Abstract
Roman biomarkør opdagelse spiller en afgørende rolle i at yde mere følsom og specifik påvisning sygdom. Desværre er mange med lav hyppighed biomarkører, der findes i biologiske væsker kan ikke let afsløres med massespektrometri eller immunassays, fordi de er til stede i meget lav koncentration, er labil, og er ofte maskeret af høj overflod proteiner, såsom albumin eller immunglobulin. Bait indeholdende poly (N-isopropylacrylamid) (NIPAM) baseret nanopartikler er i stand til at overvinde disse fysiologiske barrierer. I et skridt, de er i stand til at indfange, koncentrere sig og bevare biomarkører fra kropsvæsker. Lavmolekylære analytter indtaste kernen af nanopartikel og opfanges af forskellige organiske kemiske farvestoffer, der fungerer som høj affinitetsprotein lokkemad. De nanopartikler er i stand til at koncentrere proteiner af interesse ved flere størrelsesordener. Denne koncentration faktor er tilstrækkelig til at forøge protein-niveau, således at proteinerne er inden fordetektionsgrænse nuværende massespektrometre, Western blotting og immunoassays. Nanopartikler kan inkuberes med et væld af biologiske væsker, og de er i stand til i høj grad berige koncentrationen af lavmolekylære proteiner og peptider med udelukkelse af albumin og andre højmolekylære proteiner. Vore data viser, at en 10.000 gange amplifikation i koncentrationen af en bestemt analyt kan opnås, så massespektrometri og immunassays til påvisning af hidtil upåviselige biomarkører.
Introduction
På trods af gennemførelsen af det menneskelige genom sekventering, er ikke blevet gjort betydelige fremskridt med at indkredse biomarkører prædiktive af sygdommens tidlige stadium, eller at korrelere med terapeutisk udfald, eller prognose 1. En af grundene til denne mangel på fremskridt er, at mange potentielt vigtige biomarkører findes i en koncentration under grænsen for konventionelle massespektrometri og andre biomarkører platforme afsløring. Massespektrometri (MS) og Multiple Reaction overvågning (MRM) har en følsomhed typisk større end 50 ng / ml, mens størstedelen af de analytter måles ved immunoassays i et klinisk laboratorium fald i området mellem 50 pg / ml og 10 ng / ml . Det betyder, at mange biomarkører, især i den tidlige fase af en sygdom, der ikke kan påvises ved konventionel MS og MRM 2. Desuden tilstedeværelsen af høj overflod proteiner, såsom albumin og immunoglobulin i komplekse biologiske væsker ofte maske med milliard-fold excess lav forekomst, lavmolekylære proteiner og peptider 3, 4. Af denne grund er påkrævet med flere prøver forberedende skridt forud for massespektrometri sekventering og identifikation. En sådan forberedende skridt beskæftiger udtømning af høj overflod proteiner med kommercielt tilgængelige udtynding kolonner 5-8. Desværre er dette trin fører til reduktion af udbyttet af kandidat biomarkører fordi de ofte er ikke-covalent forbundet med bærerproteiner, der bliver fjernet. En anden udfordring er repræsenteret ved stabiliteten af kandidat biomarkører ex vivo, når prøverne er indsamlet. Proteiner er udsat for nedbrydning af endogene eller exogene proteaser 9. Hydrogel nanopartikler kan transcendere disse kritiske udfordringer ved at forstærke den formodede biomarkør koncentrationen til et niveau inden for området af analysen samtidig beskytte proteinet mod nedbrydning 10-13.
Det er vigtigt at bemærke, thpå LMW proteiner i blodet er en blanding af små intakte proteiner samt fragmenter af store proteiner. Væv-afledte proteiner er større end 60 kDa, er for store til passivt ind i blodet gennem det vaskulære basalmembran, men de kan være repræsenteret i blod som peptider eller proteinfragmenter 14. Vores mål er at måle nye cirkulerende biomarkører, der kan være kandidater til tidlig påvisning af sygdom, patient lagdeling til terapi, og monitorering af respons på behandlingen. Vores nanopartikler er skabt til selektivt at udelukke høj overflod immunoglobuliner og albumin, samtidig med at opfange små proteiner og peptider og koncentrere dem op til 100 gange afhængig af volumen start.
Vores gruppe identificeret et sæt af små organiske farvestoffer, der med succes kan virke som høj affinitet molekylære lokkemad for proteiner og peptider. Protein-dye binding menes at skyldes en kombination af hydrofob og elektrostatisk interaktionsek. De aromatiske ringe på farvestoffet interleave med proteiner via hydrofobe lommer på proteinet overflade 11.
Lokkemaden, afhængig af deres kemi, udviser en særlig affinitet for udvalgte klasser af analytter. Lokkemaden konkurrere med bærerproteiner, såsom albumin, for proteiner eller peptider. De lavmolekylære proteiner / peptider blive fanget i partiklen. Højmolekylære proteiner, såsom albumin og immunoglobulin forhindres partiklen grund af sigtning kapacitet på grund af den restriktive pore i hydrogelen 11 (figur 1).
Hydrogel nanopartikler syntetiseres ved udfældning polymerisation initieret af ammoniumpersulfat 11. N-isopropylacrylamid (NIPAM) er co-monomerer af acrylsyre (AAC) og allylamin (AA) og tværbindingsmiddel N, N'-Methylenebisacrylamide (BIS) lov at reagere ved 70 ° C i 6 timer i fortyndede betingelser 11, 13. Den høje proteinbinding affinitet af poly (N isopropylacrylamid-co-acrylsyre) (poly (NIPAM-CO-AAC) nanoparticlesis opnås ved kovalent at inkorporere aminoholdige farvestoffer (dvs.., Sulfonatedanthraquinonetriazine farvestoffer) i nanopartikler gennem en amideringsreaktion udføres i vandige eller organiske opløsningsmidler, afhængigt af hydrofile / hydrofobe egenskaber for farvestofferne 11, 13. nukleofil substitution af amingrupperne i nanopartikel med chlorid atom af en anthraquinonetriazine farvestof udnyttes til at skabe farvestof-holdige poly (NIPAM co-Allylamin) (AA) nanopartikler 11, 12. En to-trins polymerisation proces udnyttes til at skabe hydrogel nanopartikler indeholdende et yderstof af vinylsulfonsyre (VSA) 11 13.
Hydrogel nanopartikler kan anvendes til forskellige biologiske væsker, herunder fuldblod, plasma, serum, cerebrospinalvæske, sved og urin. I et skridt, i opløsning, nanoparticles udføre en hurtig (inden for minutter) beslaglæggelse og koncentration af lavmolekylære analytter 10, 11, 13, 15-18. Proteiner elueres derefter fra nanopartikler og detekteres under anvendelse af western blotting 19-21, massespektrometri 10, 11, 13, 15, 18, 22, 23, immunassays / ELISA 10, 11, 15, 18, eller omvendt fase-protein microarray 16 24 assays. Nanopartikler funktionaliseret med kemisk agn, og præsentere en kerne eller kerne shell arkitektur, opsamling og koncentrere proteiner baseret på agn / shell fysisk-kemiske egenskaber. Forskellige farvestoffer inkorporeres i nanopartiklerne vil derfor fange forskellige undersæt af proteiner med varierende effektivitet baseret på farvestoffet affinitet, pH af opløsningen, og tilstedeværelse / fravær af konkurrerende høje rigelige proteiner 13. Endvidere vil mængden af nanopartikler i forhold til mængden af opløsningen påvirker proteinudbytte fra nanopartikler. Disse aspekter afhydrogel nanopartikel høst er påvist ved hjælp af tre forskellige nanopartikler lokkemidler til høst proteiner fra plasma prøver, der indeholder store mængder af protein og fra urinprøver, som typisk ikke indeholder store mængder protein. I denne protokol vi demonstrere høst og koncentrere tumornekrosefaktor-alpha (TNFa) fra plasmaprøver under anvendelse af poly (NIPAM-co-AAC), poly (NIPAM / farvestof) og kerne- shell nanopartikler (poly (NIPAM-co-VSA)) . Poly (NIPAM / farvestof) nanopartikler er vist til at koncentrere Mycobacterium arter antigen, der blev føjet til humane urinprøver, at efterligne Mycobacterium tuberculosis inficerede individer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humant plasma og urin blev opsamlet fra raske frivillige donorer, med skriftligt informeret samtykke, efter George Mason University Institutional Review Board godkendte protokoller. Donorerne blev ligeligt fordelt mellem hvide mænd og kvinder i alderen mellem 25 og 42. Prøver blev analyseret enkeltvis og blev ikke medtaget.
1. Nanopartikel Forarbejdning af serum eller plasma prøver
Potentielle lave rigelige biomarkører i plasma fanget i opløsning med hydrogel nanopartikler. Partiklerne tilsættes til plasma inkuberes separeret ved centrifugering, vasket og de indfangede proteiner elueres. De eluerede proteiner tørres under nitrogen flow for nedstrøms massespektrometri sekventering og identifikation.
- Fortyndes 500 pi serum 1: 2 med 50 mM Tris HCI pH 7 (500 ul serum + 500 pi Tris-HCI) i et mikrocentrifugerør.
- Tilsæt 500 ul af poly (NIPAM / AAC) kerne nanopartikler. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Spin prøven ved 16.100 xg, 25 ° C i 10 min i en centrifuge udstyret med en rotor med fast vinkel. Fjern og kassér supernatanten.
- Tilsæt 500 pi natriumthiocyanat (25 mM) til pelleten. Resuspender nanopartikler ved kraftig pipettering op og ned flere gange.
- Spin prøven ved 16.100 xg, 25 ° C i 10 minutter i en centrifuge med en fast vinkel rotor. Fjern og kassér supernatanten.
- Tilsæt 500 pi MilliQ vand til nanopartikel pellet. Resuspender nanopartikler ved kraftig pipettering op og ned flere gange.
- Spin prøven ved 16.100 xg, 25 ° C i 10 minutter i en centrifuge med en fast vinkelrotor. Fjern og kassér supernatanten.
- Forbered frisk elueringspuffer: Add 700 ul acetonitril til 300 pi ammoniumhydroxid i et rent rør. Forsigtig: Ammoniumhydroxid er ætsende. Bruges med passende ventilation. Bemærk: Elueringsbufferen skal være prepARED umiddelbart før brug. Opbevar ikke elueringsbufferen.
- Der tilsættes 300 pi elueringspuffer til nanopartikel pellet. Resuspender nanopartikler ved kraftig pipettering op og ned flere gange. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Spin prøven ved 16.100 xg, 25 ° C i 10 minutter i en centrifuge med en fast vinkelrotor. Fjern og gem eluatet i en ren, mærket mikrocentrifugerør.
- Gentag trin 1,9-1,10. Kombiner de to eluaterne i en mikrocentrifugerør.
- Tør eluaterne under nitrogenstrøm i en nitrogen fordamper manifold ved 42,1 ° C med luftstrømning sættes til 8 (figur 2F).
- Opbevar tørrede eluat ved stuetemperatur i O / N-lagring, eller ved -20 ° C til langtidsopbevaring, før massespektrometri, western blotting eller ELISA-assays (valgfrit).
2. Nanopartikel Behandling af urinprøver
Normal urin indeholder mindre end 30 mg / dl protein ogmindre end 1+ blod. Men mange sygdomme / tilstande kan ændre normale niveauer af urinprotein og blod. At hjælpe med at afgøre den optimale mængde af nanopartikler til at føje til urinprøven, er en urinanalyse udføres før nanopartikel høst. Urin biomarkører kan eksistere i ekstremt lave koncentrationer, hvilket kan kræve optimering af forholdet mellem nanopartikler urinvolumen. Denne procedure beskriver nanopartikel høst af urinprøver for downstream-western blot analyse.
- Indsaml urinprøver i en ren, tør plast cup. En 22 ml minimalt volumen er påkrævet. Opbevar urinprøver ved -80 ° C indtil den er klar til at analysere.
- Optø frosne urin ved stuetemperatur eller ved 4 ° CO / N. Bland kort på en vortex-blander. Hæld mindst 22 ml urin i en 50 ml konisk bund polypropylenrør.
- Spin urinen i en centrifuge med en swing-out rotor ved 3.700 xg i 15 min. Dekanteres urinen, uden at forstyrre pellet i en ren 50 ml konisk bund korrosion ogopylene rør. Kassér pelleten.
- Udfør urinanalyse ved hjælp af en multi-analyt "urin oliepinden" reagensstrimmel. Bemærk: gemme reagensstrimlerne i en tæt lukket beholder, væk fra direkte sollys og fugtighed 17, 18.
- Læg reagensstrimlen, forsiden opad, på en ren, tør papirserviet.
- Brug en engangspipette at aspirere 1 ml af urin fremstillet i trin 2.3.
- Indstil en timer til 2 min, men ikke starte den. Hurtigt dispensere 1 - 2 dråber urin på hver testpuden reagensstrimlen. Umiddelbart starte timeren. Bemærk: Du må ikke nedsænkes reagensstrimlen direkte i urinen beholder. De farvestof / kemiske indikatorer i reagensstrimlen potentielt kan udvaskes af reagensstrimlen i urinen beholder.
- På det tidspunkt, på reagensstrimlen beholder, optage de kvalitative resultater for de forskellige analytter på reagensstrimmel ved at sammenligne farven af de individuelle reagensstrimler til den tilsvarende farvekodede indicatorer på reagensbeholderen. Typiske normale urin resultater er: (normal eller negativ) for blod, protein, leukocytter, nitrit, glukose, keton, bilirubin og urobilinogen; Urin-pH (5,5-7,0); vægtfylde (1,001-1,020). Bemærk: Høj proteinniveauer i en urinprøve kan konkurrere med proteinet af interesse for binding sites på nanopartikler. For at maksimere protein høst med nanopartikler kan nanopartikel volumen / urin volumen-forholdet indstilles til enten begrænser konkurrencen fra høje overflod proteiner eller kan optimeres til at høste proteiner, der findes i meget lave koncentrationer. Hvis urinprotein værdi er 1+ eller større, tilføje 2x mængder af nanopartikler i trin 2.5 nedenfor. Hvis analytten af interesse er et meget lavt rigelige protein, kan det være nødvendigt at øge mængden af nanopartikler op til 2 ml (figur 3).
- 20 ml af den klarede urin fra trin 2.3 i en ren 50 ml konisk bund polypropylenrør. Gør ikkeforstyrre eventuelle rester / pellet, der kan være i bunden af urinrøret. Tilsæt 200 pi af nanopartikler til 20 ml urinprøve. Bland kort på en vortex-blander. Bemærk: Hvis urinprotein værdi er 1+ eller større, tilsættes 400 ul af nanopartikler til 20 ml urin.
- Inkubér urinen / nanopartikel blandingen i 30 minutter ved stuetemperatur, uden at rokke / blanding.
- Spin urinen / nanopartikel suspension i en centrifuge udstyret med en swing-out rotor ved 3.700 xg i 10 minutter. Bemærk: Hvis en pille er ikke synlige efter centrifugering, spinde prøverne i yderligere 2 - 7 min.
- Fjern og kassér supernatanten. Tilsæt 500 pi milliQ vand til nanopartikel pellet.
- Resuspender nanopartikler ved kraftig pipettering op og ned flere gange. Overfør nanopartikel opløsningen til et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Spin nanopartiklerne i en centrifuge udstyret med en fast vinkel rotor ved 16.100 xg i 10 minutter. Bemærk: Hvis en pille ikke er synlig folgende centrifugering, spinde prøverne i yderligere 2 - 7 min.
- Fjern og kassér supernatanten.
- Gentag trin 2,8 og 2,11 (to gange) med 200 ul 18 MilliQ vand til at vaske nanopartiklerne.
- Forbered frisk elueringspuffer: Add 970 ul acetonitril til 30 pi ammoniumhydroxid i et rent rør. Forsigtig: Ammoniumhydroxid er ætsende. Bruges med passende ventilation. Bemærk: Elueringsbufferen skal fremstilles umiddelbart før brug. Opbevar ikke elueringsbufferen.
- Tilsæt 20 gl elueringspuffer til nanopartikel pellet. Resuspender nanopartikler ved kraftig pipettering op og ned flere gange. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Spin nanopartikel prøver ved 16.100 xg i 10 minutter. Fjern og gem supernatanten i et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør. Må ikke forstyrre nanopartikel pellet. Kassér pillen i biologisk farligt affald.
- Anbring prøverne i et rack i et stinkskab. Åbn hætter og tagubate ved stuetemperatur i 30 minutter. Alternativt placeres prøverne under nitrogenstrøm ved 40 ° C, indtil tør (1 - 2 timer).
- Der tilsættes 15 pi Tris-glycin SDS-prøvebuffer (2x) til prøverne. Opvarm til 100 ° C i en varmeblok i 5 minutter med hætter åbne eller indtil volumen tilbage i røret ikke er mere end 20 ul. Bemærk: Brug ikke et kogende vandbad. Fugtigheden fra vandbadet vil forhindre fordampning af bufferen.
- Placer hætten på rørene. Fjern rørene fra varmeblokken. Prøven kan opbevares ved -80 ° C eller anvendes straks til nedstrøms western blot analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hydrogel Nanopartikel Størrelse og Ensartethed
Poly (NIPAM-AAC) partikler er blevet fremstillet med ekstremt højt udbytte og reproducerbarhed mellem og inden partier. Partiklerne har meget god kolloid stabilitet ved RT i løbet af den tid, der kræves for registrering, lagring, og eluering af proteiner (mindst 48 timer), og nanopartikel nedbør er ikke blevet observeret (figur 1) 11. Den kolloide stabilitet kan være meget vigtigt for hurtig protein / peptid optagelse af nanopartiklerne.
Potentielle lav overflod Biomarkører høstet fra plasma
Indlemmelsen af farvestoffet agn driver optagelse af molekyler i opløsning, og sikrer, at tilfangetagne molekyler er bevaret fra nedbrydning 13, 15, 18, 25. Af denne grund er proteasehæmmere ikke nødvendig under prøve pre-behandling. Denne attribut af nanopartiklerne gør dem suitable som en bevarelse teknologi til prøvetagning i marken og til forsendelse af biologiske væsker ved stuetemperatur.
Lokkemaden molekyle kan inkorporeres i hydrogelen partikel ved copolymerisation eller kovalent binding til funktionelle grupper til stede i nanopartikel. Som et eksempel blev poly (NIPAM-co-AAC) nanopartikler konstrueret med aminosyrer indeholdende farvestoffer via nul længde tværbinding amideringsreaktioner, mens nanopartikler med en ydre skal indeholdende vinylsulfonsyre (VSA) copolymer blev skabt af en anden polymeriseringsreaktion 10-13. Forskellige typer af nanopartikler kan fremstilles ved inkorporering af en anden kemisk farvestof i nanopartikel og derved forbedre høst af specifikke klasser af proteiner. Et vigtigt begreb i vores teknologi er, at forskellige lokkemad kan vise et primært affinitet for forskellige proteiner, fordi interaktionen farvestof-protein er afhængig primært på en kombination af hydrofobe interaktioner, 3-D Interactioner, og elektrostatiske kræfter. Vi har observeret, at visse analytter kan fanges med en høj affinitet ved kemisk forskellige farvestoffer på grund af kompleksiteten af de bindende kræfter. Se Tamburro et al. En omfattende forklaring og eksempler på dette princip 13. For eksempel blev fire forskellige typer af indfangning agn (nanopartikler), der anvendes til at høste TNFa fra plasma under anvendelse af 200 pi af partikler og 200 pi plasma for hver type nanopartikel. I alle tilfælde efter behandling med nanopartiklerne, TNFa ikke var påviselig i supernatanten ved SDS-PAGE med sølvfarvning, mens TNFa var påviselig i nanopartikel eluatet (figur 1C). (Bane 1 = rekombinant TNFa (MW 17.000 Da), bane 2 & 3, 4 & 5, 6 og 7 og 8 og 9 repræsenterer resultater for fire forskellige typer af nanopartikler lokkemad henholdsvis: C = kontrol, S = supernatanten, P = nanopartikel eluat).
Dosis-respons for hoteleje Typer af N anoparticles
For at udføre en kalibreringskurve, og dermed for at vurdere udbyttet og præcision, skal udføres med spidse-proteiner med kendt koncentration eksperimenter. Offentliggjorte resultater for en række af kroppens væsker og analytter demonstrere hvordan nanopartikel forbehandling fastholder linearitet af analysen og etablerer en kalibreringskurve samtidig øge den effektive detektionsgrænsen 10, 16, 26. Vi har også udgivet undersøgelser af mellem laboratorier præcision ved hjælp af nanopartikler til at foretage flere reaktion overvågning massespektrometri med forøget følsomhed 27.
At sammenligne IL-17-høsteffektivitet af forskellige typer af nanopartikler blev rekombinant IL-17 (17,5 kDa) blev tilsat til plasma prøver, som enten poly (NIPAM-co-AAC) eller poly (NIPAM-co-VSA) nanopartikler blev derefter tilsat . To sæt af fire serielle fortyndinger af 100 ng rekombinant IL-17 blev fremstillet i 10081; l plasma (100 ng / 100 ul, 50 ng / 100 ul, 25 ng / 100 ul og 12,5 ng / 100 ul). poly (NIPAM-co-AAC) eller poly (NIPAM-co-VSA) partikler blev tilsat til de respektive plasmaprøver i et 1: 1 (v / v) partikel: plasma-ratio. En spektrofotometrisk totalt protein assay blev udført på supernatantprøverne. Western-blotting med anti-kanin-polyklonalt IL-17 blev udført på 20 ug af plasma-supernatant (S) efter nanopartikel høst og nanopartikler eluaterne (P) (Figur 4). Begge nanopartikler typer tilstrækkeligt høstet og koncentreret IL-17 ved hver fortynding. De yderligere bånd på western blot repræsenterer humant serumalbumin og immunglobulin, der krydsreagerer med det sekundære antistof. (AAC partikler: bane 1 & 2 = 1 ng / ul IL-17, bane 3 & 4 = 0,50 ng / ul, Lanes 5 og 6 = 0,25 ng / ul, bane 7 & 8 = 0,125 ng / ul, Bane 9 = IL-17; VSA partikler: Bane 1 & 2 = 1 ng / ul IL-17, bane 3 & 4 = 0,50 ng / ul,Bane 5 og 6 = 0,25 ng / ul, banerne 7 & 8 = 0,125 ng / ul).
Registrering af potentielt Diagnostiske protein i urinen
Urinprøver, menneskelige opnået fra raske frivillige donorer til skriftligt informeret samtykke, blev tilsat med et rekombinant Mycobacterium arter antigen Tidlig Sekretorisk Target Mycobacterium tuberculosis protein (ESAT-6) at efterligne Mycobacterium tuberculosis inficerede individer. 1 ug hver af ESAT-6 (15 kDa) og IL-2 (15,5 kDa) blev tilsat til 1 ml portioner af human urin indsamlet fra raske frivillige donorer. Urinalyse blev udført på prøverne med en urin reagensstrimmel til at bestemme det optimale forhold af nanopartikler til urin, der var baseret på tilstedeværelse / fravær af urinproteiner. Poly (NIPAM / farvestof) nanopartikler blev anvendt til at høste proteiner fra behandlede og ubehandlede urinprøver. En-dimensionel gelelektroforese af nanopartikler eluaterne blev udført followed ved sølvfarvning. Prøver i U4 og U6 baner repræsenterer nanopartikler eluaterne fra ESAT-6 og IL-2-behandlede urinprøver, der tydeligt viser prominente bands ved 15 kDa (figur 5). Massespektrometri af eluaterne identificerede ESAT-6 (UniProt optagelse POA567, 84,0 dækning, 9 peptider) og IL-2 (UniProt optagelse P60568, 38,56 dækning, 3 peptider). Urin uden nanopartikel høst er vist i den vognbane mærket "Raw".
Figur 1. Nanopartikler høst og koncentrere lav hyppighed proteiner fra komplekse biologiske væsker. (A) Workflow til høstning proteiner. Samlede behandlingstid er ca 1,5 timer. Proteiner i opløsning er koncentreret fra blod, serum, plasma, urin, sved, spyt eller andre kropsvæsker (1000 gange koncentration afbildet). (B)Parti til parti sammenligning viser den ensartet størrelse af nanopartikler. Atomarkraftmikroskopi på glimmer viser ensartet størrelse (0,7 um i diameter) og fravær af sammenklumpning i to batches af nanopartikler. (C) 1-D gelelektroforese med efterfølgende sølvfarvning af tumornekrosefaktor-alfa (TNFa) afsondres fra plasma. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Nanopartikel høst proceduren fra plasma / serum til nedstrøms massespektrometrianalyse. (A) Nanopartikler forbliver suspenderet i opløsning (Poly (NIPAM / farve) vist). (B) Nanopartikler føjes til den fortyndede plasma-prøven. (C) nanopartikel-plasma-affjedring is centrifugeret i en centrifuge for at adskille nanopartikler fra supernatanten. (D) Efter centrifugering nanopartiklerne udgør et særskilt pellet i bunden af røret. (E) Efter vask nanopartiklerne eluatet indeholdende de høstede proteiner fjernet og gemt . til nedstrøms analyse (F) Eluatet tørres under nitrogen flow i en fordamper ved 42,1 ° C, luftstrøm 8 til 1 -. 2 timer forud for massespektrometri Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Urinanalyse ved hjælp af multi-analyt reagensstrimler til prøve kvalitetskontrol. (A) Hver pad på reagensstrimlen imprægneres med kemikalier, enzymer og / eller indikatorfarvestoffer, der reagerer med en forskelligent urin analyt (f.eks. glucose, bilirubin, keton vægtfylde, blod, pH, protein, urobilinogen, nitrit og / eller leukocyt-esterase). Urin klares ved centrifugering. En dråbe urin tilsættes til hvert pad på reagensstrimlen. (B) Farven på hver pude sammenlignes visuelt med de farveblokke på containeren, på det angivne tidspunkt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Høst IL-17. fra plasma ved hjælp af kerne (AAC) eller kerne-skal (VSA) nanopartikler. 1-D-gelelektroforese og Western blotting med anti-IL-17 viser evnen af acrylsyre (AAC) og VSA kerne shell nanopartikler til at høste forskellige koncentrations af IL-17 fra plasma. (S = supernatanten efter nanopartikel høst, P = nanopartikel eluat AAC partikler:. Lanes 1 & 2 = 1 ng / ul IL-17, bane 3 & 4 = 0,50 ng / ul, bane 5 & 6 = 0.25ng / ul, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / ul, Bane 9 = IL-17; VSA partikler: Bane 1 og 2 = 1 ng / ul IL-17, bane 3 & 4 = 0,50 ng / ul, bane 5 & 6 = 0,25 ng / pl, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / ul) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Inddrivelse af Mycobacterium tuberculosis-antigen og cytokin IL-2 fra urin ved hjælp af hydrogel nanopartikler. Sølvfarvning følgende 1-D-gel elektroforese af urinprøver. Prøver i baner U4 og U6 repræsenterer eluater fra urinprøver indeholdende rekombinant ESAT-6 og IL-2, der tydeligt viser prominente bands ved 15 kDa. Massespektrometri af eluaterne identificerede ESAT-6 (UniProt optagelse POA567, 84,0 dækning, 9 peptider) og IL-2 (UniProt optagelse P60568, 38,56 dækning, 3 peptider). (RAW = urin uden nanopartikel høst U1, U2, U3, U5, U7, U8 = urin mangler rekombinant ESAT-6 og IL-2 efter nanopartikel høst). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Protein navn | GI-protein nummer | Koncentration i serum / plasma [ng / ml] | Henvisning |
| abl-interactor 1 isoformen en | 61743942 | Ukendt | |
| AMP-aktiveret proteinkinase gamma2 subunit isoform en | 33186925 | Ukendt | |
| Cas-Br-M (murine) økotrope retroviral transformerende sekvens | 52426745 | Ukendt | |
| chemokin (CC motiv) ligand 18 (pulmonal og aktivering-reguleret) | 4506831 | 30 | 34 |
| chemokin (CC motiv) ligand 5 | 22538814 | 1.5 | 31 |
| chondroadherin | 153251229 | Ukendt | |
| kromosom 16 åben læseramme 80 | 8392875 | Ukendt | |
| Consortin | 213021160 | Ukendt | |
| defensin, alfa 4 corticostatin | 4503303 | Ukendt | |
| 20149675 | Ukendt | ||
| glycoprotein Iba (blodplade), beta-polypeptid | 4504073 | Ukendt | |
| guaninnukleotid bindende protein (G-protein), q polypeptid | 40254462 | Ukendt | |
| Heparanase | 148746204 | Ukendt | |
| insulinlignende vækstfaktor 2 (somatomedin A) | 189083846 | 115px; "> 10030 | |
| lacritin | 15187164 | Ukendt | |
| leukocyt celleafledt kemotaxin 2 | 59806345 | 200.000 | 33 |
| lipocalin 2 (onkogen 24p3) | 38455402 | 0.05 | 28 |
| Monoglycerid lipase, en isoform CRA_b | 6005786 | Ukendt | |
| N-ethylmaleimid følsomme faktor fastgørelse protein Alphen | 47933379 | Ukendt | |
| et snit homeobox 2 | 119220564 | Ukendt | |
| ydre tætte fibre af sædceller haler 4 | 171184433 | Ukendt | |
| gane, lunge og næseepitelet forbundet | 18765705 | Ukendt | |
| peptidoglycan anerkendelse protein 2 | 156616294 | Ukendt | |
| 77695917 | 4 | 29 | |
| Protein CASC3 | 15721939 | Ukendt | |
| RAB27B, medlemslande RAS oncogen familie | 5729997 | Ukendt | |
| Ras Association (RalGDS / AF-6) domæne familie 6 isoform en | 29789443 | Ukendt | |
| ras-relaterede GTP-bindende protein RAB10 | 33695095 Ukendt | ||
| ringfinger protein 166 | 30520320 | Ukendt | |
| serum deprivation respons (phosphatidylserin bindende protein) | 4759082 | Ukendt | |
| solut luftfartsselskab familie 33 (acetyl-CoA transportør), medlem 1 | 4757708 | Ukendt | |
| ST6 beta-galactosamide alfa-2,6-sialyltranferase 1 isoformen en | 27765091 | 15 | 32 |
| thymosin-lignende 3 | 34013530 | Ukendt | |
| transducin-lignende forstærker split 3 (E (sp135) homolog, Drosophila) | 157384982 | Ukendt | |
| transglutaminase 1 | 4507475 | Ukendt | |
| WD gentage domæne 1 | 9257257 | Ukendt | |
| WD gentage domæne 91 | 222080092 | px; "> Ukendt||
| xin actinbindende gentagelse indeholdende 2 | 119372317 | Ukendt |
Tabel 1. Eksempel lav overflod proteiner høstet af nanopartikler fra serum / plasma. (PeptideAtlas peptidindhold massespektrometri) 28-34 Tilpasset med permissionfrom henvisning 13 (Tamburro, D. et al Multifunktionelle kerne-shell nanopartikler:... Discovery tidligere usynlige biomarkører J Am Chem, 133, 19178-19188, (2011 ).) Copyright 2011 American Chemical Society.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Klinisk relevans
En serum eller plasma prøve menes at indeholde lav overflod cirkulerende proteiner og peptider, som kan give en rig kilde til information om tilstanden af organismen som helhed. Trods løftet om serum proteomics, er der tre grundlæggende og alvorlige fysiologiske barrierer modarbejde biomarkør opdagelse og oversættelse til klinisk fordel 10, 11, 16, 25.
1. Vigtige diagnostiske biomarkører kan eksistere i ekstremt lav-overflod (koncentration) i blodet. Tidligt stadium sygt væv, såsom præ-metastatisk læsioner, kan udgøre mindre end nogle få mm 3. Biomarkører kaste ind i kredsløbet fra sådan en lille væv volumen vil blive meget fortyndet i blodvolumen hele. Relevante analytter kan eksistere under detektionsgrænserne for massespektrometri og konventionelle tests.
2. lav tæthed biomarkører /proteiner maskeres ved tilstedeværelsen af høje rigelige proteiner, såsom albumin og immunglobulin, som repræsenterer op til 90% af plasma-proteomet 14.
3. Proteiner og peptider er modtagelige for nedbrydning af endogene og eksogene proteinaser efter prøvetagning og prøve transport / opbevaring. Protein nedbrydning kan føre til falsk positive eller falsk negative resultater 35.
Hydrogel nanopartikler blev udviklet som porøse, dynamisk, polymerer indeholdende anthraquinonetriazine farvestoffer og / eller vinylsulfonsyre skaller til protein og peptid høst og konservering i kropsvæsker 11, 13. Vores gruppe syntetiseret og testet hydrogel nanopartikler funktionaliserede med et væld af organiske farvestoffer (dvs.. , sulfonerede og ikke-sulfonatedanthraquinonetriazine farvestoffer) og viste de præferentielle tilhørsforhold til flere proteinanalytter 11, 13. Vi har også etableret protokoller for biomarkører, der brugerhydrogel nanopartikler med lymfe, spyt, cerebrospinalvæske, sved, urin, plasma, blod eller serum prøver 11, 13, 23, 24, 26.
Optimering nanopartikel høst parametre inden høst proteiner fra ædle klinisk / forsknings prøver er nødvendig for ideelle resultater. Mængden af protein i prøverne, der skal kvantificeres for at bestemme det optimale forhold af nanopartikler til prøvevolumen. For analytter af ukendt koncentration, en dosis-respons-kurve ved hjælp af rekombinante proteiner giver information om detektionsgrænserne. Hvis der er passende prøve, kan forskellige typer af nanopartikler anvendes til at bestemme den ideelle nanopartikel for analytten og prøven.
Urinanalyse før nanopartikel høst giver en urinprøve kvalitetskontrol. Affiniteten af nanopartikel farvestof agn afhænger af det isoelektriske punkt for proteinet af interesse, og pH-værdien af det omgivende medium. Urin pH væremellem 5,5 og 7,0 er optimal for protein høst med poly (NIPAM / farvestof) nanopartikler. Tilstedeværelsen af hæmolyserede eller intakte røde blodlegemer (1+ blod på reagensstrimlen) ikke interfererer med nanopartikel høst.
I denne protokol fokuserede vi på anvendelsen af hydrogel nanopartikler til at høste proteiner fra plasma og urin. Fremtidige applikationer kan omfatte andre kropsvæsker, såsom øjets glaslegeme eller ledvæske. Potentiale in vivo applikationer kan forudses i fremtiden, hvor nanopartikler injiceres i sygt væv til at indsamle biomolekyler. Det fremtidige arbejde vil også blive fokuseret på udvikling af nye apparater til opsamling og opbevaring af biomarkører, såsom en nanopartikel-baserede hud patch til analyse af huden transudate proteomanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Michael Henry, Dublin City University, venligt bistået med indsamling og analyse af data vist i figur 5. Dette arbejde blev delvist støttet af (1) George Mason University, (2) den italienske IstitutoSuperiore di Sanita «inden for rammerne af den italienske / USA samarbejdsaftale mellem amerikanske Department of Health og Human Services, George Mason University, og den italienske sundhedsministerium, (3) NIH, IMAT programmet tilskud 1R21CA137706-01 og 1R33CA173359-01 til LAL, og (4) Ceres Nanovidenskab, Inc .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
| 18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
| Tris HCl, 50 mM pH 7.0 | VWR | IC816116 | 50 mM, pH 7 |
| Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | Available from VWR |
| Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | Available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
| Sodium thiocyanate 25 mM | Acros Organics | 419675000 | For serum/plasma samples |
| Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | For urine samples |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | Use at RT to prevent SDS from precipitating |
| Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | Do not substitute a boiling water bath |
| Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | For serum/plasma samples |
| Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50 ml tube capacity, rcf 3,700 x g |
| Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7 ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | With screw caps for urine samples |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
| Timer | Fisher Scientific | S04782 | Seconds/minutes |
References
- Aebersold, R., Mann, M.
- Gerszten, R. E., et al. Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).
- Merrell, K., et al. Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry. J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).
- Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery. Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).
- Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood. Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).
- Geho, D., et al. Fractionation of serum components using nanoporous substrates. Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).
- Sennels, L., et al. Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads. J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer. J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).
- Marshall, J., et al. Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction. J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).
- Fredolini, C., et al. Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles. Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).
- Luchini, A., et al. Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation. Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).
- Patanarut, A., et al. Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).
- Tamburro, D., et al. Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers. J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).
- Anderson, N. L., Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
- Fredolini, C., et al. Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH. Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).
- Longo, C., et al. Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers. PLoS One. 4 (3), e4763 (2009).
- Luchini, A., et al. Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).
- Luchini, A., et al. Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals. J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).
- Eslami, A., Lujan, J., Western, blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Penna, A., Cahalan, M., , Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (7), 264 (2007).
- Bosch, J., et al. Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results. J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).
- Fredolini, C., et al. Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology. AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).
- Longo, C., et al. A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum. Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).
- Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F. 3rd, Liotta, L. A. Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).
- Douglas, T. A., et al. The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease. Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).
- Prakash, A., et al. Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies. J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).
- Choi, K. M., et al. Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease. Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).
- Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle. Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).
- Izycki, T., et al. Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy. Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).
- Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis. Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).
- Kitazume, S., et al. Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo. Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).
- Saito, T., et al. Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).
- Struyf, S., et al. PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia. Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).
- Michael, I. P., et al. Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression. J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).
