Målet med denne publikasjonen er å visualisere og diskutere de operative trinnene i en Enhanced Northern Blot protokollen på RNA hentet fra Drosophila melanogaster embryoer, celler og vev. Denne protokollen er spesielt nyttig for effektiv detektering av små RNA-arter.
De siste tiårene har vært vitne til eksplosjonen av vitenskapelig interesse rundt genuttrykk kontrollmekanismer på RNA-nivå. Denne grenen av molekylærbiologi har vært sterkt drevet av oppdagelsen av ikke-kodende RNA som store aktører i post-transcriptional regulering. Slik revolusjonerende perspektiv har vært ledsaget og utløst av utviklingen av kraftige teknologier for profilering kort RNA uttrykk, både på high-throughput nivå (genom-wide identifikasjon) eller som enkelt kandidat analyse (steady state akkumulering av spesifikke arter). Selv om flere state-of-art strategier er for tiden tilgjengelig for dosering eller visualisere slike flyktet molekyler, forblir Northern Blot analysen den kvalifiserte tilnærming i molekylærbiologi for umiddelbar og nøyaktig vurdering av RNA uttrykk. Det representerer et første skritt mot bruk av mer avanserte, kostbare teknologier og, i mange tilfeller, forblir en fortrinnsrett metode for enkelt å få innsikti RNA biologi. Her oversikten vi en effektiv protokoll (Enhanced Northern Blot) for å påvise svakt uttrykt micrornas (eller andre små regulatoriske RNA arter) fra Drosophila melanogaster hele embryoer, manuelt dissekert larver / voksen vev eller in vitro dyrkede celler. En meget begrenset mengde av RNA er nødvendig, og bruken av materiale fra flowcytometri-isolerte celler kan også tenkes.
RNA biokjemi har opplevd spektakulære utvikler de siste årene en. Vår forståelse av RNA potensial i kontroll av genekspresjon er sprengt ved identifisering av effektive ikke-kodende ribo-regulatorer 2, av oppdagelsen av nye RNA-baserte regulatoriske mekanismer 3,4 og ved en dypere karakterisering av allerede kjente post-transkripsjonelle arrangementer 5. Alle sammen disse studiene har tillatt RNA biologi å dramatisk gjøre scenen, blir et stort forsknings emne i dagens vitenskapelige landskapet. Spesielt de siste årene får vi en følelse av gjennomgripende påvirkning av "RNA verden" på molekylær nevrobiologi 6, en av de mest dynamiske forsknings domener i moderne life science. I det siste tiåret av forrige århundre, har den samlede vitenskapelige scenario blitt revolusjonert av oppdagelsen av RNA-interferens 7,8 og av de små regulatoriske RNA 9,10med særlig hensyn til micrornas 11, endogent uttrykt små ikke-kodende RNA er implisert i kontrollen av nesten alle cellulære funksjoner som mitogen og kombinatoriske regulatorer av genekspresjon.
Nesten 10 år etter at miRNA første oppdagelsen i Caenorhabditis elegans med Ambros og Ruvkun laboratorier, ble fornyet oppmerksomhet slått til feltet når høyt antall mirnas ble identifisert i Drosophila og i humane celler samt 12-15. Siden da, takket være allsidige transgene nærmer seg, har Drosophila melanogaster sto ut som et verdifullt biologisk kontekst for hulene i miRNA biosyntese og aktivitet. Drosophila mirnas har avdekket distinkte funksjoner i insekt-spesifikke eller evolusjonært konserverte prosesser, som spenner fra aldring til metabolisme, signalveier , oppførsel og, selvfølgelig, nevrogenesen. Langs denne retningen, vi nylig avduket en roman kobling 16 i den spennende correlation oppstår mellom master genet GCM / gli og RNA sti. Flua transkripsjonsfaktor GCM / Glide 17-19 utgjør et unikt eksempel på celle skjebne determinant, som dikterer glial vs nevronale skjebne valg i multipotent fly nevrale forløpere 20. Tjue år lang forskning på dette temaet har tydelig understreket forekomsten av flere og overlappende tilførsler av genuttrykk regulering konvergerende løpet GCM / glir 21-28 å etablere terskelnivå for å balansere den delikate forholdet mellom nevronale og glial kolleger under nevral utvikling.
Vi oppdaget at regulering via DMEL-miR279 målretting representerer en ytterligere kontrollnivå bidrar til post-transcriptional finjustering av GCM / glir uttrykk 16. Globalt har disse forsknings linjer som kreves konkrete metodiske forbedringer: langs år, flere teknologier opprinnelig utviklet for å analysere traditional RNA har blitt konvertert for å kvantifisere små ikkekodende RNA, som som RNase beskyttelse analyser, cDNA arrays 29-31, real-time PCR-metoder 32-35 og sekvenser 36,37. På den andre siden, har kalibrering av tekniske tilnærminger fostret kontinuerlige utvikler i felten.
Northern blot-analyse (NB, eller RNA gel blot-analyse) utgjør et representativt eksempel: det er i stor grad anvendt for å profilere RNA-akkumulering, siden den sikrer både uttrykket nivået kvantifisering samt størrelsen bestemmelse. Imidlertid er den iboende dårlig sensitivitet for metoden begrensende når det skal anvendes til lav-rike genekspresjon fin-mottakere, slik som korte RNA. En ugunstig konsekvens er kravet om store mengder av total-RNA, som gjør vanskelig dens anvendelse til spesifikke biologiske prøver. Av slike grunner, spesifikke NB varianter for små RNA deteksjon er utviklet 38-40: vi tok fordel av en forbedret NB procedure 41 (ENB, Enhanced Northern Blot), mens belyse ovennevnte samspillet mellom DMEL-miR279 og GCM / glid.
Denne fremgangsmåte er avhengig av en kjemisk kryssbindingstrinn basert på aktiviteten av et karbodiimid-derivat [1-etyl-3 (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid, EDC] for å feste nukleinsyren til faste bærere. Karbodiimid er et allsidig kryssbindings kjent for å katalysere dannelsen av amidbindinger mellom aktiverte karboksyl-eller fosfat-grupper og amingrupper 42. Denne egenskapen kan utnyttes for å kovalent par små RNAer via deres mono-fosforylert 5'-hydroksylgruppen til aminogrupper på overflaten av nylonmembraner. Det resulterende feste konfigurasjon øker tilgjengeligheten av den immobiliserte nukleinsyre og, i sin tur, effektiviteten av probe-target-hybridisering, som resulterer i påvisning bemerkelsesverdig forbedring 43.
Teknikken foruts bestemt relevance i Drosophila molekylære studier, der forekomsten av nye og særegne klasser av små ikke-kodende RNA fremstår 44. Blant disse rasirnas 45,46 utgjør en bestemt subtype av piwi-samspill RNA (piRNAs 47), som er involvert i sekvens-spesifikke genet demping. Operative detaljer ved denne metoden er fullstendig beskrevet i det følgende og visualisert, i forhold til analysen av micrornas DMEL-miR279 og DMEL-miR286 og, for første gang, på en rasiRNA, rasi4. Vi satt på spissen denne metoden, som tillot oss å avsløre dårlig uttrykt mål fra minimale mengder RNA (mindre enn 1 mikrogram).
Selv om vår forståelse av sofistikert sammenflettingen der RNA regulerer neurogenesis er stadig økende, mekanistiske implikasjonene av RNA-baserte kretser påvirker nevrale stamcellebiologi, neuronal differensiering / funksjonell integrasjon, utvikling av nevrale sykdommer og kreft forbli uutforsket. Vedlikehold av slike nettverk gjennom riker gjør potensialet av genetiske systemer som Drosophila melanogaster instrumental å rakne uutforskede cellulære trasé, der kort ikke-kodende RNA og transkripsjonsfak…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE, den Centre National de la Recherche Scientifique, Université de Strasbourg, den Hôpital de Strasbourg, Association pour la Recherche sur le Cancer, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche og regionen Alsace.
Pietro Laneve har vært støttet av Fondation pour la Recherche MEDICALE. For tiden er han en mottaker av en Istituto Italiano Tecnologia (IIT) fellesskap. Publiseringskostnadene støttes av Neurex nettverk (TriNeuron – Program Interreg IV Øvre Rhinen)
FINAL COMPOSITION/NAME | COMPANY | CATALOGUE (Stock) | COMMENTS |
GENERAL REQUIREMENT | |||
Centrifuge, 5418 | Eppendorf | 5418 000.017 | |
Decontaminant, RNase Away | Sigma-Aldrich | 83931 | Apply on glass/plasticware, wipe and rinse |
RNase inhibitor, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | Hazardous //// 1609-47-8 |
0.1 % DEPC suspension | Incubate 2 hr at 37 ˚C, then sterilize by autoclave | ||
SAMPLE PREPARATION | |||
Stereo Microscope, M60 | Leica | ||
1X PBS Buffer | |||
137 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
2.7 mM KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | 7447-40-7 |
10 mM Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | 7558-79-4 |
1.8 mM KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | 7778-77-0 |
RNA EXTRACTION/ANALYSIS | |||
UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
Gel Imager, ChemiDoc XRS+ | Biorad | 170-8265 | |
Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT | BioRad | 170-4487EDU | |
RNA extraction reagent, TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 | Hazardous |
PCA (25:24:1), 1:1 for extraction | Sigma-Aldrich | 77617 | 136112-00-0 |
Chlorophorm, 1:1 for extraction | Sigma-Aldrich | C2432 | 67-66-3 |
EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing | Sigma-Aldrich | 59844 | 64-17-5 |
Gene Ruler 1Kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0311 | |
Stop Mix | |||
300 mM NaOAc, pH 5.5 | Sigma-Aldrich | S2889 | 127-09-3 |
1x RSB Solution | |||
2% sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71736 | Never cool down SDS to avoid precipitation //// 151-21-3 |
2 mg/ml Proteinase K | Roche Applied Science | 0-3115828001 | EC 3.4.21.64 9 |
10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB) | |||
100 mM Tris-Cl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T5941 | 1185-53-1 |
100 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
30 mM MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | 7786-30-3 |
Denaturing Agarose Gel | |||
1.2% Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2 |
1x MOPS Buffer | Add when T < 60 ˚C | ||
3% formaldehayde | Sigma-Aldrich | F8775 | Hazardous. Add when T < 60 ˚C //// 50-00-0 |
10X MOPS Buffer | |||
0.2 M MOPS sodium salt, pH 7 | Sigma-Aldrich | M9381 | Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7 |
Agarose Loading Dye | |||
1x MOPS Buffer | |||
3% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Hazardous //// 50-00-0 |
50% formamide | Sigma-Aldrich | 47670 | Hazardous //// 75-12-7 |
Ethidium bromide (EtBr) 30 μg/ml | Sigma-Aldrich | E1510 | Hazardous //// 1239-45-8 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 115-39-9 |
SMALL RNA FRACTIONATION | |||
Flat gel loading tips | Life Technologies | LC1002 | |
Savant SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | DNA120 | |
Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | 165-8000 | |
Denaturing Acrilamide Gel | |||
10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1) | Sigma-Aldrich | A3449 | Hazardous. Let the gel polymerizefor 45 min before use |
1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer) | |||
7 M urea | Sigma-Aldrich | U6504 | 57-13-6 |
0.1% ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 215589 | 7727-54-0 |
0.1% TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | 110-18-9 |
Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step) | Thermo Scientific | SM1211 | Label 0.1 μg, as described in the "probe labeling" reaction |
Acrylamide Blue Dye | |||
50% formamide | Sigma-Aldrich | 47670 | Hazardous //// 75-12-7 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 115-39-9 |
Running Buffer (RB) | |||
1x MOPS Buffer | |||
Alternative RB: 1x TBE Buffer | |||
1x TBE Buffer | |||
5X TBE | |||
445 mM Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
445 mM boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | 10043-35-3 |
20 mM EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
Gel Staining Solution | |||
Ethidium bromide 0.5 μg/ml | Sigma-Aldrich | E1510 | Hazardous //// 1239-45-8 |
1x RB | Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr | ||
BLOTTING | |||
3MM Whatman paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | |
Neutral Nylon Membrane, Hybond NX | GE Healthcare Life Science | RPN203T | Photosensitive |
CROSSLINKING | |||
Crosslinking Solution (XLS) | |||
1% 1-methylimidazole (v/v) | Sigma-Aldrich | 336092 | Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7 |
12.5 mM HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | Hazardous //// 7647-01-0 |
3.1% EDC (w/v) | Sigma-Aldrich | 3450 | 25952-53-8 |
(PRE)-HYBRIDIZATION | |||
Liquid Scintillation Counter | Beckmann | LS 6500 | |
Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml | Life Technologies | AM9680 | |
rasi4 antisense probe | 5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3' | ||
5s-rRNA antisense probe | 5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3' | ||
Dmel-miR279 antisense probe | 5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3' | ||
Dmel-miR286 antisense probe | 5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3' | ||
Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns | GE Healthcare Life Science | 27-5325-01 | |
(Pre)-Hybridization Solution (HS) | |||
6x SSPE | Pre-warm HS at 37 ˚C before use | ||
0.5% SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | 151-21-3 |
5x Denhardt's Solution | |||
20X SSPE | |||
3.6 M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
0.2 M sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | 7601-54-9 |
20 mM EDTA (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
50x Denhardt's Solution | |||
1% Ficoll 400 (w/v) | Sigma-Aldrich | F2637 | 26873-85-8 |
1% Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | 9003-39-8 |
1% BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | 9048-46-8 |
1X TEN Buffer | |||
10 mM Tris-Cl (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
100 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
1 mM EDTA (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
Probe Labelling | |||
0.4 μM oligonucleotide | |||
1.5 μl Ci/μl [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG002A | Hazardous //// 51963-61-2 |
1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer | Biolabs | B0201 | |
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/μl | Biolabs | M0201 | EC 2.7.1.78 |
30 min at 37 ˚C, stop by 20 mM EDTA | |||
WASHING | |||
Geiger Mueller Detectors | Canberra Industries | MCB2/CPS – EM77021 | |
Washing Buffer (WB), 2x SSPE | |||
Stringent Washing Buffers | |||
0.2x SSPE | |||
2x SSPE, 0.5% SDS | |||
0.2x SSPE, 0.5% SDS | |||
SIGNAL DETECTION | |||
PharosFX Plus System | Biorad | 170-9460 | |
Image J | Freely available | ||
Quantity One | Biorad | ||
X-ray films , BioMax XAR | Sigma-Aldrich | F5888 | Photosensitive |
Developer for X-ray films | Sigma-Aldrich | P7042 | |
Fixer for X-ray films | Sigma-Aldrich | P7167 | |
STRIPPING | |||
Stripping Solution | |||
10 mM Tris-HCl pH 8.8 | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
5 mM EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
0.1% SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3 |