El objetivo de esta publicación es visualizar y discutir los pasos operativos de un protocolo de transferencia Northern mejorada en el ARN extraído de Drosophila melanogaster embriones, células y tejidos. Este protocolo es particularmente útil para la detección eficiente de pequeñas especies de ARN.
Las últimas décadas han sido testigos de la explosión del interés científico en torno a los mecanismos de control de la expresión génica a nivel de ARN. Esta rama de la biología molecular ha sido impulsado en gran medida por el descubrimiento de los ARN no codificantes como actores importantes en la regulación post-transcripcional. Tal perspectiva revolucionaria ha estado acompañada y provocada por el desarrollo de tecnologías de gran alcance para crear perfiles de expresión de ARN corto, tanto a nivel de alto rendimiento (identificación de todo el genoma) o como análisis de candidato único (acumulación de estado estacionario de las diferentes especies). Aunque varias estrategias estado-de-arte están disponibles actualmente para la dosificación o la visualización de dichas moléculas que huyen, ensayo de transferencia Northern sigue siendo el enfoque elegibles en biología molecular para la evaluación inmediata y precisa de la expresión del ARN. Representa un primer paso hacia la aplicación de las tecnologías más sofisticadas, costosas y, en muchos casos, sigue siendo un método preferencial para ganar fácilmente ideasen la biología de ARN. Aquí repasamos un protocolo eficiente (Enhanced Northern Blot) para detectar microRNAs débilmente expresadas (u otras especies de pequeños ARN de regulación) de Drosophila melanogaster embriones enteros, diseccionó manualmente tejidos / adultos o larvas en células cultivadas in vitro. Se requiere una cantidad muy limitada de ARN y el uso de material de flujo de células aisladas citometría-pueden ser también considerada.
ARN bioquímica ha experimentado avances espectaculares en los últimos años 1. Nuestra comprensión de ARN potencial en el control de la expresión génica ha sido estallar por la identificación de potentes reguladores no codificantes ribo-2, por el descubrimiento de nuevos mecanismos de regulación basados en ARN 3,4 y por una caracterización más profunda de eventos post-transcripcional ya conocidos 5. Toda la biología del ARN en conjunto estos estudios han permitido hacer de manera espectacular la escena, convirtiéndose en un importante tema de investigación en el actual panorama científico. En particular, en los últimos años estamos consiguiendo un sentido de los efectos generalizados del "mundo ARN" en la neurobiología molecular 6, uno de los campos de investigación más dinámicas de ciencias de la vida moderna. En la última década del siglo pasado, el escenario científico en general se ha visto revolucionado por el descubrimiento de la interferencia de ARN 7,8 y de los pequeños RNAs reguladores 9,10con especial atención a microRNAs 11, expresado endógenamente pequeños RNAs no codificantes implicadas en el control de casi todas las funciones celulares como reguladores pleiotrópicos y combinatorias de la expresión génica.
Casi 10 años después de miARN descubrimiento inicial en Caenorhabditis elegans por Ambros y laboratorios de Ruvkun, renovada atención se volvió hacia el campo cuando se identificaron un gran número de miRNAs en Drosophila y en las células humanas, así 12-15. Desde entonces, gracias a los métodos transgénicos versátiles, Drosophila melanogaster se ha destacado como un contexto biológico valioso para profundizar en la biosíntesis y la actividad de los genes miARN. Drosophila miRNAs han revelado distintas funciones en los procesos de insectos específicos o conservadas evolutivamente, que abarca desde el envejecimiento para el metabolismo, las vías de señalización , el comportamiento y, por supuesto, la neurogénesis. A lo largo de esta dirección, que recientemente dio a conocer un nuevo enlace de 16 en la co intriganterrelación que ocurre entre el gen maestro gcm / planeo y la vía ARN. El factor de transcripción mosca Gcm / Glide 17-19 constituye un ejemplo único de determinante el destino celular, que dicta la elección destino neuronal glial vs. en multipotentes vuela precursores neuronales 20. Veinte años de larga investigación sobre este tema ha destacado claramente la aparición de múltiples y superpuestas entradas de regulación de la expresión génica que convergen sobre gcm / deslizarse 21-28 para establecer los niveles de umbral necesarios para el equilibrio de la delicada relación entre contrapartes neuronales y gliales durante el desarrollo neural.
Descubrimos que la regulación a través de DMEL-miR279 focalización representa un nivel de control que contribuye a la post-transcripcional puesta a punto de gcm expresión 16 / deslizarse. Mejoras metodológicas específicas Globalmente, estas líneas de investigación se han requeridas: a lo largo de años, varias tecnologías originalmente desarrolladas para analizar tradRNAs itional han sido convertidos para cuantificar pequeños ARN no codificantes, como como ensayos de protección de ARNasa, arrays de cDNA 29-31, en tiempo real los métodos de PCR y secuenciación 32-35 36,37. Por otro lado, la recalibración de los enfoques técnicos ha propiciado avances continuos en el campo.
Northern Blot de ensayo (NB, o ensayo de transferencia de gel de ARN) constituye un ejemplo representativo: se emplea en gran medida al perfil acumulación de ARN, ya que garantiza tanto a nivel de cuantificación expresión, así como la determinación del tamaño. Sin embargo, la intrínseca pobre sensibilidad del método es limitante cuando se va a aplicar a la baja abundancia de la expresión de genes afinadores, como RNAs cortos. Una consecuencia perjudicial es el requisito de grandes cantidades de ARN total, lo que hace difícil su aplicación a muestras biológicas específicas. Por tales razones, variantes NB específicos para la detección de ARN pequeños se han desarrollado 38-40: nos aprovechamos de un proc NB mejoradoedure 41 (ENB, Mejorada del Norte Blot), mientras que la aclaración de la interacción mencionada entre DMEL-miR279 y gcm / planeo.
Este método se basa en una etapa química de reticulación basado en la actividad de un derivado de carbodiimida [1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida, EDC] para fijar el ácido nucleico sobre soportes sólidos. Carbodiimida es un reticulante versátil conocido para catalizar la formación de enlaces amida entre carboxilo o fosfato grupos activados y grupos amina 42. Esta propiedad puede ser explotada para par de pequeños RNAs covalentemente a través de su grupo 5'-hidroxilo mono-fosforilado a grupos amino en la superficie de las membranas de nylon. La configuración de fijación resultante aumenta la accesibilidad del ácido nucleico inmovilizado y, a su vez, la eficiencia de la hibridación sonda-diana, lo que resulta en la mejora de la detección notable 43.
La técnica adquiere una especial relevance en Drosophila estudios moleculares, por el cual la ocurrencia de clases novedosas y distintivas de los pequeños RNAs no codificantes está emergiendo 44. Entre estos, 45,46 rasiRNAs constituyen un subtipo específico de ARN Piwi-interactuar piRNAs (47), que participan en la secuencia específica de silenciamiento génico. Detalles operativos de este método se describen completamente y se visualizaron en lo sucesivo, en relación con el análisis de la microRNAs DMEL-miR279 y miR286 DMEL-y, por primera vez, de una rasiRNA, rasi4. Empujamos a los extremos este método, lo que nos permitió revelar objetivos mal expresados a partir de cantidades mínimas de ARN (menos de 1 mg).
Aunque nuestra apreciación de la sofisticada entrelazando a través del cual el ARN regula la neurogénesis está aumentando continuamente, las implicaciones mecanicistas de circuiterías basados en ARN que afectan a los nervios biología de células madre, diferenciación neuronal / integración funcional, el desarrollo de las patologías neuronales y cánceres permanecen sin explorar. El mantenimiento de este tipo de redes a través de reinos hace que el potencial de los sistemas genéticos como Drosophila …
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale, el Centre National de la Recherche Scientifique, la Universidad de Estrasburgo, el Hôpital de Estrasburgo, la Asociación pour la Recherche sur le Cáncer, el Institut National du Cancer, la Agence Nationale de la Recherche y la región de Alsacia.
Pietro Laneve ha recibido el apoyo de la Fondation pour la Recherche Médicale. Actualmente, es un receptor de un Istituto Italiano Tecnologia (IIT) de becas. Costos de publicación son apoyados por la red Neurex (TriNeuron – Programa Interreg IV Alto Rin)
FINAL COMPOSITION/NAME | COMPANY | CATALOGUE (Stock) | COMMENTS |
GENERAL REQUIREMENT | |||
Centrifuge, 5418 | Eppendorf | 5418 000.017 | |
Decontaminant, RNase Away | Sigma-Aldrich | 83931 | Apply on glass/plasticware, wipe and rinse |
RNase inhibitor, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | Hazardous //// 1609-47-8 |
0.1 % DEPC suspension | Incubate 2 hr at 37 ˚C, then sterilize by autoclave | ||
SAMPLE PREPARATION | |||
Stereo Microscope, M60 | Leica | ||
1X PBS Buffer | |||
137 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
2.7 mM KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | 7447-40-7 |
10 mM Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | 7558-79-4 |
1.8 mM KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | 7778-77-0 |
RNA EXTRACTION/ANALYSIS | |||
UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
Gel Imager, ChemiDoc XRS+ | Biorad | 170-8265 | |
Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT | BioRad | 170-4487EDU | |
RNA extraction reagent, TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 | Hazardous |
PCA (25:24:1), 1:1 for extraction | Sigma-Aldrich | 77617 | 136112-00-0 |
Chlorophorm, 1:1 for extraction | Sigma-Aldrich | C2432 | 67-66-3 |
EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing | Sigma-Aldrich | 59844 | 64-17-5 |
Gene Ruler 1Kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0311 | |
Stop Mix | |||
300 mM NaOAc, pH 5.5 | Sigma-Aldrich | S2889 | 127-09-3 |
1x RSB Solution | |||
2% sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71736 | Never cool down SDS to avoid precipitation //// 151-21-3 |
2 mg/ml Proteinase K | Roche Applied Science | 0-3115828001 | EC 3.4.21.64 9 |
10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB) | |||
100 mM Tris-Cl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T5941 | 1185-53-1 |
100 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
30 mM MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | 7786-30-3 |
Denaturing Agarose Gel | |||
1.2% Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2 |
1x MOPS Buffer | Add when T < 60 ˚C | ||
3% formaldehayde | Sigma-Aldrich | F8775 | Hazardous. Add when T < 60 ˚C //// 50-00-0 |
10X MOPS Buffer | |||
0.2 M MOPS sodium salt, pH 7 | Sigma-Aldrich | M9381 | Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7 |
Agarose Loading Dye | |||
1x MOPS Buffer | |||
3% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Hazardous //// 50-00-0 |
50% formamide | Sigma-Aldrich | 47670 | Hazardous //// 75-12-7 |
Ethidium bromide (EtBr) 30 μg/ml | Sigma-Aldrich | E1510 | Hazardous //// 1239-45-8 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 115-39-9 |
SMALL RNA FRACTIONATION | |||
Flat gel loading tips | Life Technologies | LC1002 | |
Savant SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | DNA120 | |
Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | 165-8000 | |
Denaturing Acrilamide Gel | |||
10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1) | Sigma-Aldrich | A3449 | Hazardous. Let the gel polymerizefor 45 min before use |
1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer) | |||
7 M urea | Sigma-Aldrich | U6504 | 57-13-6 |
0.1% ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 215589 | 7727-54-0 |
0.1% TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | 110-18-9 |
Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step) | Thermo Scientific | SM1211 | Label 0.1 μg, as described in the "probe labeling" reaction |
Acrylamide Blue Dye | |||
50% formamide | Sigma-Aldrich | 47670 | Hazardous //// 75-12-7 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 115-39-9 |
Running Buffer (RB) | |||
1x MOPS Buffer | |||
Alternative RB: 1x TBE Buffer | |||
1x TBE Buffer | |||
5X TBE | |||
445 mM Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
445 mM boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | 10043-35-3 |
20 mM EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
Gel Staining Solution | |||
Ethidium bromide 0.5 μg/ml | Sigma-Aldrich | E1510 | Hazardous //// 1239-45-8 |
1x RB | Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr | ||
BLOTTING | |||
3MM Whatman paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | |
Neutral Nylon Membrane, Hybond NX | GE Healthcare Life Science | RPN203T | Photosensitive |
CROSSLINKING | |||
Crosslinking Solution (XLS) | |||
1% 1-methylimidazole (v/v) | Sigma-Aldrich | 336092 | Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7 |
12.5 mM HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | Hazardous //// 7647-01-0 |
3.1% EDC (w/v) | Sigma-Aldrich | 3450 | 25952-53-8 |
(PRE)-HYBRIDIZATION | |||
Liquid Scintillation Counter | Beckmann | LS 6500 | |
Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml | Life Technologies | AM9680 | |
rasi4 antisense probe | 5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3' | ||
5s-rRNA antisense probe | 5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3' | ||
Dmel-miR279 antisense probe | 5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3' | ||
Dmel-miR286 antisense probe | 5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3' | ||
Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns | GE Healthcare Life Science | 27-5325-01 | |
(Pre)-Hybridization Solution (HS) | |||
6x SSPE | Pre-warm HS at 37 ˚C before use | ||
0.5% SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | 151-21-3 |
5x Denhardt's Solution | |||
20X SSPE | |||
3.6 M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
0.2 M sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | 7601-54-9 |
20 mM EDTA (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
50x Denhardt's Solution | |||
1% Ficoll 400 (w/v) | Sigma-Aldrich | F2637 | 26873-85-8 |
1% Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | 9003-39-8 |
1% BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | 9048-46-8 |
1X TEN Buffer | |||
10 mM Tris-Cl (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
100 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
1 mM EDTA (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
Probe Labelling | |||
0.4 μM oligonucleotide | |||
1.5 μl Ci/μl [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG002A | Hazardous //// 51963-61-2 |
1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer | Biolabs | B0201 | |
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/μl | Biolabs | M0201 | EC 2.7.1.78 |
30 min at 37 ˚C, stop by 20 mM EDTA | |||
WASHING | |||
Geiger Mueller Detectors | Canberra Industries | MCB2/CPS – EM77021 | |
Washing Buffer (WB), 2x SSPE | |||
Stringent Washing Buffers | |||
0.2x SSPE | |||
2x SSPE, 0.5% SDS | |||
0.2x SSPE, 0.5% SDS | |||
SIGNAL DETECTION | |||
PharosFX Plus System | Biorad | 170-9460 | |
Image J | Freely available | ||
Quantity One | Biorad | ||
X-ray films , BioMax XAR | Sigma-Aldrich | F5888 | Photosensitive |
Developer for X-ray films | Sigma-Aldrich | P7042 | |
Fixer for X-ray films | Sigma-Aldrich | P7167 | |
STRIPPING | |||
Stripping Solution | |||
10 mM Tris-HCl pH 8.8 | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
5 mM EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
0.1% SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3 |