Produzione e isolamento degli assoni dai neuroni sensoriali per l'analisi biochimica Uso dei filtri porosi
Summary
This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.
Abstract
Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.
Introduction
Il compartimento assonale dei neuroni mostra un buon grado di autonomia funzionale dal compartimento somato-dendritico. In neuroni di proiezione, assoni contengono la maggior parte della proteina 1,2 neuronale. Lo studio della fisiologia e fisiopatologia degli assoni ha avuto un impulso nella comunità neuroscientifica, perché recenti studi hanno dimostrato che inizi la disfunzione assonale sembra essere una caratteristica comune delle malattie neurodegenerative e dei disturbi neuropsichiatrici 3. Sembra probabile che una migliore comprensione dei meccanismi assonale esclusiva in condizioni normali e patologiche farà luce sui primi eventi che guidano erettile.
Il presente protocollo descrive come utilizzare inserti di coltura recanti una membrana porosa (filtro) per ottenere grandi quantità di materiale assonale puro che è adatto per biochimica e analisi immunocitochimica. L'uso del filtro inserti a studiare biologia assonale è stato realizzato da Steward ecolleghi 4 e ulteriormente sviluppati da Twiss e colleghi 5 alla sua configurazione attuale. La tecnica è ora in uso corrente da gruppi studiano diversi aspetti della assonale e dendrite biologia, con lievi modifiche in ciascun caso per ospitare per la popolazione di neuroni studiati, i trattamenti eseguiti e del tipo di analisi biochimiche usati 6-9. Il presente protocollo non intende accogliere tutte le alternative per una tale varietà di applicazioni, ma piuttosto di fornire un approccio semplice che è adatto per la maggior parte delle applicazioni. In particolare, il protocollo qui descritto utilizza un triplo strato che massimizza il rendimento assonale per le analisi biochimiche ed è più adatto per studiare i rivestimenti assonale degenerazione-altri descritti nella letteratura prodotta meno assoni che ritraggono e degenerano più rapidamente in caso di privazione di fattori trofici 9.
In questa procedura, corpi cellulari neuronali rimangono isolati in cima alle wh filtroassoni ile passano attraverso i pori e crescono lungo la sua superficie di fondo. Assoni puro (esente della glia e contaminanti corpo cellule neuronali) che si sviluppano sulla superficie inferiore del filtro possono essere raccolti per analisi biochimiche o possono essere fissati in situ ed esaminati mediante tecniche immunocitochimiche 9. La procedura si basa sull'utilizzo di neuroni sensoriali embrionali dai gangli della radice dorsale (DRG). DRG embrionali sono ampiamente usati per studiare biologia assonale perché neuriti da queste cellule subiscono quando mantenuto in fattore di crescita nervosa (NGF) crescita veloce e robusto in vitro, e perché rapidamente subiscono degenerazione quando privati di questo fattore. Inoltre, i neuroni DRG mancano dendriti, in modo che tutti i neuriti raccolti da questo metodo sono puramente assoni.
Inserti del filtro rappresentano un grande vantaggio rispetto ad altri approcci utilizzati per studiare gli assoni. Studi basandosi sull'uso di microscopia per differenziare i processi che si verificano nel soma cella da quelli di unXON forniscono informazioni biochimiche limitate. Come altro esempio, sistemi di coltura compartimenti (ad esempio, camere Campenot 10 o dispositivi microfluidici 11) sono utili per approcci di imaging e per il trattamento differenziato dei compartimenti cellulari ma forniscono solo piccole quantità di materiale assonale, precludendo l'uso di queste tecniche di analisi biochimiche che richiedono relativamente grandi quantità di campione. Inoltre, il loro uso richiede una formazione significativa così come i dispositivi specializzati, e sono in termini di tempo. Un altro approccio spesso utilizzato per isolare gli assoni da espianti è quello di rimuovere manualmente un centro di espianto (che contiene i corpi cellulari neuronali) prima della raccolta del campione assonale. Anche se questo può produrre grandi quantità di preparazioni assone arricchito, assoni di questa preparazione possono essere avvolti glia e rimuovere rapidamente organi 20 di espianto consecutivamente da 6 pozzetti (come esempio di un esperimento minima) richiede tempo e al limite della fattibilità.
Al contrario, il metodo presentato qui produce abbondanti e pure preparati assonale che possono poi essere analizzati da virtualmente qualsiasi tecnica biochimica che viene comunemente utilizzato per analizzare lisati di cellule intere, come western blot, immunoprecipitazione 6, northern blot 5 spettrometria di massa 6, purificazione dell'RNA 7,12,13, tra gli altri. Inoltre, il protocollo può essere applicato a tecniche di immunofluorescenza (IF), in quanto è possibile fissare assoni in crescita nella parte inferiore del filtro di esaminarli ulteriormente IF. Questo approccio facilita notevolmente l'analisi dei processi specifici assonale poiché non esistono corpi cellulari nella preparazione finale. Questo è un vantaggio significativo in quanto un segnale alto immunofluorescenza da corpi cellulari spesso pregiudica esame e l'analisi di un segnale più debole proveniente da strutture sottili come assoni.
Due applicazioni del metodo di coltura per studiare assonale degenerazione are descritto; un modello di potatura di sviluppo e un modello di degenerazione lesioni indotte (comunemente indicato come la degenerazione walleriana). La modellazione di potatura sviluppo si basa sul fatto che i neuroni sensoriali in vivo competono per limitare quantità di NGF-bersaglio derivato e quelli non ricevono abbastanza neurotrofico supporto degenerato 14. Questo fenomeno può essere imitato in colture DRG embrionali ritirando NGF dal terreno di coltura, che, come accade in vivo, avvia degenerazione assonale seguito dalla distruzione corpo cellulare. Per modellare degenerazione Wallerian, il lato superiore del filtro con i corpi cellulari viene raschiata via. Gli assoni che erano cresciute sul lato inferiore del filtro diventare fisicamente separati dai corpi cellulari e successivamente subire il processo degenerativo rapido e stereotipico noto come degenerazione Walleriana 15, dal nome A. Waller che per primo ha segnalato il fenomeno nel 1850 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Parametri importanti da prendere in considerazione quando si adegua questa tecnica includono la popolazione neuronale che sarà studiato, il substrato, dimensione dei pori del filtro e superficie. Tutti questi parametri avranno un impatto la specificità, la qualità e la quantità della preparazione neurite ottenuto, e deve essere considerato con attenzione da parte dell'utente finale. Negli esempi presentati in questo protocollo, l'uso di neuroni DRG ha il vantaggio di estendere solo assoni, dando così una pu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.
Materials
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon Cell Culture Inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon Cell Culture Companion Plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 °C and thaw overnight at 4 °C |
| PureCol Bovine Collagen Solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM. |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF Antibody | Prepared in-house | – | As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. & Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991) |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-Tubulin Antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2 % B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1 % Penicillin-Streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1X Laemmli Sample Buffer | |||
| 10 % SDS 0.5 M DTT 0.5 M Tris (pH 6.8) 5 % Glycerol 0.01 % (w/v) Bromophenol blue |
References
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).
- Rasband, M. N. The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).
- Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).
- Torre, E. R., Steward, O. Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies. J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).
- Zheng, J. Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).
- Willis, D., et al. Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).
- Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons. J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).
- Schoenmann, Z., et al. Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals. J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).
- Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. XIAP regulates caspase activity in degenerating axons. Cell Rep. 4, 751-763 (2013).
- Ure, D. R., Campenot, R. B. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Minis, A., et al. Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons. Dev. Neurobiol. , (2013).
- Niekerk, E. A., et al. Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J Vis Exp. (48), (2011).
- Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy. J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).
