מטרתו של פרסום זה היא לדמיין ולדון בצעדים האופרטיביים של פרוטוקול צפון כתם משופר על RNA שחולץ מתסיסנית עוברים, תאים ורקמות. פרוטוקול זה שימושי במיוחד לאיתור יעיל של מיני RNA קטנים.
העשורים האחרונים היינו עדים לפיצוץ של כ מנגנוני בקרת ביטוי גני עניין מדעי ברמת RNA. ענף זה של ביולוגיה מולקולרית כבר מתודלק באופן משמעותי כתוצאה מגילוי noncoding RNAs כשחקנים מרכזיים בויסות לאחר תעתיק. כגון פרספקטיבה מהפכנית כבר מלווה ומופעלת על ידי הפיתוח של טכנולוגיות רבות עוצמה לאפיון ביטוי RNAs קצר, הן ברמת התפוקה הגבוהה (זיהוי הגנום) או כניתוח בודד מועמד (הצטברות מצב יציבה של מינים ספציפיים). למרות שכמה אסטרטגיות המדינה של אמנות זמינות כעת למינון או חזותי מולקולות שברחו כזה, assay צפון הכתם נשאר הגישה זכאית בביולוגיה מולקולרית להערכה מיידית ומדויקת של ביטוי RNA. זה מהווה צעד ראשון בדרך ליישום של, וטכנולוגיות יקרות יותר מתוחכמות, במקרים רבים, נותר שיטה מועדפת לתובנה בקלותלביולוגית RNA. כאן אנו סקירה כללית של פרוטוקול יעיל (Enhanced צפון כתם) לאיתור מייקרו RNA מתבטא בחולשה (או מיני RNA קטנים אחרים רגולטורים) מתסיסנית כל עוברים, גזורים באופן ידני רקמות / מבוגר זחל או בתאים בתרבית מבחנה. כמות מוגבלת מאוד של RNA נדרש והשימוש בחומר מתאי הזרימה cytometry-מבודדים יכולים להיות גם בחזונו.
ביוכימיה RNA חוותה התקדמות מרהיבה בשנים האחרונות 1. ההבנה שלנו של פוטנציאל RNA בבקרת ביטוי גנים כבר פרצה על ידי זיהוי של ribo-רגולטורי noncoding החזקים 2, על ידי הגילוי של מנגנונים מבוססי RNA רומן הרגולציה 3,4 ועל ידי אפיון מעמיק יותר של אירועים שלאחר התעתיק כבר ידועים 5. כל הביולוגיה RNA יחד מחקרים אלה אפשרו לעשות באופן דרמטי את הסצנה, הפך נושא המחקר מרכזי בנוף המדעי הנוכחי. בפרט, בשנים האחרונות אנחנו מקבלים תחושה של ההשפעה המתפשטת של "עולם RNA" בנוירוביולוגיה המולקולרית 6, אחד מתחומי המחקר הדינמיים ביותר במדעי החיים מודרניים. בעשור האחרון של המאה שעברה, התרחיש המדעי הכולל כבר מהפכה על ידי הגילוי של התערבות RNA 7,8 ושל RNAs הרגולציה הקטן 9,10ביחס מסוים ל11 מייקרו RNA, באופן אנדוגני הביע RNAs noncoding הקטן מעורב בשליטה כמעט את כל הפונקציות הסלולריות כרגולטורי pleiotropic וקומבינטורית של ביטוי גנים.
כמעט 10 שנים לאחר הגילוי ראשוני מירנה בelegans Caenorhabditis ידי אמברוס והמעבדות של Ruvkun, תשומת לב מחודשת הפכה לשדה כאשר מספרים גבוהים של miRNAs זוהו בדרוזופילה ובתאים אנושיים, כמו גם 12-15. מאז, הודות לגישות מהונדסים תכליתיות, melanogaster דרוזופילה יש התבלט כהקשר ביולוגי יקר ערך עבור להתעמק ביוסינתזה ופעילות מירנה. דרוזופילה miRNAs חשפו פונקציות שונות בתהליכי חרקים ספציפיים או אבולוציונית משומרת, פורש מהזדקנות לחילוף חומרים, מסלולי איתות , התנהגות, וכמובן, נוירוגנזה. לאורך כיוון זה, אנו חשפו לאחרונה קישור רומן 16 בשיתוף המסקרןrrelation מתרחש בין GCM / דאיית גן האדון ומסלול RNA. גורם שעתוק זבוב GCM / Glide 17-19 מהווה דוגמא ייחודית של הקובע גורל תא, אשר מכתיב את בחירת הגורל העצבית גליה לעומת בmultipotent לטוס מבשרים עצביים 20. עשרים שנה מחקר ארוך בנושא זה באופן ברור הדגיש את התרחשותם של מספר רב של תשומות והחופפות של רגולציה ביטוי גנים מתכנסת על GCM / להחליק 21-28 להקים את רמות הסף הנדרשות לאיזון היחס העדין בין עמיתים עצביים וגליה במהלך התפתחות עצבית.
גילינו כי רגולציה, באמצעות מיקוד לפי Dmel-miR279 מייצגת רמת שליטה נוספת שתרמה לכוונון עדין שלאחר תעתיק של GCM / להחליק ביטוי 16. שיפורים מתודולוגיים ספציפיים בעולם, קווי מחקר אלה נדרשים: לאורך שנים, במספר טכנולוגיות שפותחו במקור כדי לנתח מסורתיתRNAs itional הוסב לכימות RNAs לא קטן קידוד, כמו כמבחני הגנה RNAse, מערכי cDNA 29-31, שיטות PCR בזמן אמת 32-35 ורצף 36,37. בצד השני, כיול של גישות טכניות טפח התקדמות רציפה בתחום.
צפון הכתם assay (NB, או assay כתם ג'ל RNA) מהווה דוגמא מייצגת: הוא מועסק במידה רבה לפרופיל הצטברות RNA, שכן הוא מבטיח שני quantitation רמת הביטוי, כמו גם קביעת גודל. עם זאת, רגישות העניים המהותית של השיטה היא להגביל כאשר הוא שיחול על מקלטי קנס ביטוי גנים נמוכים בשפע, כמו RNAs הקצר. תוצאה מזיקה היא הדרישה של כמויות גדולות של רנ"א הכל, מה שהופך את היישום שלה קשה לדגימות ביולוגיות ספציפיות. מסיבות כאלה, וריאנטים NB ספציפיים לגילוי RNA קטן פותחו 38-40: אנו ניצלנו proc NB השתפרedure 41 (ENB, משופר צפון כתם), ואילו הבהרת הגומלין הנ"ל בין Dmel-miR279 וGCM / דאייה.
שיטה זו מסתמכת על צעד כימי crosslinking מבוסס על הפעילות של נגזר Carbodiimide [1-אתיל 3-carbodiimide (3-dimethylaminopropyl), EDC] לתקן חומצות גרעין על תמיכה מוצקה. Carbodiimide הוא מקשר צלב צדדי הידוע לזרז את הקמתה של אגרות חוב אמיד בין קבוצות carboxyl או פוספט מופעלות וקבוצות האמינים 42. מאפיין זה יכול להיות מנוצל לזוג קוולנטית RNA הקטן באמצעות קבוצת 5'-הידרוקסיל מונו פוספורילציה לאמין קבוצות על פני השטח של קרום ניילון. תצורת הקובץ המצורף וכתוצאה מכך מגדילה את הנגישות של חומצות גרעין המשותקים ו, בתורו, את היעילות של הכלאת בדיקה-יעד, וכתוצאה מכך שיפור גילוי מדהים 43.
הטכניקה מניחה relevanc מסויםדואר במחקרים מולקולריים דרוזופילה, שבו ההתרחשות של כיתות רומן וייחודיות של RNAs noncoding הקטן מתגלה 44. בין אלה, rasiRNAs 45,46 מהווים תת סוג ספציפי של RNAs אינטראקציה-piwi (piRNAs 47), מעורב בהשתקת גני רצף ספציפי. פרטים אופרטיביים של שיטה זו מתוארים באופן מלא ומדמיינים להלן, ביחס לניתוח של מייקרו RNA Dmel-miR279 וDmel-miR286 ו, בפעם הראשונה, של אחד rasiRNA, rasi4. אנחנו דחפתי למצבים קיצוניים ששיטה זו, אשר אפשרה לנו לחשוף את המטרות הביעו גרוע מכמויות מינימליות של RNA (מיקרוגרם פחות מ 1).
למרות ההערכה של המתוחכם משתרג דרכו RNA מסדיר נוירוגנזה שלנו עולה בהתמדה, ההשלכות מכניסטית של circuitries מבוסס RNA המשפיע על ביולוגיה של תאי גזע עצבי, הבחנה עצבית / אינטגרציה פונקציונלית, פיתוח של פתולוגיות וסוגי הסרטן עצביים להישאר שלא נחקרו. התחזוקה של רשתות כגון דרך הממלכ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי דה לה סנטה et de la המשוכלל והנדיר Médicale, המרכז הלאומי דה לה המשוכלל והנדיר Scientifique, האוניברסיטה לדה שטרסבורג, Hôpital דה שטרסבורג, האגודה לשפוך la משוכלל ונדיר sur le הסרטן, המכון הלאומי du הסרטן, סוכנות הידיעות Nationale de la המשוכלל והנדיר ואלזס האזור.
פייטרו Laneve כבר נתמך על ידי Fondation לשפוך la המשוכלל והנדיר Médicale. נכון לעכשיו, הוא מקבל מלגת Istituto Italiano Tecnologia (IIT). עלויות פרסום נתמכות על ידי רשת Neurex (TriNeuron – תכנית Interreg IV העליון הריין)
FINAL COMPOSITION/NAME | COMPANY | CATALOGUE (Stock) | COMMENTS |
GENERAL REQUIREMENT | |||
Centrifuge, 5418 | Eppendorf | 5418 000.017 | |
Decontaminant, RNase Away | Sigma-Aldrich | 83931 | Apply on glass/plasticware, wipe and rinse |
RNase inhibitor, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | Hazardous //// 1609-47-8 |
0.1 % DEPC suspension | Incubate 2 hr at 37 ˚C, then sterilize by autoclave | ||
SAMPLE PREPARATION | |||
Stereo Microscope, M60 | Leica | ||
1X PBS Buffer | |||
137 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
2.7 mM KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | 7447-40-7 |
10 mM Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | 7558-79-4 |
1.8 mM KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | 7778-77-0 |
RNA EXTRACTION/ANALYSIS | |||
UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
Gel Imager, ChemiDoc XRS+ | Biorad | 170-8265 | |
Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT | BioRad | 170-4487EDU | |
RNA extraction reagent, TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 | Hazardous |
PCA (25:24:1), 1:1 for extraction | Sigma-Aldrich | 77617 | 136112-00-0 |
Chlorophorm, 1:1 for extraction | Sigma-Aldrich | C2432 | 67-66-3 |
EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing | Sigma-Aldrich | 59844 | 64-17-5 |
Gene Ruler 1Kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0311 | |
Stop Mix | |||
300 mM NaOAc, pH 5.5 | Sigma-Aldrich | S2889 | 127-09-3 |
1x RSB Solution | |||
2% sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71736 | Never cool down SDS to avoid precipitation //// 151-21-3 |
2 mg/ml Proteinase K | Roche Applied Science | 0-3115828001 | EC 3.4.21.64 9 |
10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB) | |||
100 mM Tris-Cl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T5941 | 1185-53-1 |
100 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
30 mM MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | 7786-30-3 |
Denaturing Agarose Gel | |||
1.2% Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2 |
1x MOPS Buffer | Add when T < 60 ˚C | ||
3% formaldehayde | Sigma-Aldrich | F8775 | Hazardous. Add when T < 60 ˚C //// 50-00-0 |
10X MOPS Buffer | |||
0.2 M MOPS sodium salt, pH 7 | Sigma-Aldrich | M9381 | Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7 |
Agarose Loading Dye | |||
1x MOPS Buffer | |||
3% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Hazardous //// 50-00-0 |
50% formamide | Sigma-Aldrich | 47670 | Hazardous //// 75-12-7 |
Ethidium bromide (EtBr) 30 μg/ml | Sigma-Aldrich | E1510 | Hazardous //// 1239-45-8 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 115-39-9 |
SMALL RNA FRACTIONATION | |||
Flat gel loading tips | Life Technologies | LC1002 | |
Savant SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | DNA120 | |
Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | 165-8000 | |
Denaturing Acrilamide Gel | |||
10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1) | Sigma-Aldrich | A3449 | Hazardous. Let the gel polymerizefor 45 min before use |
1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer) | |||
7 M urea | Sigma-Aldrich | U6504 | 57-13-6 |
0.1% ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 215589 | 7727-54-0 |
0.1% TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | 110-18-9 |
Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step) | Thermo Scientific | SM1211 | Label 0.1 μg, as described in the "probe labeling" reaction |
Acrylamide Blue Dye | |||
50% formamide | Sigma-Aldrich | 47670 | Hazardous //// 75-12-7 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 115-39-9 |
Running Buffer (RB) | |||
1x MOPS Buffer | |||
Alternative RB: 1x TBE Buffer | |||
1x TBE Buffer | |||
5X TBE | |||
445 mM Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
445 mM boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | 10043-35-3 |
20 mM EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
Gel Staining Solution | |||
Ethidium bromide 0.5 μg/ml | Sigma-Aldrich | E1510 | Hazardous //// 1239-45-8 |
1x RB | Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr | ||
BLOTTING | |||
3MM Whatman paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | |
Neutral Nylon Membrane, Hybond NX | GE Healthcare Life Science | RPN203T | Photosensitive |
CROSSLINKING | |||
Crosslinking Solution (XLS) | |||
1% 1-methylimidazole (v/v) | Sigma-Aldrich | 336092 | Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7 |
12.5 mM HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | Hazardous //// 7647-01-0 |
3.1% EDC (w/v) | Sigma-Aldrich | 3450 | 25952-53-8 |
(PRE)-HYBRIDIZATION | |||
Liquid Scintillation Counter | Beckmann | LS 6500 | |
Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml | Life Technologies | AM9680 | |
rasi4 antisense probe | 5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3' | ||
5s-rRNA antisense probe | 5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3' | ||
Dmel-miR279 antisense probe | 5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3' | ||
Dmel-miR286 antisense probe | 5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3' | ||
Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns | GE Healthcare Life Science | 27-5325-01 | |
(Pre)-Hybridization Solution (HS) | |||
6x SSPE | Pre-warm HS at 37 ˚C before use | ||
0.5% SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | 151-21-3 |
5x Denhardt's Solution | |||
20X SSPE | |||
3.6 M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
0.2 M sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | 7601-54-9 |
20 mM EDTA (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
50x Denhardt's Solution | |||
1% Ficoll 400 (w/v) | Sigma-Aldrich | F2637 | 26873-85-8 |
1% Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | 9003-39-8 |
1% BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | 9048-46-8 |
1X TEN Buffer | |||
10 mM Tris-Cl (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
100 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
1 mM EDTA (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
Probe Labelling | |||
0.4 μM oligonucleotide | |||
1.5 μl Ci/μl [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG002A | Hazardous //// 51963-61-2 |
1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer | Biolabs | B0201 | |
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/μl | Biolabs | M0201 | EC 2.7.1.78 |
30 min at 37 ˚C, stop by 20 mM EDTA | |||
WASHING | |||
Geiger Mueller Detectors | Canberra Industries | MCB2/CPS – EM77021 | |
Washing Buffer (WB), 2x SSPE | |||
Stringent Washing Buffers | |||
0.2x SSPE | |||
2x SSPE, 0.5% SDS | |||
0.2x SSPE, 0.5% SDS | |||
SIGNAL DETECTION | |||
PharosFX Plus System | Biorad | 170-9460 | |
Image J | Freely available | ||
Quantity One | Biorad | ||
X-ray films , BioMax XAR | Sigma-Aldrich | F5888 | Photosensitive |
Developer for X-ray films | Sigma-Aldrich | P7042 | |
Fixer for X-ray films | Sigma-Aldrich | P7167 | |
STRIPPING | |||
Stripping Solution | |||
10 mM Tris-HCl pH 8.8 | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
5 mM EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
0.1% SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3 |