
Tabel 1 Voorbeeld laag overvloed eiwitten geoogst door nanodeeltjes van serum / plasma. (PeptideAtlas peptidoom massaspectrometrie) 28-34 Aangepast met permissionfrom referentie 13 (Tamburro, D. et al Multi-functionele core-shell nanodeeltjes:... Ontdekking van voorheen onzichtbare biomarkers J Am Soc, 133, 19178-19188, (2011 ).) Copyright 2011 American Chemical Society.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Klinische relevantie
Een serum of plasma monster wordt gedacht lage abundantie circulerende eiwitten en peptiden die een rijke bron van informatie over de toestand van het gehele organisme kan bieden bevatten. Ondanks de belofte van serum proteomics, zijn er drie fundamentele en ernstige fysiologische barrières tegenwerken van de ontdekking van biomarkers en vertalen naar klinisch voordeel 10, 11, 16, 25.
1 Belangrijke diagnostische biomarkers kunnen bestaan in een extreem lage-overvloed (concentratie) in het bloed. Vroeg stadium ziek weefsel, zoals pre-uitgezaaide kanker laesies, kan minder dan een paar mm 3 vormen. Biomarkers afgestoten in de circulatie van dergelijke kleine tissue volume raken sterk verdund in het gehele bloedvolume. Relevante analyten kunnen bestaan onder de detectielimieten van massaspectrometrie en conventionele immunoassays.
2 Lage overvloed biomarkers /eiwitten worden gemaskeerd door de aanwezigheid van hoge overvloedige proteïnen zoals albumine en immunoglobuline, die tot vertegenwoordigen 90% van de plasma proteoom 14.
3 eiwitten en peptiden zijn gevoelig voor afbraak door endogene en exogene proteinases volgende venapunctie en sample transport / opslag. Eiwit afbraak kan leiden tot vals positieve en vals negatieve resultaten 35.
Hydrogel nanodeeltjes ontwikkeld als poreus, drijfvermogen, polymeren die anthraquinonetriazine kleurstoffen en / of vinylsulfonzuur shells voor eiwit en peptide oogsten en bewaren in lichaamsvloeistoffen 11, 13. Onze groep gesynthetiseerd hydrogel nanodeeltjes gefunctionaliseerd met een overvloed aan organische kleurstoffen (bijvoorbeeld getest. , gesulfoneerde en niet-sulfonatedanthraquinonetriazine kleurstoffen) en toonde de preferentiële affiniteit voor diverse eiwit analyten 11, 13. We hebben ook vastgestelde protocollen voor de ontdekking van biomarkers die gebruikthydrogel nanodeeltjes met lymfe, speeksel, cerebrospinale vloeistof, zweet, urine, plasma, bloed of serum exemplaren 11, 13, 23, 24, 26.
Het optimaliseren van de nanodeeltjes oogsten parameters voor het oogsten eiwitten uit kostbare klinische / onderzoek monsters is noodzakelijk voor ideale resultaten. De hoeveelheid eiwit in het monster wordt gekwantificeerd optimale verhouding van nanodeeltjes monstervolume te bepalen. Voor analyten van onbekende concentratie, een dosis-response curve met behulp van recombinante eiwitten bevat informatie over de detectielimieten. Als er voldoende monster kunnen verschillende soorten nanodeeltjes worden gebruikt om de ideale nanodeeltjes voor de analyt monster bepalen.
Urineonderzoek voorafgaand aan nanodeeltjes oogsten biedt een urinemonster kwaliteitscontrole. De affiniteit van de kleurstof nanodeeltjes aas afhankelijk van het iso-elektrische punt van het proteïne van interesse en de pH van het omringende medium. Urine pHtussen 5,5 en 7,0 is optimaal voor het eiwit oogsten met de poly (NIPAm / kleurstof) nanodeeltjes. De aanwezigheid van gehemolyseerde of intacte rode bloedcellen (1 + bloed op de reagens strip) niet interfereert met nanodeeltjes oogsten.
In dit protocol hebben we ons gericht op de toepassing van de hydrogel nanodeeltjes eiwitten uit plasma en urine oogsten. Toekomstige toepassingen kunnen andere lichaamsvloeistoffen zoals glasvocht van het oog, of synoviale vloeistof omvatten. Mogelijke in vivo toepassingen kunnen worden beoogd voor de toekomst waarin nanodeeltjes worden geïnjecteerd in zieke weefsels biomoleculen verzamelen. Toekomstige werkzaamheden zal ook worden gericht op de ontwikkeling van nieuwe apparaten voor de vangst en het behoud van biomarkers, zoals een nanodeeltjes gebaseerde pleister voor de analyse van de huid transsudaat proteoom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Michael Henry, Dublin City University, vriendelijk geholpen met het verzamelen en analyseren van gegevens weergegeven in figuur 5. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door (1) George Mason University, (2) de Italiaanse IstitutoSuperiore di Sanita 'in het kader van het Italië / VS samenwerkingsovereenkomst tussen het Amerikaanse ministerie van Volksgezondheid en Human Services, George Mason University, en het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid, (3) NIH, IMAT programma subsidies 1R21CA137706-01 en 1R33CA173359-01 naar LAL, en (4) Ceres nanowetenschappen, Inc .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
| 18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
| Tris HCl, 50 mM pH 7.0 | VWR | IC816116 | 50 mM, pH 7 |
| Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | Available from VWR |
| Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | Available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
| Sodium thiocyanate 25 mM | Acros Organics | 419675000 | For serum/plasma samples |
| Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | For urine samples |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | Use at RT to prevent SDS from precipitating |
| Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | Do not substitute a boiling water bath |
| Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | For serum/plasma samples |
| Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50 ml tube capacity, rcf 3,700 x g |
| Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7 ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | With screw caps for urine samples |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
| Timer | Fisher Scientific | S04782 | Seconds/minutes |
References
- Aebersold, R., Mann, M.
- Gerszten, R. E., et al. Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).
- Merrell, K., et al. Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry. J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).
- Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery. Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).
- Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood. Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).
- Geho, D., et al. Fractionation of serum components using nanoporous substrates. Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).
- Sennels, L., et al. Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads. J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer. J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).
- Marshall, J., et al. Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction. J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).
- Fredolini, C., et al. Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles. Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).
- Luchini, A., et al. Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation. Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).
- Patanarut, A., et al. Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).
- Tamburro, D., et al. Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers. J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).
- Anderson, N. L., Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
- Fredolini, C., et al. Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH. Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).
- Longo, C., et al. Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers. PLoS One. 4 (3), e4763 (2009).
- Luchini, A., et al. Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).
- Luchini, A., et al. Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals. J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).
- Eslami, A., Lujan, J., Western, blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Penna, A., Cahalan, M., , Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (7), 264 (2007).
- Bosch, J., et al. Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results. J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).
- Fredolini, C., et al. Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology. AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).
- Longo, C., et al. A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum. Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).
- Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F. 3rd, Liotta, L. A. Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).
- Douglas, T. A., et al. The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease. Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).
- Prakash, A., et al. Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies. J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).
- Choi, K. M., et al. Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease. Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).
- Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle. Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).
- Izycki, T., et al. Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy. Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).
- Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis. Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).
- Kitazume, S., et al. Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo. Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).
- Saito, T., et al. Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).
- Struyf, S., et al. PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia. Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).
- Michael, I. P., et al. Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression. J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).
