Le but de cette publication est de visualiser et de discuter des étapes opérationnelles d'un protocole Northern Blot améliorée sur l'ARN extrait de Drosophila melanogaster embryons, des cellules et des tissus. Ce protocole est particulièrement utile pour la détection efficace de petites espèces d'ARN.
Les dernières décennies ont vu l'explosion de l'intérêt scientifique autour des mécanismes de contrôle de l'expression des gènes au niveau de l'ARN. Cette branche de la biologie moléculaire a été fortement alimentée par la découverte de non codantes des ARN comme des acteurs majeurs dans la régulation post-transcriptionnelle. Une telle perspective révolutionnaire a été accompagnée et déclenchée par le développement de technologies puissantes pour le profilage des ARN courte expression, à la fois au niveau haut débit (identification du génome entier) ou analyse d'un seul candidat (accumulation de l'état d'équilibre des espèces spécifiques). Bien que plusieurs stratégies état de l'art sont actuellement disponibles pour le dosage ou la visualisation de ces molécules fuyant, analyse Northern Blot reste l'approche droit dans la biologie moléculaire pour l'évaluation immédiate et précise de l'expression de l'ARN. Il constitue une première étape vers l'application de technologies coûteuses, plus sophistiqués et, dans de nombreux cas, reste une méthode préférentielle pour gagner facilement des idéesARN en biologie. Ici, nous aperçu un protocole efficace (Enhanced Northern Blot) pour détecter les microARN faiblement exprimés (ou d'autres espèces de petits ARN réglementaires) de Drosophila melanogaster embryons entiers, disséqué manuellement tissus / adultes larvaires ou dans des cellules cultivées in vitro. Une quantité très limitée de l'ARN est nécessaire et l'utilisation du matériel de flux cellules cytométrie isolées peuvent être également envisagée.
ARN biochimie a connu progrès spectaculaires au cours des dernières années 1. Notre compréhension du potentiel de l'ARN dans le contrôle de l'expression génique a été éclaté par l'identification des puissants ribo-régulateurs non codants 2, par la découverte de nouveaux mécanismes de régulation à base d'ARN 3,4 et par une caractérisation détaillée des événements post-transcriptionnelle déjà connues 5. Tous biologie de l'ARN ensemble, ces études ont permis de faire considérablement la scène, devenant un important sujet de recherche dans le paysage scientifique actuel. En particulier, au cours des dernières années, nous obtenons une idée de l'impact profond du «monde de l'ARN" sur la neurobiologie moléculaire 6, l'un des domaines de recherche les plus dynamiques en sciences de la vie moderne. Dans la dernière décennie du siècle passé, le scénario scientifique globale a été révolutionné par la découverte de l'interférence ARN 7,8 et des petits ARN régulateurs 9,10notamment en ce qui concerne les micro-ARN 11 exprimé de manière endogène de petits ARN non codantes impliquées dans le contrôle de la quasi-totalité des fonctions cellulaires en tant que régulateurs pléiotropes et combinatoires de l'expression génique.
Près de 10 ans après la découverte initiale miARN dans Caenorhabditis elegans par Ambros et les laboratoires de Ruvkun, une attention renouvelée a été tourné dans le champ quand un grand nombre de miARN ont été identifiés chez la drosophile et dans les cellules humaines ainsi 12-15. Depuis lors, grâce à des approches transgéniques polyvalents, Drosophila melanogaster s'est distingué comme un contexte biologique précieux pour se plonger dans la biosynthèse des miARN et de l'activité. Drosophila miARN ont révélé des fonctions distinctes dans les processus d'insectes spécifiques ou évolutives conservées, allant de vieillissement de métabolisme, les voies de signalisation , le comportement et, bien sûr, la neurogenèse. Le long de cette direction, nous avons récemment dévoilé un lien nouveau 16 dans le co intriganterrelation survenant entre le gène maître gcm / descente et la voie de l'ARN. Le facteur de transcription Gcm mouche / Glide 17-19 constitue un exemple unique de destin cellulaire déterminant, qui dicte le choix de gliale vs destinée neuronale dans multipotentes voler précurseurs neuraux 20. Vingt ans de longues recherches sur ce sujet a clairement souligné l'apparition de multiples entrées et se chevauchent de la régulation de l'expression des gènes convergent sur gcm / glisser 21-28 pour établir les seuils requis pour équilibrer le rapport délicat entre homologues neuronales et gliales au cours du développement neuronal.
Nous avons découvert que la régulation par DMEL-miR279 ciblage représente un niveau supplémentaire de contrôle contribuant à la post-transcriptionnelle de réglage fin de gcm / glisser expression 16. Améliorations méthodologiques spécifiques à l'échelle mondiale, ces lignes de recherche ont requis: le long des années, plusieurs technologies initialement développées pour analyser tradARN tradition- ont été convertis pour quantifier les petits ARN non codantes, comme tant RNase de protection, d'ADNc tableaux 29-31, méthodes de PCR en temps réel 32-35 et le séquençage de 36,37. De l'autre côté, le recalibrage des approches techniques a favorisé progrès continus dans le domaine.
Northern Blot dosage (NB, ou une analyse par transfert sur gel d'ARN) constitue un exemple représentatif: il est largement utilisé pour le profil de l'accumulation de l'ARN, car elle assure à la fois le niveau d'expression de quantification, ainsi que la détermination de la taille. Cependant, la faible sensibilité intrinsèque de la méthode est de limiter quand il est appliqué à l'expression des gènes tendeurs faible abondance, comme les ARN courts. Une conséquence néfaste est l'exigence de grandes quantités d'ARN total, ce qui rend difficile son application à des échantillons biologiques spécifiques. Pour ces raisons, les variantes NB spécifiques pour la détection des ARN petit ont été développés 38-40: nous avons profité d'un proc NB amélioréeedure 41 (ENB, Enhanced Northern Blot), tandis que l'élucidation du jeu susmentionné entre DMEL-miR279 et gcm / descente.
Cette méthode repose sur une étape de réticulation chimique sur la base de l'activité d'un dérivé de carbodiimide [1-éthyl-3-(3-diméthylamino-propyl) carbodiimide, EDC] pour fixer l'acide nucléique sur des supports solides. Carbodiimide est un agent de réticulation polyvalent connu pour catalyser la formation de liaisons amide entre les groupes carboxyle activés ou phosphate et des groupes amine 42. Cette propriété peut être exploitée pour coupler de manière covalente par l'intermédiaire de leurs petits ARN groupe 5'-hydroxyle mono-phosphorylé aux groupes amino à la surface des membranes de nylon. La configuration résultant de fixation augmente l'accessibilité de l'acide nucléique immobilisé et, par conséquent, l'efficacité de l'hybridation sonde-cible, ce qui conduit à l'amélioration remarquable de détection 43.
La technique suppose notamment relevance dans des études moléculaires de Drosophila, qui par l'apparition de nouvelles catégories distinctes et de petits ARN non codants de 44 émerge. Parmi ceux-ci, rasiRNAs 45,46 constituent un sous-type spécifique des ARN Piwi-interacting (piRNAs 47), impliqués dans l'inactivation de gène spécifique à la séquence. Détails opérationnels de cette méthode sont décrits en détail et visualisés ci-après, par rapport à l'analyse de la microARN DMEL-miR279 et DMEL-miR286 et, pour la première fois, d'une rasiRNA, rasi4. Nous avons poussé à l'extrême cette méthode, qui nous a permis révélant des objectifs mal exprimés à partir des quantités minimes de l'ARN (moins de 1 ug).
Bien que notre appréciation de l'entrelacement sophistiqué par lequel l'ARN régule la neurogenèse est en constante augmentation, les implications mécanistiques de circuiteries à base d'ARN qui affectent neurones biologie des cellules souches, la différenciation neuronale / intégration fonctionnelle, le développement de pathologies et cancers de neurones restent inexplorées. Le maintien de ces réseaux par les royaumes rend le potentiel des systèmes génétiques Drosophila melanogaster con…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, le Centre National de la Recherche Scientifique, de l'Université de Strasbourg, l'Hôpital de Strasbourg, l'Association pour la Recherche sur le Cancer, l'Institut National du Cancer, l'Agence Nationale de la Recherche et la Région Alsace.
Pietro Laneve a été soutenu par la Fondation pour la Recherche Médicale. Actuellement, il est le bénéficiaire d'une Istituto Italiano Tecnologia (IIT) de fraternité. Les frais de publication sont pris en charge par le réseau Neurex (TriNeuron – Programme Interreg IV Rhin Supérieur)
FINAL COMPOSITION/NAME | COMPANY | CATALOGUE (Stock) | COMMENTS |
GENERAL REQUIREMENT | |||
Centrifuge, 5418 | Eppendorf | 5418 000.017 | |
Decontaminant, RNase Away | Sigma-Aldrich | 83931 | Apply on glass/plasticware, wipe and rinse |
RNase inhibitor, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | Hazardous //// 1609-47-8 |
0.1 % DEPC suspension | Incubate 2 hr at 37 ˚C, then sterilize by autoclave | ||
SAMPLE PREPARATION | |||
Stereo Microscope, M60 | Leica | ||
1X PBS Buffer | |||
137 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
2.7 mM KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | 7447-40-7 |
10 mM Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | 7558-79-4 |
1.8 mM KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | 7778-77-0 |
RNA EXTRACTION/ANALYSIS | |||
UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
Gel Imager, ChemiDoc XRS+ | Biorad | 170-8265 | |
Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT | BioRad | 170-4487EDU | |
RNA extraction reagent, TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 | Hazardous |
PCA (25:24:1), 1:1 for extraction | Sigma-Aldrich | 77617 | 136112-00-0 |
Chlorophorm, 1:1 for extraction | Sigma-Aldrich | C2432 | 67-66-3 |
EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing | Sigma-Aldrich | 59844 | 64-17-5 |
Gene Ruler 1Kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0311 | |
Stop Mix | |||
300 mM NaOAc, pH 5.5 | Sigma-Aldrich | S2889 | 127-09-3 |
1x RSB Solution | |||
2% sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71736 | Never cool down SDS to avoid precipitation //// 151-21-3 |
2 mg/ml Proteinase K | Roche Applied Science | 0-3115828001 | EC 3.4.21.64 9 |
10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB) | |||
100 mM Tris-Cl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T5941 | 1185-53-1 |
100 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
30 mM MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | 7786-30-3 |
Denaturing Agarose Gel | |||
1.2% Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2 |
1x MOPS Buffer | Add when T < 60 ˚C | ||
3% formaldehayde | Sigma-Aldrich | F8775 | Hazardous. Add when T < 60 ˚C //// 50-00-0 |
10X MOPS Buffer | |||
0.2 M MOPS sodium salt, pH 7 | Sigma-Aldrich | M9381 | Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7 |
Agarose Loading Dye | |||
1x MOPS Buffer | |||
3% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Hazardous //// 50-00-0 |
50% formamide | Sigma-Aldrich | 47670 | Hazardous //// 75-12-7 |
Ethidium bromide (EtBr) 30 μg/ml | Sigma-Aldrich | E1510 | Hazardous //// 1239-45-8 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 115-39-9 |
SMALL RNA FRACTIONATION | |||
Flat gel loading tips | Life Technologies | LC1002 | |
Savant SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | DNA120 | |
Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | 165-8000 | |
Denaturing Acrilamide Gel | |||
10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1) | Sigma-Aldrich | A3449 | Hazardous. Let the gel polymerizefor 45 min before use |
1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer) | |||
7 M urea | Sigma-Aldrich | U6504 | 57-13-6 |
0.1% ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 215589 | 7727-54-0 |
0.1% TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | 110-18-9 |
Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step) | Thermo Scientific | SM1211 | Label 0.1 μg, as described in the "probe labeling" reaction |
Acrylamide Blue Dye | |||
50% formamide | Sigma-Aldrich | 47670 | Hazardous //// 75-12-7 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 115-39-9 |
Running Buffer (RB) | |||
1x MOPS Buffer | |||
Alternative RB: 1x TBE Buffer | |||
1x TBE Buffer | |||
5X TBE | |||
445 mM Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
445 mM boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | 10043-35-3 |
20 mM EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
Gel Staining Solution | |||
Ethidium bromide 0.5 μg/ml | Sigma-Aldrich | E1510 | Hazardous //// 1239-45-8 |
1x RB | Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr | ||
BLOTTING | |||
3MM Whatman paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | |
Neutral Nylon Membrane, Hybond NX | GE Healthcare Life Science | RPN203T | Photosensitive |
CROSSLINKING | |||
Crosslinking Solution (XLS) | |||
1% 1-methylimidazole (v/v) | Sigma-Aldrich | 336092 | Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7 |
12.5 mM HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | Hazardous //// 7647-01-0 |
3.1% EDC (w/v) | Sigma-Aldrich | 3450 | 25952-53-8 |
(PRE)-HYBRIDIZATION | |||
Liquid Scintillation Counter | Beckmann | LS 6500 | |
Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml | Life Technologies | AM9680 | |
rasi4 antisense probe | 5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3' | ||
5s-rRNA antisense probe | 5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3' | ||
Dmel-miR279 antisense probe | 5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3' | ||
Dmel-miR286 antisense probe | 5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3' | ||
Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns | GE Healthcare Life Science | 27-5325-01 | |
(Pre)-Hybridization Solution (HS) | |||
6x SSPE | Pre-warm HS at 37 ˚C before use | ||
0.5% SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | 151-21-3 |
5x Denhardt's Solution | |||
20X SSPE | |||
3.6 M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
0.2 M sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | 7601-54-9 |
20 mM EDTA (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
50x Denhardt's Solution | |||
1% Ficoll 400 (w/v) | Sigma-Aldrich | F2637 | 26873-85-8 |
1% Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | 9003-39-8 |
1% BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | 9048-46-8 |
1X TEN Buffer | |||
10 mM Tris-Cl (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
100 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
1 mM EDTA (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
Probe Labelling | |||
0.4 μM oligonucleotide | |||
1.5 μl Ci/μl [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG002A | Hazardous //// 51963-61-2 |
1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer | Biolabs | B0201 | |
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/μl | Biolabs | M0201 | EC 2.7.1.78 |
30 min at 37 ˚C, stop by 20 mM EDTA | |||
WASHING | |||
Geiger Mueller Detectors | Canberra Industries | MCB2/CPS – EM77021 | |
Washing Buffer (WB), 2x SSPE | |||
Stringent Washing Buffers | |||
0.2x SSPE | |||
2x SSPE, 0.5% SDS | |||
0.2x SSPE, 0.5% SDS | |||
SIGNAL DETECTION | |||
PharosFX Plus System | Biorad | 170-9460 | |
Image J | Freely available | ||
Quantity One | Biorad | ||
X-ray films , BioMax XAR | Sigma-Aldrich | F5888 | Photosensitive |
Developer for X-ray films | Sigma-Aldrich | P7042 | |
Fixer for X-ray films | Sigma-Aldrich | P7167 | |
STRIPPING | |||
Stripping Solution | |||
10 mM Tris-HCl pH 8.8 | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
5 mM EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
0.1% SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3 |