छोटे आरएनए प्रजाति के उत्तरी ब्लाट पता लगाने में बढ़ी<em> ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em
Summary
इस प्रकाशन का उद्देश्य कल्पना और ड्रोसोफिला से निकाले शाही सेना पर एक बढ़ाया उत्तरी ब्लाट प्रोटोकॉल का ऑपरेटिव कदम पर चर्चा भ्रूण कोशिकाओं और ऊतकों मेलानोगास्टर है. इस प्रोटोकॉल छोटे आरएनए प्रजातियों के कुशल पता लगाने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है.
Abstract
पिछले दशकों आरएनए स्तर पर जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण तंत्र के आसपास वैज्ञानिक ब्याज के विस्फोट देखा है. आणविक जीव विज्ञान की इस शाखा को काफी बाद के ट्रांसक्रिप्शनल नियमन में प्रमुख खिलाड़ी के रूप में RNAs noncoding की खोज के द्वारा ईंधन की गई है. इस तरह के एक क्रांतिकारी नजरिए उच्च throughput स्तर (जीनोम चौड़ा पहचान) पर या एकल उम्मीदवार विश्लेषण (विशिष्ट प्रजातियों के स्थिर राज्य संचय) के रूप में दोनों के साथ और कम RNAs अभिव्यक्ति की रूपरेखा के लिए शक्तिशाली प्रौद्योगिकियों के विकास के द्वारा शुरू किया गया है. कई राज्य के कला रणनीतियों dosing या इस तरह भागने अणुओं दृश्यमान करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध हैं, उत्तरी ब्लाट परख शाही सेना अभिव्यक्ति की तत्काल और सही मूल्यांकन के लिए आणविक जीव विज्ञान में पात्र दृष्टिकोण रहता है. यह कई मामलों में और अधिक परिष्कृत, महंगा प्रौद्योगिकियों और, के आवेदन की ओर एक पहला कदम है, आसानी से समझ प्राप्त करने का एक तरजीही विधि रहता प्रतिनिधित्व करता हैशाही सेना जीव विज्ञान में. यहाँ हम स्वयं लार्वा / वयस्क ऊतकों विच्छेदित या इन विट्रो संवर्धित कोशिकाओं में, पूरे भ्रूण मेलानोगास्टर ड्रोसोफिला से कमजोर व्यक्त microRNAs (या अन्य छोटे विनियामक आरएनए प्रजाति) का पता लगाने के लिए (उत्तरी ब्लाट बढ़ाया) एक कुशल प्रोटोकॉल अवलोकन. शाही सेना का एक बहुत ही सीमित मात्रा में आवश्यक और cytometry पृथक कोशिकाओं किया जा सकता है प्रवाह से सामग्री का उपयोग भी परिकल्पना की गई है.
Introduction
शाही सेना बायोकैमिस्ट्री पिछले साल 1 में शानदार प्रगति का अनुभव किया है. जीन अभिव्यक्ति के नियंत्रण में शाही सेना के संभावित की हमारी समझ उपन्यास आरएनए आधारित विनियामक तंत्र 3,4 की खोज से और पहले से ही जाना जाता है के बाद ट्रांसक्रिप्शनल घटनाओं का गहरा लक्षण वर्णन द्वारा, शक्तिशाली noncoding RIBO-नियामकों 2 की पहचान से फट गया है 5. सभी एक साथ इन अध्ययनों की अनुमति दी है आरएनए जीव विज्ञान में नाटकीय रूप से वर्तमान वैज्ञानिक परिदृश्य में एक प्रमुख अनुसंधान विषय बनता जा रहा है, दृश्य बनाने के लिए. विशेष रूप से, हाल के वर्षों में हम आणविक तंत्रिका जीव विज्ञान 6, आधुनिक जीवन विज्ञान के क्षेत्र में सबसे गतिशील अनुसंधान डोमेन में से एक पर 'शाही सेना दुनिया "के व्यापक प्रभाव की भावना हो रही है. पिछली सदी के अंतिम दशक में, समग्र वैज्ञानिक परिदृश्य आरएनए हस्तक्षेप 7,8 की खोज से और छोटे विनियामक RNAs 9,10 के क्र ांतिकारी परिवर्तन किया गया हैmicroRNAs 11 को विशेष संबंध, endogenously जीन अभिव्यक्ति की pleiotropic और मिश्रित नियामकों के रूप में लगभग सभी सेलुलर कार्यों के नियंत्रण में फंसा छोटे noncoding RNAs व्यक्त किया.
MiRNAs की उच्च संख्या ड्रोसोफिला में और साथ ही साथ 12-15 मानव कोशिकाओं में पहचान की गई है, जब लगभग 10 साल AMBROS और Ruvkun प्रयोगशालाओं द्वारा Caenorhabditis एलिगेंस में miRNA प्रारंभिक खोज के बाद, नए सिरे से ध्यान क्षेत्र में बदल गया था. तब से, बहुमुखी ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण के लिए धन्यवाद, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर miRNA जैवसंश्लेषण और गतिविधि में delving के लिए एक मूल्यवान जैविक संदर्भ के रूप में बाहर खड़ा हो गया है. ड्रोसोफिला miRNAs रास्ते, चयापचय को उम्र बढ़ने के संकेत से फैले, कीट विशिष्ट या evolutionarily संरक्षित प्रक्रियाओं में विशिष्ट कार्यों से पता चला है , व्यवहार और, ज़ाहिर है, न्यूरोजेनेसिस. इस दिशा के साथ, हम हाल ही पेचीदा सह में एक उपन्यास कड़ी 16 अनावरणमास्टर जीन GCM / सरकना और आरएनए मार्ग के बीच होने वाली rrelation. मक्खी प्रतिलेखन कारक GCM / ग्लाइड 17-19 multipotent में glial बनाम न्यूरोनल भाग्य पसंद तंत्रिका व्यापारियों 20 मक्खी पैदा करती है जो सेल भाग्य निर्धारक, का एक अनूठा उदाहरण का गठन किया. बीस साल इस विषय पर लंबे समय से शोध GCM / पर converging जीन अभिव्यक्ति विनियमन के कई और अतिव्यापी आदानों की घटना तंत्रिका विकास के दौरान neuronal और glial समकक्षों के बीच नाजुक अनुपात में संतुलन के लिए आवश्यक दहलीज स्तर स्थापित करने के लिए 21-28 सरकना रेखांकित स्पष्ट रूप से किया गया है.
हम Dmel-miR279 लक्ष्यीकरण के माध्यम से उस विनियमन GCM के बाद ट्रांसक्रिप्शनल ठीक ट्यूनिंग / अभिव्यक्ति 16 सरकना करने के लिए योगदान एक और नियंत्रण के स्तर का प्रतिनिधित्व करता है की खोज की. विश्व स्तर पर, इन अनुसंधान लाइनों की आवश्यकता है विशिष्ट पद्धति सुधार: वर्षों के साथ, कई प्रौद्योगिकियों मूल पारं का विश्लेषण करने के लिए विकसितitional RNAs तरह, छोटे गैर कोडन RNAs बढ़ाता के लिए बदल दिया गया है RNase संरक्षण assays, सीडीएनए सरणियों 29-31, वास्तविक समय पीसीआर तरीकों 32-35 और 36,37 अनुक्रमण के रूप में. दूसरी ओर, तकनीकी दृष्टिकोण के recalibration क्षेत्र में निरंतर प्रगति को बढ़ावा दिया है.
उत्तरी ब्लाट परख (नो, या आरएनए जेल धब्बा परख) एक प्रतिनिधि उदाहरण का गठन: यह आकार दृढ़ संकल्प के साथ ही दोनों अभिव्यक्ति स्तर quantitation सुनिश्चित करता है के बाद से यह काफी हद तक, आरएनए संचय प्रोफ़ाइल में कार्यरत है. हालांकि, विधि के आंतरिक गरीब संवेदनशीलता यह कम RNAs तरह, कम प्रचुर मात्रा में जीन अभिव्यक्ति ठीक ट्यूनर के लिए लागू किया जा रहा है जब सीमित है. एक हानिकारक परिणाम विशिष्ट जैविक नमूने के लिए मुश्किल अपने आवेदन में आता है, जो कुल शाही सेना, की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है. इस तरह के कारणों, छोटे RNAs का पता लगाने के लिए विशिष्ट नायब वेरिएंट के लिए 38-40 विकसित किया गया है: हम एक बेहतर नायब proc का फायदा उठायाedure 41 (ENB, बढ़ी उत्तरी ब्लाट), Dmel-miR279 और GCM / ग्लाइड बीच उपरोक्त परस्पर क्रिया elucidating है.
यह विधि एक Carbodiimide व्युत्पन्न की गतिविधि के आधार पर एक रासायनिक crosslinking कदम पर निर्भर करता है [1-एथिल-3 (3 dimethylaminopropyl) carbodiimide, ईडीसी] ठोस समर्थन पर न्यूक्लिक एसिड को ठीक करने के लिए. Carbodiimide सक्रिय carboxyl या फॉस्फेट समूहों और amine समूहों के बीच 42 एमाइड बांड के गठन को उत्प्रेरित करने के लिए जाना जाता है एक बहुमुखी पार linker है. यह गुण नायलॉन झिल्ली की सतह पर समूहों एमिनो उनके मोनो phosphorylated 5'-हाइड्रॉक्सिल समूह के माध्यम से covalently जोड़ी छोटे RNAs के लिए इस्तेमाल किया जा सकता. परिणामस्वरूप लगाव विन्यास, बारी में, उल्लेखनीय पता लगाने वृद्धि 43 में जो परिणाम जांच लक्ष्य संकरण की दक्षता स्थिर न्यूक्लिक एसिड की पहुंच बढ़ जाती है और.
तकनीक विशेष relevanc मानता हैड्रोसोफिला आणविक पढ़ाई में ई, जिसके द्वारा छोटे noncoding RNAs के उपन्यास और विशिष्ट वर्गों की घटना के 44 में उभर रहा है. इन के अलावा, 45,46 अनुक्रम विशिष्ट जीन मुंह बंद में शामिल piwi बातचीत RNAs (piRNAs 47), की एक विशिष्ट उप प्रकार का गठन rasiRNAs. इस विधि का ऑपरेटिव विवरण पूरी तरह से वर्णित और एक rasiRNA, rasi4 की, पहली बार, microRNAs Dmel-miR279 और Dmel-miR286 के विश्लेषण के सापेक्ष और, बाद में कल्पना कर रहे हैं. हम आरएनए (कम से कम 1 ग्राम) की न्यूनतम मात्रा से खराब व्यक्त लक्ष्य खुलासा हमें अनुमति दी है जो इस पद्धति, चरम पर धकेल दिया.
Protocol
Representative Results
Discussion
शाही सेना न्यूरोजेनेसिस को नियंत्रित करता है, जिसके माध्यम से intertwining मिलावट की हमारी प्रशंसा लगातार बढ़ती जा रही है हालांकि, तंत्रिका स्टेम कोशिका जीव विज्ञान, neuronal भेदभाव / कार्यात्मक एकीकरण, तंत्रिका व…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के संस्थान नेशनल डे ला Sante एट डी ला Recherche MEDICALE द्वारा समर्थित किया गया था, केंद्र में राष्ट्रीय डी ला Recherche Scientifique, Université डी स्ट्रासबर्ग, Hôpital डे स्ट्रासबर्ग, एसोसिएशन डालना ला Recherche सुर ले कैंसर, संस्थान नेशनल डु कैंसर, एजेंस नेशनल डी ला Recherche और क्षेत्र Alsace.
पिएत्रो LaNeve ला Recherche MEDICALE Fondation द्वारा डालना समर्थन किया गया है. वर्तमान में, वह एक Istituto Italiano Tecnologia (आईआईटी) फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है. प्रकाशन लागत Neurex नेटवर्क के द्वारा समर्थित हैं (TriNeuron – कार्यक्रम Interreg चतुर्थ अपर राइन)
Materials
| FINAL COMPOSITION/NAME | COMPANY | CATALOGUE (Stock) | COMMENTS |
| GENERAL REQUIREMENT | |||
| Centrifuge, 5418 | Eppendorf | 5418 000.017 | |
| Decontaminant, RNase Away | Sigma-Aldrich | 83931 | Apply on glass/plasticware, wipe and rinse |
| RNase inhibitor, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | Hazardous //// 1609-47-8 |
| 0.1 % DEPC suspension | Incubate 2 hr at 37 ˚C, then sterilize by autoclave | ||
| SAMPLE PREPARATION | |||
| Stereo Microscope, M60 | Leica | ||
| 1X PBS Buffer | |||
| 137 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
| 2.7 mM KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | 7447-40-7 |
| 10 mM Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | 7558-79-4 |
| 1.8 mM KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | 7778-77-0 |
| RNA EXTRACTION/ANALYSIS | |||
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Gel Imager, ChemiDoc XRS+ | Biorad | 170-8265 | |
| Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT | BioRad | 170-4487EDU | |
| RNA extraction reagent, TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 | Hazardous |
| PCA (25:24:1), 1:1 for extraction | Sigma-Aldrich | 77617 | 136112-00-0 |
| Chlorophorm, 1:1 for extraction | Sigma-Aldrich | C2432 | 67-66-3 |
| EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing | Sigma-Aldrich | 59844 | 64-17-5 |
| Gene Ruler 1Kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0311 | |
| Stop Mix | |||
| 300 mM NaOAc, pH 5.5 | Sigma-Aldrich | S2889 | 127-09-3 |
| 1x RSB Solution | |||
| 2% sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71736 | Never cool down SDS to avoid precipitation //// 151-21-3 |
| 2 mg/ml Proteinase K | Roche Applied Science | 0-3115828001 | EC 3.4.21.64 9 |
| 10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB) | |||
| 100 mM Tris-Cl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T5941 | 1185-53-1 |
| 100 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
| 30 mM MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | 7786-30-3 |
| Denaturing Agarose Gel | |||
| 1.2% Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2 |
| 1x MOPS Buffer | Add when T < 60 ˚C | ||
| 3% formaldehayde | Sigma-Aldrich | F8775 | Hazardous. Add when T < 60 ˚C //// 50-00-0 |
| 10X MOPS Buffer | |||
| 0.2 M MOPS sodium salt, pH 7 | Sigma-Aldrich | M9381 | Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7 |
| Agarose Loading Dye | |||
| 1x MOPS Buffer | |||
| 3% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Hazardous //// 50-00-0 |
| 50% formamide | Sigma-Aldrich | 47670 | Hazardous //// 75-12-7 |
| Ethidium bromide (EtBr) 30 μg/ml | Sigma-Aldrich | E1510 | Hazardous //// 1239-45-8 |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 115-39-9 |
| SMALL RNA FRACTIONATION | |||
| Flat gel loading tips | Life Technologies | LC1002 | |
| Savant SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | DNA120 | |
| Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | 165-8000 | |
| Denaturing Acrilamide Gel | |||
| 10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1) | Sigma-Aldrich | A3449 | Hazardous. Let the gel polymerizefor 45 min before use |
| 1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer) | |||
| 7 M urea | Sigma-Aldrich | U6504 | 57-13-6 |
| 0.1% ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 215589 | 7727-54-0 |
| 0.1% TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | 110-18-9 |
| Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step) | Thermo Scientific | SM1211 | Label 0.1 μg, as described in the "probe labeling" reaction |
| Acrylamide Blue Dye | |||
| 50% formamide | Sigma-Aldrich | 47670 | Hazardous //// 75-12-7 |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 115-39-9 |
| Running Buffer (RB) | |||
| 1x MOPS Buffer | |||
| Alternative RB: 1x TBE Buffer | |||
| 1x TBE Buffer | |||
| 5X TBE | |||
| 445 mM Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
| 445 mM boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | 10043-35-3 |
| 20 mM EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
| Gel Staining Solution | |||
| Ethidium bromide 0.5 μg/ml | Sigma-Aldrich | E1510 | Hazardous //// 1239-45-8 |
| 1x RB | Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr | ||
| BLOTTING | |||
| 3MM Whatman paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | |
| Neutral Nylon Membrane, Hybond NX | GE Healthcare Life Science | RPN203T | Photosensitive |
| CROSSLINKING | |||
| Crosslinking Solution (XLS) | |||
| 1% 1-methylimidazole (v/v) | Sigma-Aldrich | 336092 | Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7 |
| 12.5 mM HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | Hazardous //// 7647-01-0 |
| 3.1% EDC (w/v) | Sigma-Aldrich | 3450 | 25952-53-8 |
| (PRE)-HYBRIDIZATION | |||
| Liquid Scintillation Counter | Beckmann | LS 6500 | |
| Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml | Life Technologies | AM9680 | |
| rasi4 antisense probe | 5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3' | ||
| 5s-rRNA antisense probe | 5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3' | ||
| Dmel-miR279 antisense probe | 5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3' | ||
| Dmel-miR286 antisense probe | 5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3' | ||
| Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns | GE Healthcare Life Science | 27-5325-01 | |
| (Pre)-Hybridization Solution (HS) | |||
| 6x SSPE | Pre-warm HS at 37 ˚C before use | ||
| 0.5% SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | 151-21-3 |
| 5x Denhardt's Solution | |||
| 20X SSPE | |||
| 3.6 M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
| 0.2 M sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | 7601-54-9 |
| 20 mM EDTA (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
| 50x Denhardt's Solution | |||
| 1% Ficoll 400 (w/v) | Sigma-Aldrich | F2637 | 26873-85-8 |
| 1% Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | 9003-39-8 |
| 1% BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | 9048-46-8 |
| 1X TEN Buffer | |||
| 10 mM Tris-Cl (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
| 100 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
| 1 mM EDTA (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
| Probe Labelling | |||
| 0.4 μM oligonucleotide | |||
| 1.5 μl Ci/μl [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG002A | Hazardous //// 51963-61-2 |
| 1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer | Biolabs | B0201 | |
| T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/μl | Biolabs | M0201 | EC 2.7.1.78 |
| 30 min at 37 ˚C, stop by 20 mM EDTA | |||
| WASHING | |||
| Geiger Mueller Detectors | Canberra Industries | MCB2/CPS – EM77021 | |
| Washing Buffer (WB), 2x SSPE | |||
| Stringent Washing Buffers | |||
| 0.2x SSPE | |||
| 2x SSPE, 0.5% SDS | |||
| 0.2x SSPE, 0.5% SDS | |||
| SIGNAL DETECTION | |||
| PharosFX Plus System | Biorad | 170-9460 | |
| Image J | Freely available | ||
| Quantity One | Biorad | ||
| X-ray films , BioMax XAR | Sigma-Aldrich | F5888 | Photosensitive |
| Developer for X-ray films | Sigma-Aldrich | P7042 | |
| Fixer for X-ray films | Sigma-Aldrich | P7167 | |
| STRIPPING | |||
| Stripping Solution | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8.8 | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
| 5 mM EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
| 0.1% SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3 |
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