Sammanhängande anti-Stokes Ramanspridning (CARS) Mikroskopi Visualiserar Pharmaceutical tabletter under upplösningen

Summary

Sammanhängande anti-Stokes Ramanspridning (CARS) mikroskopi kombineras med en inneboende genomströmnings upplösning setup för att släppa in situ och realtid visualisering av ytan av farmaceutiska tabletter genomgår upplösning. Med hjälp av den här specialbyggd installation, är det möjligt att korrelera BILAR filmer med drog upplösningsprofilema spelats in med inline UV-absorption spektroskopi.

Abstract

Traditionella farmaceutiska upplösningstester bestämma mängden av upplöst läkemedel över tiden genom att mäta halten läkemedel i upplösningsmediet. Denna metod ger lite direkt information om vad som händer på ytan av upplösande tabletten. Som tablettytan sammansättning och struktur kan förändras under upplösningen, är det viktigt att övervaka den under upplösningstestning. I detta arbete konsekvent anti-Stokes Ramanspridning mikroskopi används för att bilden på ytan av tabletterna under upplösning medan UV-absorption spektroskopi samtidigt ger inline analys av upplöst läkemedelskoncentration för tabletter som innehåller en 50% blandning av teofyllin vattenfri och etylcellulosa. Mätningarna visade att in situ-CARS mikroskopi kan avbildning selektivt teofyllin i närvaro av etylcellulosa. Dessutom teofyllin vattenfri omvandlas till teofyllin monohydrat under upplösning, med nål-formad ropStals växer på tablettytan under upplösningen. Omvandlingen av teofyllin anhydratet till monohydrat i kombination med minskad exponering av läkemedlet till det strömmande upplösningsmediet resulterade i minskade upplösningshastigheter. Våra resultat visar att in situ CARS mikroskopi kombinerat med inline UV-absorption spektroskopi kan övervaka läkemedelstablett upplösning och korrelera ytförändringar med förändringar i upplösningshastighet.

Introduction

Under utvecklingen av orala läkemedelsformer såsom tabletter och kapslar finns det en stark betoning på upplösningstester. Orala doseringsformer som krävs för att lösa upp innan de kan absorberas för terapeutisk effektivitet. Svårlösliga läkemedel i allmänhet har problem att nå en tillräcklig koncentration som gör testning av frisättnings särskilt viktig ^1. Farmakopé upplösningsmetoder används oftast för upplösning analys. I de flesta fall kräver detta att framställa läkemedlet som en tablett eller kapsel, som sedan placeras i en bägare under rinnande upplösningsmedium. Den upplösta läkemedelskoncentrationen bestäms sedan genom att analysera prover av upplösningsmediet med användning av en standard-spektroskopiska teknik såsom UV-absorptionsspektroskopi ^2. Dessa traditionella läkemedelsupplösningsmetoder ger inte någon direkt analys av provet eller förändringar som eventuellt förekommer på den upplösande ytan av doseringsformen.Direkt analys av provet under upplösningen kan ge mer information om upplösningsberedningsform och eventuellt identifiera problem som orsakar upplösningstest misslyckande.

Direkt analys av upplösning av doseringsformer erfordrar användning av in situ-analystekniker, vilka är i stånd att övervaka upplösningsprocessen. För att spela in situ under upplösnings analysmetoden inte måste påverkas av närvaron av upplösningsmediet och den teknik som behöver en hög tidsupplösning för att på ett tillförlitligt sätt mäta förändringar i den upplösande doseringsform av storleksordningen sekunder. Dämpad totalreflektion UV-spektroskopi har visat sig vara lämplig för att mäta förändringar under upplösningen men saknar rumsliga upplösningen som tillhandahålls av avbildningstekniker ^3. Traditionella läkemedelsavbildningstekniker, såsom svepelektronmikroskop (SEM), och spontana Raman kartläggning har båda begränsande faktorer som hindrar deras användning isitu för upplösning.

SEM-avbildning är en högupplösande snabb avbildningsteknik kan avbildning av ytan av farmaceutiska doseringsformer. Emellertid är SEM-avbildning i allmänhet utförs under vakuumförhållanden och kräver provet beläggning vilket gör det olämpligt för in situ-upplösning avbildning. Fiber-coupled spontan Raman-spektroskopi i kombination med en genomflödescell och UV genomströmnings absorptionsspektroskopi, har utförts för att övervaka olika drogsystem in situ under upplösningen, inklusive teofyllin ^4, karbamazepin och indometacin ^5. Raman-spektroskopi kunde identifiera ytförändringar inträffar under upplösning, men det gav ingen geografisk information om var de förändringar ytan var inträffar. Spontan Raman kartläggning använder Raman spektra och tillhandahåller geografisk information om ytan av provet utan avbildning tar i storleksordningen minuter till timmar beroende på bildytan, vilket gördet olämpligt för in situ upplösning avbildning.

Sammanhängande anti-Stokes Ramanspridning (CARS) mikroskopi är en snabb bildteknik och kombinerat med inline UV-absorption spektroskopi har det möjligt för oss att utveckla en teknik som kan in situ upplösningsanalys. CARS mikroskopi ger snabb kemiskt selektiv avbildning som inte påverkas av närvaron av upplösningsmediet gör det till en lämplig teknik för att in situ-upplösningsanalys. BILAR tekniker är grovt delas in i två grupper baserat på pulslängd på lasrarna; en är smalbandiga BILAR (pikosekund pulsade lasrar), och den andra är bredbands BILAR (femtosecond pulsad laser). En typisk CARS mikroskop system består av två pulsade laserkällor och ett inverterat mikroskop. För att producera en CARS signal, en av de pulsade lasrar behöver vara avstämbar så det finns en frekvensskillnad mellan de två lasrar, som matchar ett Raman vibrationer. Dessutomde två lasrar som krävs för att överlappa varandra i rymden (rumslig) och tid (tidsmässig), varvid pulserna från båda lasrarna som anländer till samma område av provet på samma gång. Eftersom Raman vibrationer är kemiskt specifika och CARS signalen genereras endast i bränn volymen av mikroskopet, är CARS mikroskopi kan kemiskt selektiv avbildning med en upplösning ner till diffraktionsgränsen.

Smalbandiga CARS mikroskopi med en enda Raman vibrationsläget kan ca 100x snabbare bildbehandling jämfört med spontana Raman stående förfaranden ^6. Bredbands CARS mikroskopi bilder över ett bredare spektralområdet (600-3,200 cm ^-1 vs ~ 4 cm ^-1), men har en lägre spektral upplösning (ca 10 cm ^-1 vs ~ 4 ^cm-1) och långsammare utskriftshastighet (50 msek / pixel vs ~ 5 ^ sek / pixel) jämfört med smal CARS mikroskopi ^7.

Smalbandiga CARS mikroskopi har använts för att avbilda drug frigivning från vissa läkemedelssystem. Inom området för farmaceutiska formuleringar, Kang et al. ^8-10 avbildade läkemedelsfyllda polymerfilmer. Initialt de avbildade fördelningen av laddade läkemedel, vilket följdes av avbildning av läkemedelsfrisättning från en statisk upplösningsmedium. Jurna et al. ¹¹ och Windbergs et al. ¹² gick ett steg längre och avbildas för det första teofyllin fördelningen i lipid doseringsformer följt av avbildning drogen upplösning med hjälp av en dynamisk upplösningsmedium.

Vi har utvecklat en ny analysmetod för att samtidigt övervaka förändringar yta på tabletten som genomgår upplösning med smal CARS mikroskopi medan du spelar in det upplösta läkemedelskoncentrationen med UV-absorption spektroskopi. Vi illustrerar användandet av denna metod som avbildar tabletter som innehåller modellen drog teofyllin i kombination med etylcellulosa genomgår upplösning med vatten som upplösningsmedium.

Protocol

Figur 1. Schematisk illustrerar CARS mikroskop setup med den inneboende flödet genom upplösning inställningar. Siffran har modifierats Fussell et al 13. 1. System Startup Slå på 20 ps pulsade 1064 nm BILAR laser och låta lasern att värmas upp (ca 1,5 tim). Slå på deuteriumlampa UV-ljuskälla och låt den värmas upp (ca. 10 min). Öppna slutaren på deuteriumlampan UV-ljuskällan genom att ställa in slutar omkopplaren på "öppna". Slå på mikroskopkontroll PC och öppna mikroskop styrprogram. Slå på UV-spektrometer PC och öppna spektrometern styrprogram. 2. Mimikroskopet Setup Välj önskad mikroskop målet. Använd en 20X/0.5 NA mål att uppnå de resultat som presenteras i detta arbete. Ställ in filtren i filter set torn för att överföra excitation lasrar och återspeglar CARS signalen. Välj ett 775 nm långpass dikroisk spegel och ett 650 nm bandpass-40 nm-filter för att replikera de resultat som visas i detta arbete. Placera lämpliga filter framför fotomultiplikatorröret (PMT) detektor som sänder CARS signalen och filtrera oönskat ljus. Filtrera det ljus med en 750 nm kortpass-filter och en 650 nm bandpass-40 nm-filter för att återge de experiment som utförts i detta arbete. 3. System Testing Slå på den peristaltiska pumpen och pumpupplösningsmedium under några minuter genom den Z-formade UV-flödescellen för att rensa föregående vätskan ur rörsystemet. Bestämma flödeshastigheten hos pumpen genom att väga mängden av upplösningsmedium pumpas i 2 min. Justera pumphastigheten until önskade flödeshastigheten har uppnåtts. Pump upplösningsmediet vid en flödeshastighet av 5 ml / min för att uppnå de resultat som redovisas i detta arbete. 4. UV Upplösning Mätning I UV-spektrometer styrprogram, klicka på menyn "Arkiv" och sedan på "Ny absorbansmätning" för att öppna ett fönster som listar alla tillgängliga spektrometrar. Klicka på rätt UV-spektrometer, och klicka sedan på "Nästa" för att öppna ett fönster som visar datainsamlingsparametrarna. Definiera både integrationstiden och den spektrala medelvärdesbildning. Välj en integrationstid på 150 msek med 200 genomsnitt att replikera de resultat som visas i detta arbete. Klicka på knappen "Next" för att få upp på skärmen som används för att spela in referensspektrum. Klicka på den knapp som visas som en gul glödlampa för att spela in ett referensspektrum. Pumpupplösningsmedium kontinuerligt under denna mätning. Stäng luckan på deuteriumlampan UV-ljuskällan genom att ställa strömbrytaren till "stängd". Klicka på knappen "Next" för att få upp på skärmen som används för att spela in den mörka spektrumet. Klicka på den knapp som visas som en grå lampa för att spela in en mörk spektrum. Pumpupplösningsmedium kontinuerligt under denna mätning. Klicka på knappen som säger "Avsluta" för att påbörja de absorbansmätningar UV. 5. CARS Upplösning video I CARS mikroskop styrprogram, klicka på knappen som väljer en "XYT" mätning. Klicka på listrutan och välj bildstorlek i pixlar. Välj en bildstorlek på 512 x 512 pixlar för att återge de bilder som redovisas i detta arbete. Dra reglaget för utskriftshastighet på antingen "snabb", "medium" eller "långsam" läge. Använd den snabba scanningshastighet (1,12 sek per bild) för att uppnåde resultat som visas i detta arbete. Klicka på pilarna märkta "Zoom" för att justera zoomnivån. Välj "2x" zoom att replikera nivån zoom och synfält (350 x 350 mikrometer) som används för dessa resultat. Klicka på listrutan och välj objektiv används. Klicka på inmatningsrutan och ange antalet bildrutor som krävs för CARS upplösning video (beroende på längd experiment). Genomföra upplösning i ca 15 minuter genom att spela in 900 bilder för att reproducera de resultat som visas i detta arbete. 6. BILAR Wavelength Tuning Använda optisk parametrisk oscillator (OPO) ansvarige justera inställningarna för OPO såsom temperatur, piezo position och Lyot filter position tills maximal laser effekt vid önskad Raman frekvensen uppnås. Trimma OPO till 2960 cm-1 för att spela in samma resultat som de som presenteras i denna artikel. 7. The Dissolution Experiment Placera en tablett i provhållare av specialbyggda BILAR flödescell, skruva provhållaren stängd ordentligt för att förhindra läckage. Fäst rören till CARS flödescell ansluter CARS flödescell i den bägare som innehåller upplösningsmediet och den peristaltiska pumpen. Placera CARS flödescell som innehåller en tablett på mikroskop scenen. Kontrollera att CARS flödescell är kopplad till upplösningsmediet bägare, den peristaltiska pumpen, den Z-formade UV-flödescellen och avfallsuppsamlingsbägare. Klicka på "XY repeat" knappen för att börja skanna mikroskopsystemet i en kontinuerlig avsökning. Justera mikroskopets fokus genom att flytta målet till dess att ytan av tabletten är i synfältet på mikroskop kontroll datorskärm. Klicka på skjutreglaget i mikroskop styrprogram märkt "PMT". Justera detektorkänsligheten genom att öka / minska PMT spänning framen tillfredsställande bild (varken för mörk eller mättad) syns på skärmen. OBS: Se till att inte överbelasta PMT med hög spänning. För detta arbete har vi använt en PMT spänning runt 600 V, men detta kan variera beroende på PMT används. Klicka på "Stop" i mikroskop styrprogram för att stoppa den kontinuerliga skanningen. Samtidigt (eller så nära varandra som möjligt) börja pumpa upplösningsmedium, börja spela in ett enda XYT scan, och börja samla UV-absorbans-spektra. Under upplösningsexperiment, övervaka videoinspelning och manuellt justera mikroskopet fokus att se till att tabletten är ständigt i fokus. 8. Inlägg Upplösning Stoppa den peristaltiska pumpen genom att stänga av den. Klicka på menyn "Arkiv" och sedan på "Spara som video" på mikroskopet styrprogram för att spara XYT scan som en video. Klicka på menyn "Arkiv" och klicka sedan på "Spara "och sedan på" Stop Exportera "på spektrometern styrprogram för att stoppa insamling av UV-absorption spektra. Ta CARS flödescell från mikroskop scenen och ta tabletten från flödescellen BILAR. Tvätta CARS flödescell med hjälp av vatten och etanol, och sedan torka med hjälp av silkespapper.

Representative Results

In situ-upplösningsanalys med användning av CARS mikroskopi utfördes på tabletter (12 mm i diameter, med plan yta) innehållande en 50:50 blandning av modelläkemedlet teofyllin anhydrat och etylcellulosa med destillerat vatten pumpades vid 5 ml / min som upplösningsmedium. BILAR bilder (512 x 512 pixlar) uppsamlades varje 1,12 sek vid Raman-vibrationsfrekvens 2960 cm -1, som är selektiv för innehållet teofyllin i tabletten för varaktigheten av upplösnings experiment. Figur 2 visar valda ramar efter upplösningen video. Vid början av upplösning (figur 2, tid 0 sek) finns det områden av grönt som visar innehållet i tabletten teofyllin och det finns också mörka områden där det bara etylcellulosa närvarande på ytan av tabletten. I de mörka områden på ytan av tabletten kan man svagt se innehåll i etylcellulosa. Detta beror på att det har rapporterats att etyl-celluloSE har Raman vibrations med maxima runt 2930 och 2975 cm-1 14. Efter ca 60 sek verkar det vara början på teofyllin monohydrat kristalltillväxt på ytan, som kan ses som smala nålformade kristaller växer utåt från minst en kristall kärna i mitten av bilden (Figur 2, tid 60 sek) . Den monohydrat kristalltillväxt kan vara mycket mer tydligt efter 130 sek (Figur 2, tid 130 sek). Dessutom vid tidpunkt 130 sekunder kan det ses att monohydratet kristallen inte har spridit sig helt tvärs över ytan av tabletten. Det verkar som om närvaron av etyl cellulosa regionerna har fysiskt blockerat förlängning av monohydrat nålar. Efter 250 sekunder, kan det ses att monohydratet täckning av ytan är inte så framträdande som föreslår att de monohydrat kristallerna själva börjar att upplösas. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "alltid"> Figur 2. Ramar från CARS upplösning video. Valda bilar Bilder (2960 cm -1) från en upplösning video för en teofyllin vattenfri med etylcellulosa tablett. Den 0 sek bilden spelas in på ett område av provet medan 60, 130, och 250 sek bilder spelas in med en annan del av provet. Den CARS video finns som kompletterande information. Scale bar är 50 | im. Ultraviolett (UV)-spektroskopi är en form av absorptions-spektroskopi med användning av UV-ljus som exciteringskälla. UV-spektroskopi åtgärder elektronövergångar från grundtillståndet till ett exciterat tillstånd 15. Teofyllin har en bred topp centrerad kring 270 nm medan etylcellulosa är praktiskt taget olösligt i upplösningsmediet så inte förväntas bidra till UV-spektrumet registreras. Analys av Dissolution medium med användning av den infogade z-formade UV-flödescellen ger oss möjlighet att kvantitativt bestämma mängden läkemedel löses under upplösningen. Figur 3 visar UV-upplösningsprofilen för upplösningen av teofyllin anhydratet med etylcellulosa tablett. UV upplösningsprofilen (Figur 3) visar att upplösningen av teofyllin vattenfri börjar snabbt nå en maximal koncentration av cirka 90 mikrogram / ​​ml inom 120 sek; efter denna tid led upplösningshastigheten börjar att minska. Minskningen i upplösningshastighet kan bero på närvaron av teofyllin-monohydrat (löslighet 6 mg / ml vid 25 ° C 16) kristaller på ytan som är mindre lösliga än teofyllin anhydrat (löslighet 12 mg / ml vid 25 ° C 16 ) och tydligt i CARS upplösnings video (figur 2) vid denna tidpunkt. Den gradvis minska upplösningshastigheten kan också delvis förklaras bya minskning teofyllin exponering för det strömmande mediet. Denna minskning beror på etylcellulosa är praktiskt taget olöslig i vatten, så som den teofyllin löses den återstående etylcellulosa hinders teofyllin exponering för upplösningsmediet. Figur 3. UV upplösningsprofil. Koncentration mot tid tomt för en teofyllin vattenfri kombinerat med etylcellulosa tablett som visar koncentrationen av teofyllin i upplösningsmediet under upplösningen experimentet.

Discussion

When performing CARS microscopic dissolution experiments there are a few critical aspects that need to be monitored during the experiment. Firstly, introducing the dissolution medium to the CARS flow cell causes the focus to move. This means that the image is immediately lost and it takes a few microns of objective adjustment to find the surface again. Secondly, there is risk of liquid leakage from the CARS flow cell if the glass cover breaks during the experiment. This can potentially cause liquid damage to the optics, so it is important to listen for any cracking sound that could mean the glass has broken. Finally, there is also a small chance that the piping can become blocked due to particulate matter in the system during the experiment, this can be seen as a sudden unusual change in the UV spectra and also through periodically checking the flow during the experiment.

Particulate blockage of the piping is mainly an issue with tablets that have been designed to disintegrate during dissolution. This is one of the limitations for this technique as this system requires the surface of the tablet to remain intact throughout the dissolution to allow imaging. In addition to disintegrating tablets, it is currently not possible to image tablets that are designed to swell during dissolution as this can lead to breakage of the CARS flow cell.

Imaging tablets during dissolution provides a greater understanding of what is occurring on the surface of a dissolving tablet. Conventional pharmaceutical dissolution methods focus only on the drug content dissolved in the dissolution medium which can identify whether the tablet passes or fails the required standard. However, in the case of a failed test it is difficult to determine what caused the failure. The case of a failed dissolution test is potentially where in situ dissolution analysis using CARS microscopy can provide answers.

Future applications for in situ dissolution analysis using CARS microscopy could include investigations using more complicated tablets containing more than one drug or excipient, in particular non-swelling sustained or controlled release dosage forms during formulation development. Additionally, it could be possible to investigate samples using biorelevant dissolution media creating conditions more closely related to in vivo.

In conclusion, this work shows that CARS microscopy is capable of rapid chemically specific imaging based on Raman vibrational frequencies allowing selective imaging of the drug in a tablet containing both drug and excipient. Additionally, CARS microscopy combined with inline UV absorption spectroscopy is a powerful tool capable of monitoring the surface of tablets undergoing dissolution and correlating surface changes seen using CARS with changes in dissolution rate.

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catlog number	Comments/Description	Website
Paladin 1064nm laser	Coherent	N/A	Prototype model not for sale	http://www.coherent.com/
Levante Emerald Optical parametric oscillator	APE Berlin	N/A		http://www.ape-berlin.de/en/products/levante/levante-emerald-opo#block-views-products-block-1
IX 71 Microscope	Olympus	N/A		http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1023
Fluoview 300 scanning unit	Olympus	N/A		http://www.olympusamerica.com/seg_section/seg_product_print.asp?product=133
Photon multiplier tube R3896	Hamamatsu	N/A		https://www.hamamatsu.com/jp/en/R3896.html
Free standing optics / filters	Thorlabs and Chroma	N/A		http://www.chroma.com/
				http://www.thorlabs.de/index.cfm?
Reglo peristaltic pump	ISMATEC	N/A		http://www.ismatec.com/int_e/pumps/t_reglo/reglo.htm
USB2000+ spectrometer	Ocean Optics	N/A		http://www.oceanoptics.com/products/usb2000+.asp
DT-MINI-2-GS light source	Ocean Optics	N/A		http://www.oceanoptics.com/Products/dtmini.asp
FIA-Z-SMA-TEF Z shaped flow cell	Ocean Optics	N/A		http://www.oceanoptics.com/Products/fiazsmaflowcells.asp
QP400-2-SR-BX optical fiber	Ocean Optics	N/A		http://www.oceanoptics.com/Products/premgradesol.asp
Plastic piping	ISMATEC	N/A		http://www.ismatec.com/int_e/tubing/misc/tubing_home.htm
CARS dissolution tablet flow cell	N/A	N/A	Homebuilt at university – designed to hold 12mm diameter, 3mm thick tablets. The flowcell has a channel depth of around 0.5mm.
Glass beakers	VWR	D108980		https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4537423
Theophylline anhydrate	BASF	30058079		http://www.basf.com/group/corporate/en/brand/THEOPHYLLINE
ethylcellulose	Colorcon	N/A		http://www.colorcon.com/products-formulation/all-products/film-coatings/sustained-release/ethocel