Summary
In questo studio, una nuova piattaforma per indagare le firme molecolari intraneuronali di risposta al trattamento nel disturbo bipolare (BD) è stato sviluppato e validato. Epitelio olfattivo da pazienti BD è stato ottenuto attraverso biopsie nasali. Poi laser-capture microdissezione è stato combinato con Tempo reale RT PCR per indagare la firma molecolare della risposta litio in BD.
Abstract
Il disturbo bipolare (BD) è un grave disturbo neuropsichiatrico con fisiopatologia poco compreso e in genere trattate con lo stabilizzatore dell'umore, carbonato di litio. Gli studi sugli animali e studi genetici umani indicano che il litio colpisce bersagli molecolari che sono coinvolti nella crescita neuronale, la sopravvivenza e la maturazione, e in particolare le molecole coinvolte nella segnalazione Wnt. Data la sfida etica di ottenere biopsie cerebrali per studiare variazioni dinamiche molecolari associati con litio-risposta nel sistema nervoso centrale (CNS), si può considerare l'uso di neuroni ottenuti da tessuti olfattive per raggiungere questo goal.The epitelio olfattivo contiene neuroni recettrici a diversi stadi di sviluppo e gliali come cellule di supporto. Questo offre un'opportunità unica per studiare i cambiamenti dinamici nel sistema nervoso centrale dei pazienti con malattie neuropsichiatriche, utilizzando il tessuto olfattivo ottenuto in modo sicuro da biopsie nasali. Per superare l'inconveniente posta dal substla contaminazione antial di tessuto olfattiva biopsia con cellule non neuronali, un nuovo approccio per ottenere popolazioni di cellule neuronali arricchito è stato sviluppato combinando biopsie nasali con laser-capture microdissezione. In questo studio, un sistema per studiare variazioni dinamiche molecolari associati al trattamento nel tessuto neuronale è stato sviluppato e convalidato, con un piccolo campione pilota di pazienti BD reclutati per lo studio dei meccanismi molecolari di risposta al trattamento litio.
Introduction
Il disturbo bipolare (BD) è un grave disturbo neuropsichiatrico, caratterizzato da alterazioni patologiche di umore, guidare e cognizione 1. Litio usato per il trattamento di BD ha dimostrato di alterare costanti i livelli di mRNA stato di un gran numero di geni in studi su animali 2, ma rimane sconosciuta se uno qualsiasi di queste molecole è associato con risposta clinica nell'uomo 2. Comprendere il meccanismo di risposta litio richiederebbe indagare i cambiamenti molecolari litio-indotta nei tessuti neuronali. Purtroppo, non è pratico di ottenere biopsie cerebrali di pazienti BD prenatale e della post-litio per identificare le firme molecolari di risposta litio. Post-mortem tessuti cerebrali sono stati utilizzati per studiare biomarcatori in BD, tuttavia, non possono essere utilizzati per valutare marcatori molecolari associati con i cambiamenti dinamici in emozioni, cognizione e guidare; e la validità di retrospettivamente accertato risposta al trattamento di litio può essere problematico 4. I linfociti e le altre cellule del sangue possono essere utili, ma i cambiamenti molecolari nelle cellule del sangue non possono riflettere le alterazioni neuronali 3-5. Liquido cerebrospinale potrebbe essere insufficiente per ottenere informazioni su molecole intracellulari che possono riflettere associate alla malattia e farmaci reversibile modifiche intrinseche.
L'epitelio olfattivo (OE) è una parte unica del sistema nervoso centrale (SNC), embriologicamente legati alle strutture limbiche 6; ed è facilmente accessibile attraverso biopsie nasali. Si compone di gliali come cellule di supporto celle (cioè, sustentacular), basali proliferanti, e neuroni olfattivi a diversi stadi di sviluppo 7-9. Pertanto, OE offre un'opportunità unica per studiare accessibilmente cambiamenti dinamici nel sistema nervoso centrale dei pazienti con malattie neuropsichiatriche 7. Gli studi stanno dimostrando l'utilità del OE come un tessuto surrogato per studiare la malattia associata eventi che riflettono tali occurring in neuroni cerebrali 8,9. Ad esempio, gli studi hanno utilizzato OE per indagare i profili molecolari associati alle condizioni psichiatriche 10-14. Sistema olfattivo serve anche ad identificare endophenoytpes clinici come deficit odore che sono associati con i sintomi negativi della schizofrenia 15. Inoltre, i processi di sviluppo neurologico continuano nella OE per tutta la vita, fornendo un viale utile per modellare la fisiopatologia di condizioni psichiatriche 8,9.
Tuttavia, un inconveniente per l'uso di questo tessuto è la sostanziale contaminazione biopsie olfattivi con cellule non-neuronali 16. Per esempio, l'RNA totale utilizzato per studi di espressione genica in studi precedenti OE conteneva RNA estratto da nasale intera biopsia tissutale compreso RNA da cellule non-neuronali 17. Pertanto, gli approcci precedenti sono stati limitati dalla qualità delle cellule. Per ovviare a questo problema, un nuovo approccio per ottenere arricchito popolazioni di cellule neuronali combinando biopsie nasali con laser-capture microdissezione (LCM) è stato sviluppato 18.
LCM è una tecnica che consente l'isolamento selettivo di cellule usando taglio laser UV combinato con infrarossi laser 19-21. Combinando LCM con approccio OE minimizza sostanziale contaminazione OE da cellule non-neuronali, migliorando così l'arricchimento delle cellule neuronali 18. Inoltre, lo strato neuronale può essere distinto dallo strato sottomucosa al microscopio, eliminando così la necessità di colorazione. Tipi di cellule neuronali possono più essere distinti da altre popolazioni cellulari utilizzando anticorpi primari che sono espressi dal tipo di cellula di interesse 7. Pertanto, questa procedura prevede un metodo più semplice per l'arricchimento di popolazione cellulare quasi puramente neuronale che può essere utilizzato per studi di espressione genica, immunoistochimica e altre indagini morfologiche.
ve_content "> Questo studio mira a istituire una piattaforma sperimentale per studiare i cambiamenti molecolari nei neuroni olfattivi associati stati di malattia e la risposta al trattamento. Per risolvere questo problema, un piccolo gruppo di pazienti non-fumatori che hanno incontrato i criteri diagnostici del DSM-IV per BD basa su Intervista diagnostica per studi genetici (DIG) 22 è stato reclutato per subire due biopsie nasali: una biopsia pre-trattamento con litio e la seconda biopsia, dopo 6 settimane di terapia quotidiana litio orale Inoltre, i pazienti BD ammissibili devono essere:. sintomatico per la depressione , basata sul punteggio ≥10 su 60 nella clinico somministrato Montgomery-Asberg Rating Scale (MADRS) 23; sintomatica per ipomania o mania, sulla base di un punteggio ≥10 su 56 sul medico somministrato Young-Mania Rating Scale (YMRS) 24;. o ≥10 su entrambi MADRS e YMRS coefficiente Rater-Inter-Rater di un accordo tra i medici sia per le scale è> 0.96 Dopo biopsie, i neuroni erano Enri.ched da OE da LCM. A seguito di misure di controllo supplementari di qualità, al fine di garantire l'estrazione di RNA di alta qualità dal tessuto e arricchimento neuronale, Real Time RT PCR è stato condotto per indagare i livelli di pre e post-trattamento di espressione dei geni di interesse. Le sezioni successive contengono una descrizione della convalida di questo approccio, mettendo in evidenza l'ottimizzazione del protocollo e le strategie che sono state applicate per la risoluzione dei problemi del protocollo.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Tutti i volontari di ricerca in questo studio sono stati somministrati i documenti di consenso informato approvato dal Institutional Review Board di Howard University e la Johns Hopkins University. Solo ai partecipanti che hanno acconsentito, firmando documenti consenso informato sono stati arruolati nello studio. La base di studio per questa analisi consisteva in: 20 soggetti (12 BD e 10 controlli, 30% maschi) ed età (sd) di 38,2 (14,1) anni significa.
NOTA: Spray tutte le superfici con RNase Zap per eliminare la contaminazione RNasi dalle superfici di vetro e plastica.
1. Biopsia Procedura
- Spray topico lidocaina (xylocaina) liquido 4% e ossimetazolina HCl 0,05% nella cavità nasale del partecipante allo studio e permettere 15 minuti di tempo paralizzante.
- Impregnano cottonoids chirurgici ½ x 3 pollici in una miscela di lidocaina e ossimetazolina e inserire nella cavità nasale lungo la porzione superiore del setto nasale e lasciar riposare per 15 min.
- Utilizzando un 30 ° rigidoendoscopio nasale per individuare la parte superiore della cavità nasale, rimuovere mucosa nasale con up-mordere pinze nasali dalla parte superiore del setto nasale, prendendo una serie di piccoli campioni.
2. Preparazione di blocchi di tessuto
- Immediatamente prima biopsia, compilare cryomolds di dimensioni standard con tessuto congelamento media.
- Con una pinzetta in autoclave, montare tessuto fresco nel mezzo di congelamento e congelare in ghiaccio secco. Riempire resto cryoblock con il mezzo di congelamento, congelare cryoblock in ghiaccio secco, e memorizzare i blocchi a -80 ° C.
3. criosezionamento
- Preparare polietilennaftalato (PEN) vetrini membrana immediatamente prima criosezionamento. Spruzzare diapositive con soluzione RNase Zap per 5 min. Quindi sciacquare i vetrini in dietilpirocarbonato (DEPC) acqua e lasciare asciugare per 30 minuti. Attivare diapositive secchi sotto la luce UV per 30 minuti.
- Cryosection ogni blocco interamente a 30 micron. Tenere i vetrini su asciuttoce e sezioni congelate per quanto possibile. Conservare i vetrini a -80 ° C al termine.
4. Laser-Capture Microdissection
- Inizia disidratazione diapositive immediatamente prima microdissezione. Lasciate scongelare i vetrini congelati per 10 sec, e quindi applicare la seguente serie di etanolo per ogni diapositiva: 60% (2 ml, 15 sec), l'80% (2 ml, 15 sec), il 95% (3 ml, 25 sec), 100 % (7 ml, 60 sec).
- Girare microscopio la localizzazione fotoattivato (PALM) microscopio e impostare le seguenti condizioni: Per 10X di ingrandimento impostato l'energia per 82, si concentrano a 74, e la velocità di 25 - 30. Per 20X di ingrandimento, impostare l'energia per 63, si concentrano a 67, e la velocità di 5 - 6. Regolare come necessario per ottenere risultati ottimali di taglio.
- Visivamente identificare neuroni utilizzando 20X o 10X di ingrandimento. Distinguere la superficie sottile strato neurone olfattivo sottostante sub-mucosa al microscopio senza l'uso di procedura di colorazione. Osservare i neuroni come una fitta aspetto colonnare 18.
- Utilizzando la funzione Pencil al microscopio citata in fase 4.2, tracciare intorno allo strato neuronale. Traccia un po 'lontano dai neuroni per evitare di bruciare dei neuroni da laser. Ciò è essenziale per ottenere RNA alta qualità. Poi avviare guida laser di taglio.
- Pick up sezioni sezionati con punta fine pinze microdissezione e mettere il tessuto in una provetta contenente 100 microlitri tampone di lisi su ghiaccio. Ripetere l'operazione per tutte le sezioni neuronali ottenute da un singolo campione. Tempo dissezione totale per campione non deve superare i 50 minuti.
- Una volta che la dissezione è completa, immediatamente lisati campione vortice e mantenere in ghiaccio secco. Conservare i campioni a -80 ° C per l'isolamento totale di RNA.
5. Isolamento di RNA totale e analisi Controllo Qualità
- Lisati campione Scongelare su ghiaccio. Effettuare totale isolamento di RNA con RNAqueous Micro Kit con DNase-I inattivazione seguendo il protocollo del produttore senza modifiche (vedi <strong> Figura 1). Il volume totale di eluizione è di circa 20 microlitri.
- Misurare la concentrazione di RNA e valutare la qualità RNA con l'RNA Integrity Number (RIN) mediante Bioanalyzer. I campioni che soddisfano i criteri di controllo della qualità della Figura 2 possono essere utilizzati per la sintesi di cDNA.
6. cDNA Synthesis
- Sintetizzare cDNA utilizzando un kit commerciale convalidato (vedi Tabella dei reagenti). Eseguire la fase di ricottura combinando 0,1 - 1,0 ng di RNA (a seconda della disponibilità) e RNasi acqua libera ad un volume totale di 8 microlitri per provetta. Quindi aggiungere 1 ml di oligo d (T) 20 primer e 1 ml di miscela dNTP 10 mM per provetta, per un volume totale di 10 microlitri.
- Delicatamente campioni vortex e centrifugare e campioni ricottura a 65 ° C per 5 min. Dopo che la reazione è completa, i campioni immediatamente fresco su ghiaccio.
- Preparare la soluzione master mix in base alle specifiche di cui alla tabella 1. Quindi aggiungere 9,5 μl master mix e 0,5 ml di preparati commercialmente trascrittasi inversa (RT) in ciascun tubo. Aggiungere 0,5 acqua priva di RNasi microlitri per controllare tubo invece di RT.
- Eseguire una reazione RT con la prima incubazione a 50 ° C per 50 minuti, poi 85 ° C per 5 minuti e una finale attesa 4 ° C, senza il ciclismo.
- Diluire tutti i campioni di 5x con acqua e aliquota. Conservare i campioni a -80 ° C.
7. Real Time PCR - Confermare neuronale Enrichment
- Preparare la soluzione master mix secondo le norme di cui alla tabella 2. Utilizzare un controllo interno, come GAPDH. Confronta olfattiva proteina marker (OMP) espressione nel tessuto microdissezione con espressione OMP nel tessuto undissected per determinare arricchimento neuronale.
NOTA: OMP è un marcatore per i neuroni olfattivi.
OMP sequenza: in avanti, 5'-CTGTCGGACCTGGCCAAG-3 '
inversa, 5'-CACCCTCGCCAAAGGTGA-3 '
Sequenza GAPDH: avanti, 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 '
inversa, 5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 '. - Istituito piastra PCR aggiungendo 7 ml di master mix in ciascun pozzetto e 3 ml di cDNA.
- Piatto di centrifuga per 5 minuti a 300 xg (1.300 rpm). Reazione Run Real Time-PCR utilizzando le condizioni di ciclo termico predefiniti specificati per supermix commerciale come SYBR Greener qPCR.
- Analizzare i dati (vedi figura 2 per le specifiche).
8. Real Time PCR - espressione di geni di interesse
- Eseguire su campioni che mostrano arricchimento neuronale di 2 volte o più.
- Preparare master mix in ghiaccio per ogni sonda (sonda FAM-marcata di interesse e VIC-etichettati GAPDH) in tubi separati secondo le specifiche di cui alla tabella 3.
- Impostare un piatto PCR con 8 microlitri master mix in ciascun pozzetto e 2 ml di cDNA.
- Centrifugare la piastra per 5 min a 300 xg (1.300 rpm). Eseguire reale reazione di Time-PCR utilizzando il defAult condizioni di ciclo termico come da protocollo master mix espressione genica fornito dal produttore. Analizzare i risultati di espressione (vedi figura 2 per le specifiche).
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Representative Results
La strategia di protocollo e la risoluzione dei problemi nello studio delle firme molecolari sono state ottimizzate con successo. Qualità dell'RNA e criteri di arricchimento neuronali per campioni da utilizzare in una fase successiva analisi reale Time-PCR sono stati standardizzati. RIN e concentrazione di RNA sono stati esaminati i fattori di confondimento a livelli di espressione rilevati. Sulla base dell'analisi di diversi campioni con RIN da 1 - 10, è stato determinato che un RIN minimo di ~ 3,0 e sopra è sufficiente per l'analisi downstream in questo studio. Come risultato, la quantità di RNA per la sintesi di cDNA è stata standardizzata a 1,0 ng. Pertanto, campioni di alta qualità con un RIN sopra ~ 3.0 e RNA quantità di 1,0 ng stati convertiti in cDNA. I campioni con 0,1 - 1,0 ng di RNA possono essere usati se un campione di dimensioni adeguate è difficile da ottenere.
Arricchimento neuronale è stata confermata nel formato Real analisi tempo-PCR. OMP livelli di espressione genica in campioni di microdissezione sono stati confrontati con quelli del campione undissecteds per determinare se il livello neuronale è arricchita. Sono utilizzati campioni microdissezione con due espressione OMP volte o più rispetto al tessuto non sezionato.
Pertanto, l'applicazione di questi criteri, la fattibilità di questo approccio proposto per studiare i cambiamenti molecolari nei neuroni OE è stato convalidato. Figura 3 illustra che i livelli di espressione di GSK-3β risentono litio anziché da non specifici fattori esogeni, indicando che questa metodologia è sufficiente rilevare cambiamenti molecolari specifici prima e dopo il trattamento litio. Più in particolare, le alterazioni di firme molecolari associati con la risposta al trattamento di litio in BD possono essere affrontate mediante la combinazione di questi dati molecolari con i dati clinici.
Figura 1. RNA Estrazione e DNase inattivazione protocollo. Il flowchart illustra la procedura per l'estrazione di RNA da campioni dopo LCM. L'RNA totale viene eluito due volte per produrre un volume massimo RNA di circa 20 microlitri. Campioni eluiti poi sottoposti DNase trattamento che ho per l'inattivazione DNasi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Protocollo Summary. Questa figura riassume l'intero protocollo per gli esperimenti di studio. Tessuto nasale viene prima biopsia e congelato come cryoblocks. Dopo il sezionamento del tessuto, gli strati neuronali sono sezionati utilizzando LCM. Estrazione di RNA e inattivazione DNase vengono eseguite utilizzando le linee guida del produttore (vedi Figura 1). I campioni che soddisfano i criteri di controllo della qualità (RIN e quantità RNA) sono usati per sintetizzare cDNA e noiper l'analisi ed arricchimento neuronale. Campioni arricchiti sono utilizzati in analisi reale Time-PCR con gli obiettivi desiderati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. GSK-3β Expression in BD e Controllo Campioni. Questa figura illustra i cambiamenti nei livelli di espressione GSK-3β in campioni BD prima e dopo il trattamento litio e coerenza nei livelli di espressione GSK-3β in campioni di controllo tra la prima e la seconda biopsia. Presi insieme, questi dati dimostrano che l'espressione GSK-3β è influenzato da litio invece che non specifici fattori esogeni.
| Reagenti | Volume |
| 10 x RT Buffer | 2 pl |
| 25 mM MgCl | 4 pl |
| 0.1 M DDT | 2 pl |
| RNase Out | 0,5 microlitri |
| SuperScript III | 0,5 microlitri |
| RNase acqua libera | 1 ml |
Tabella 1. Soluzione Mix Master cDNA Synthesis.
| Reagenti | x1 | x (# di campioni) |
| DNA Template | 3 ml | - |
| SYBR Green | 5 ml | |
| Mix Primer | 0,8 ml | |
| Acqua | 1.2 ml | |
| Totale | 10 microlitri | - |
Tabella 2. Soluzione Mix Master neuronale Enrichment PCR.
| Reagenti | x1 | x (# di campioni / primer) |
| dWater | 2 pl | |
| Master Mix | 5 ml | |
| FAM Probe etichetta | 0,1 ml | |
| VIC sonda marcata | 0,5 microlitri | |
| cDNA | 2 pl | - |
Tabella 3. Obiettivo PCR Master Mix.
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Discussion
Una nuova piattaforma per l'ottenimento arricchiti strati di neuroni olfattivi combinando biopsia nasale e LCM è presentato ed è stato convalidato in questo studio. Questa tecnica può avere implicazioni diffuse. Può essere applicato verso studi biomarcatori, compresi quelli per la risposta al trattamento, e gli sforzi di scoperta di farmaci per altre condizioni neuropsichiatriche, avere un impatto più ampio nel campo.
Per ottenere i neuroni di alta qualità suscettibili di applicazioni a valle, a pochi passi critici e di risoluzione dei problemi deve essere osservato. In primo luogo, ottenere 4 - 6 pezzi di tessuto olfattivo per paziente per avere un campione di dimensioni adeguate. In secondo luogo, dal momento che i campioni sono soggetti a degradazione dell'RNA, mantenere il tessuto a temperature adeguate, lavorare con RNasi attrezzature e superfici libera, usare guanti, ed evitare di respirare direttamente sui campioni. Se la qualità di RNA è ancora bassa, in considerazione completando microdissezione entro 50 min ed eseguire l'estrazione di RNA immediatamente dopo la dissezione o vortex campioni immediatamente e tenere in ghiaccio secco fino conservazione a -80 ° C. Per aumentare la resa di RNA, aumentare il numero di sezioni sezionati durante LCM.
Una sfida di studiare variazioni molecolari cerebrali associati a disturbi neuropsichiatrici esiste a causa della mancanza di accessibilità per studiare il cervello umano. Approcci alternativi comprendono lo studio delle cellule del sangue periferico, cervelli sottoposti ad autopsia, e staminali pluripotenti indotte (iPS) cellule. Cellule del sangue non possono rappresentare la malattia associata cambiamenti neuronali. Cervello autopsia non possono essere la risorsa per studiare i cambiamenti dinamici e stato associato con la progressione della malattia e la risposta ai farmaci. cellule iPS potrebbero non riflettono direttamente cambiamenti di stato, perché tali tracce sono suscettibili di essere cancellati durante il corso di riprogrammazione e manutenzione di cellule. Pertanto, i vantaggi di utilizzare tessuti OE sono la capacità di studiare sia stato e dinamici cambiamenti del contesto neuronale. In particolare, iPS derivate staminali neuronalile cellule non possono riflettere adeguatamente gli effetti di 6 settimane di terapia con litio, a causa di coltura e di riprogrammazione passi. La metodologia presentata in questo lavoro ci permette di studiare i cambiamenti molecolari associati al trattamento e li rapportiamo ai cambiamenti nei sintomi clinici. Si deve notare che, almeno al momento, la quantità di neuroni ottenuti da tessuti OE è sufficiente per gli studi a livello molecolare, ma non può essere limitato alla caratterizzazione delle proteine attraverso applicazioni immunoistochimica. Così, sono previsti anche ulteriori miglioramenti tecnici.
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Disclosures
Gli autori non segnalano rapporti finanziari con interessi commerciali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Tissue-Tek Cryomold Molds | Sakura Finetek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cryosectioning | |||
| Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 | |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 | |
| DEPC Treated Water | Quality Biological | 351-068-131 | |
| Microdissection | |||
| Microscope: PALM Series MicroLaser System | Carl Zeiss Microscopy | Model: Axiovert 200M Software: Robo v3.2 |
|
| No. 5 Dumont Microdissction Forceps | Roboz | RS-49085 | |
| RNA Extraction | |||
| RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| cDNA Synthesis | |||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| OMP qPCR | |||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 | |
| Taqman qPCR | |||
| TaqMan Expression Assay Probes | Applied Biosystems | Various | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
References
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