Summary
في هذه الدراسة، منصة رواية للتحقيق التوقيعات الجزيئية داخل العصبون من الاستجابة للعلاج في الاضطراب الثنائي القطب (BD) وقد وضعت والتحقق من صحتها. تم الحصول على الظهارة الشمية من المرضى BD من خلال الخزعات الأنفية. ثم كان الجمع بين الليزر التقاط تسليخ مجهري مع الوقت الحقيقي RT PCR للتحقيق في توقيع الجزيئي للاستجابة الليثيوم في BD.
Abstract
الاضطراب الثنائي القطب (BD) هو اضطراب شديد العصبية مع الفيزيولوجيا المرضية غير مفهومة وتعامل عادة مع استقرار المزاج، كربونات الليثيوم. الدراسات على الحيوانات وكذلك الدراسات الجينية البشرية تشير إلى أن الليثيوم يؤثر أهداف جزيئية التي تشارك في نمو الخلايا العصبية والبقاء والنضج، وخصوصا جزيئات تشارك في إشارة WNT. وبالنظر إلى التحدي الأخلاقي إلى الحصول على الخزعات الدماغ للتحقيق التغيرات الجزيئية الحيوية المرتبطة ليثيوم استجابة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، يمكن للمرء النظر في استخدام الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها من أنسجة حاسة الشم لتحقيق هذا goal.The الظهارة الشمية تحتوي على الخلايا العصبية مستقبلات حاسة الشم في مراحل مختلفة من التطور والدبقية مثل دعم الخلايا. وهذا يوفر فرصة فريدة لدراسة التغيرات الديناميكية في الجهاز العصبي المركزي من المرضى الذين يعانون من الأمراض العصبية والنفسية، وذلك باستخدام أنسجة حاسة الشم التي تم الحصول عليها بأمان من الخزعات الأنفية. للتغلب على العائق الذي تشكله SUBSTتلوث antial من الأنسجة حاسة الشم تحتاج فحص مع الخلايا غير العصبية، وقد وضعت نهجا جديدا للحصول السكان الخلية العصبية المخصب من خلال الجمع بين الخزعات الأنفية مع الليزر التقاط تسليخ مجهري. في هذه الدراسة، تم تطوير نظام التحقيق في التغيرات الجزيئية الحيوية المصاحبة للعلاج في الأنسجة العصبية والتحقق من صحتها، وذلك باستخدام عينة تجريبية صغيرة من المرضى BD تجنيدهم لدراسة الآليات الجزيئية من الاستجابة للعلاج الليثيوم.
Introduction
الاضطراب الثنائي القطب (BD) هو اضطراب شديد العصبية، والتي تتميز التغيرات المرضية في المزاج، ودفع والإدراك 1. وقد تبين الليثيوم المستخدمة لعلاج BD لتغيير مستويات ثابتة الدولة مرنا عدد كبير من الجينات في الدراسات الحيوانية 2، لكنه لا يزال غير معروف إذا تم المرتبطة الاستجابة السريرية في البشر 2 أي من هذه الجزيئات. ان فهم آلية استجابة الليثيوم تتطلب التحقيق التغيرات التي يسببها الليثيوم الجزيئية في الأنسجة العصبية. للأسف، أنه ليس من العملي للحصول على الخزعات الدماغ من المرضى BD قبل والعلاج ما بعد الليثيوم لتحديد التوقيعات الجزيئية للاستجابة ليثيوم. وقد استخدمت أنسجة المخ بعد الوفاة لدراسة المؤشرات الحيوية في BD، ومع ذلك، فإنها لا يمكن أن تستخدم لتقييم الواسمات الجزيئية المرتبطة مع التغيرات الديناميكية في العواطف، والإدراك ومحرك. وصلاحية التأكد بأثر رجعي الاستجابة للعلاج الليثيوم يمكن أن يكون مشكلة 4. الخلايا الليمفاوية وخلايا الدم الأخرى يمكن أن تكون مفيدة، ولكن قد لا تتضمن التغييرات الجزيئية في خلايا الدم التعديلات العصبية 3-5. قد يكون السائل النخاعي غير كاف للحصول على معلومات على الجزيئات داخل الخلايا التي قد تعكس التغيرات الجوهرية المرتبطة المرض والدواء عكسها.
الظهارة الشمية (OE) هي جزء فريد من الجهاز العصبي المركزي (CNS)، المتعلقة جنيني لهياكل الحوفي 6؛ ويمكن الوصول إليه بسهولة من خلال الخزعات الأنفية. وهو يتألف من الدبقية مثل دعم خلايا الخلايا (أي معلاقية)، القاعدية تتكاثر، والخلايا العصبية مستقبلات الشم في مراحل مختلفة من التنمية 7-9. ولذلك، يوفر OE فرصة فريدة لدراسة إتاحتها التغيرات الديناميكية في الجهاز العصبي المركزي من المرضى الذين يعانون من الأمراض العصبية والنفسية (7). دراسات يتظاهرون الأداة المساعدة للOE باعتباره الأنسجة البديلة للتحقيق في أحداث الأمراض المرتبطة بها والتي تعكس تلك أورينتurring في الخلايا العصبية في الدماغ 8،9. على سبيل المثال، واستخدمت دراسات OE للتحقيق الشخصية الجزيئية المرتبطة بظروف نفسية 10-14. يخدم نظام حاسة الشم أيضا لتحديد endophenoytpes السريرية مثل العجز رائحة التي ترتبط مع الأعراض السلبية للفصام 15. بالإضافة إلى ذلك، لا تزال عمليات النمو العصبي في OE في جميع مراحل الحياة، وتوفير وسيلة مفيدة لنموذج الفيزيولوجيا المرضية الكامنة وراء الظروف للأمراض النفسية 8،9.
ومع ذلك، فإن العائق إلى استخدام هذا النسيج هو تلوث كبير من الخزعات حاسة الشم مع الخلايا غير العصبية 16. على سبيل المثال، RNA الكلي المستخدمة للدراسات التعبير الجيني في الدراسات السابقة OE يتضمن الحمض النووي الريبي المستخرج من الأنف كلها تحتاج فحص الأنسجة بما في ذلك الحمض النووي الريبي من الخلايا غير العصبية 17. ولذلك، النهج السابقة كانت محدودة بسبب نوعية الخلايا. للتغلب على هذه المشكلة، نهجا جديدا للحصول على وقد وضعت السكان الخلية العصبية المخصب من خلال الجمع بين الخزعات الأنفية مع الليزر التقاط تسليخ مجهري (LCM) 18.
LCM هو الاسلوب الذي يسمح لعزل انتقائي من الخلايا باستخدام القطع بالليزر والأشعة فوق البنفسجية جنبا إلى جنب مع الأشعة تحت الحمراء ليزر 19-21. الجمع بين LCM مع نهج OE يقلل من تلوث كبير من OE من الخلايا غير العصبية، وبالتالي تعزيز تخصيب الخلايا العصبية (18). وعلاوة على ذلك، وطبقة الخلايا العصبية يمكن تمييزها عن الطبقة تحت المخاطية تحت المجهر، مما يلغي الحاجة لتلطيخ. يمكن أن يزيد من أنواع الخلايا العصبية يمكن تمييزها من السكان الخلية الأخرى باستخدام الأجسام المضادة الأولية التي أعرب عنها نوع من الخلايا ذات الاهتمام 7. لذلك، هذا الإجراء يؤسس أسهل طريقة لإثراء السكان الخلية العصبية تقريبا بحتة والتي يمكن استخدامها للدراسات التعبير الجيني، المناعية والتحقيقات الشكلية الأخرى.
ve_content "> وتهدف هذه الدراسة إلى إنشاء منصة تجريبية للتحقيق التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية الشمية المرتبطة الحالات المرضية والاستجابة للعلاج. ولمعالجة ذلك، مجموعة صغيرة من المرضى غير المدخنين الذين اجتمعوا المعايير التشخيصية DSM-IV لBD على أساس تم تجنيده في مقابلة التشخيصية للدراسات الجينية (DIG) 22 إلى الخضوع لاثنين من خزعات الأنف: خزعة واحدة قبل العلاج مع الليثيوم وخزعة الثاني، وبعد 6 أسابيع من العلاج الليثيوم عن طريق الفم يوميا وعلاوة على ذلك، يجب أن المرضى BD مؤهلا أن يكون: أعراض للاكتئاب ، استنادا إلى سجل ≥10 من أصل 60 في الطبيب تدار مونتغمري-Asberg تقييم مقياس (مادرس) 23؛ أعراض لهوس خفيف أو الهوس، استنادا إلى النتيجة ≥10 من أصل 56 على الطبيب تدار يونغ هوس تقييم مقياس (YMRS) 24؛ أو ≥10 على كل مادرس وYMRS معامل المقيم المشتركة بين المقيم الاتفاق بين الأطباء على حد سواء المقاييس هو> 0.96 بعد الخزعات، كانت الخلايا العصبية ENRI.جنة التعليم العالي من قبل OE LCM. وبعد اتخاذ تدابير إضافية لمراقبة الجودة، لضمان استخراج عالية الجودة RNA من الأنسجة والخلايا العصبية التخصيب، وأجريت في الوقت الحقيقي RT PCR للتحقيق مستويات ما قبل والتعبير بعد العلاج من الجينات في المصالح. تحتوي الأقسام التي تلت ذلك وصفا للتأكد من صحة هذا النهج، وتسليط الضوء على تعظيم الاستفادة من البروتوكول والاستراتيجيات التي تم تطبيقها للبروتوكول اطلاق النار المتاعب.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: جميع المتطوعين للبحث في هذه الدراسة كانت تدار وثائق الموافقة المسبقة التي وافق عليها مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة هوارد وجامعة جونز هوبكنز. التحق الوحيد المشاركين الذين وافقوا من خلال التوقيع على وثائق الموافقة المسبقة في الدراسة. القاعدة الدراسة لهذا التحليل تتكون من: 20 المواضيع (12 دينار بحريني و 10 الضوابط؛ و 30٪ ذكور) وتعني عمر (SD) 38.2 (14.1) سنة.
ملاحظة: رش جميع الأسطح مع ريبونوكلياز انطلق لإزالة التلوث ريبونوكلياز من الزجاج والبلاستيك السطوح.
1. خزعة الداخلي
- رذاذ موضعي يدوكائين (الزيلوكائين) السائل 4٪ وأوكسي ميتازولين حمض الهيدروكلوريك 0.05٪ في تجويف الأنف من المشارك الدراسة والسماح 15 دقيقة من الذهول الوقت.
- نقع cottonoids الجراحية ½ × 3 بوصة في خليط من يدوكائين وأوكسي ميتازولين وضعه في تجويف الأنف على طول الجزء العلوي من الحاجز الأنفي والسماح للجلوس لمدة 15 دقيقة.
- باستخدام 30 ° جامدةالمنظار الأنفي لتحديد موقع الجزء العلوي من تجويف الأنف، وإزالة الغشاء المخاطي للأنف باستخدام ما يصل العض ملقط الأنف من الجزء العلوي من الحاجز الأنفي، مع عدة عينات صغيرة.
2. إعداد كتل الأنسجة
- مباشرة قبل خزعة، وملء cryomolds معيار الحجم مع الأنسجة المجمد المتوسطة.
- باستخدام الملقط تعقيمها، جبل أنسجة جديدة في المتوسط تجميد وتجميد الثلج الجاف. ملء ما تبقى من cryoblock مع تجميد المتوسطة، وتجميد cryoblock على الثلج الجاف، وكتل متجر في -80ºC.
3. Cryosectioning
- إعداد البولي ايثيلين naphthalate (PEN) الشرائح الزجاجية غشاء فورا قبل cryosectioning. رش الشرائح مع حل ريبونوكلياز انطلق لمدة 5 دقائق. ثم شطف الشرائح في diethylpyrocarbonate (DEPC) المياه والسماح الهواء الجاف لمدة 30 دقيقة. تفعيل الشرائح المجففة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
- Cryosection كل كتلة تماما في 30 ميكرون. الحفاظ على الشرائح ط الجافم، وأقسام تجميد قدر الإمكان. متجر الشرائح في -80 درجة مئوية عند الانتهاء.
4. الليزر والتقاط تسليخ مجهري
- تبدأ من خلال التجفيف الشرائح مباشرة قبل تسليخ مجهري. السماح الشرائح المجمدة ذوبان الجليد لمدة 10 ثانية، ثم قم بتطبيق سلسلة الإيثانول التالية إلى كل شريحة: 60٪ (2 مل، 15 ثانية)، 80٪ (2 مل، 15 ثانية)، 95٪ (3 مل، 25 ثانية)، 100 ٪ (7 مل، 60 ثانية).
- تحويل photoactivated توطين المجهري (PALM) المجهر على وتعيين إلى الشروط التالية: ل10X التكبير تعيين الطاقة إلى 82، والتركيز إلى 74، وسرعة إلى 25 - 30. ل20X التكبير، تعيين الطاقة إلى 63، والتركيز إلى 67، وسرعة إلى 5 - 6. ضبط عند الضرورة للحصول على نتائج قطع المثلى.
- تحديد بصريا الخلايا العصبية باستخدام 20X 10X أو التكبير. وتميز سطح طبقة رقيقة الخلايا العصبية الشمية من الأساسي الغشاء المخاطي الفرعي تحت المجهر دون استخدام الإجراء تلطيخ. مراقبة الخلايا العصبية على أنه مظهر عمودي كثيف 18.
- باستخدام وظيفة قلم رصاص في المجهر المذكورون في الخطوة 4.2، وتتبع في جميع أنحاء طبقة الخلايا العصبية. تتبع بعيدا قليلا من الخلايا العصبية لمنع حرق الخلايا العصبية من الليزر. وهذا أمر ضروري للحصول على RNA ذات جودة عالية. ثم بدء الموجهة بالليزر القطع.
- التقاط أقسام تشريح باستخدام غرامة غيض ملقط تسليخ مجهري ووضع الأنسجة في microtube تحتوي على 100 ميكرولتر تحلل العازلة على الجليد. أكرر للجميع أقسام العصبية التي تم الحصول عليها من عينة واحدة. مجموع الوقت تشريح لكل عينة يجب أن لا تتجاوز 50 دقيقة.
- مرة واحدة تشريح هو كاملة، وعلى الفور دوامة عينة لست] والحفاظ على الثلج الجاف. عينات في مخزن -80ºC لمجموع العزلة RNA.
5. عزل إجمالي RNA وتحليل مراقبة الجودة
- لست] عينة ذوبان الجليد على الجليد. تنفيذ الإجمالية العزلة RNA مع RNAqueous مايكرو كيت مع الدناز-I تعطيل باتباع بروتوكول الشركة المصنعة مع أي تعديلات (انظر <قوي الشكل> 1). إجمالي حجم شطف ما يقرب من 20 ميكرولتر.
- قياس تركيز الحمض النووي الريبي وتقييم نوعية RNA مع RNA النزاهة عدد (رين) باستخدام Bioanalyzer. عينات التي تلبي معايير مراقبة الجودة في الشكل (2) يمكن أن تستخدم لتخليق [كدنا].
6. [كدنا] التجميعي
- توليف [كدنا] باستخدام طقم التجارية المصادق (انظر الجدول من الكواشف). تنفيذ الخطوة الصلب من خلال الجمع بين 0،1-1،0 نانوغرام من الحمض النووي الريبي (اعتمادا على توافر) وريبونوكلياز المياه مجانا إلى إجمالي حجم 8 ميكرولتر في أنبوب. ثم إضافة 1 ميكرولتر من جزئية د (T) 20 التمهيدي و1 ميكرولتر من 10 ملي dNTP المزيج في أنبوب، لحجم ما مجموعه 10 ميكرولتر.
- بلطف دوامة وأجهزة الطرد المركزي العينات وعينات يصلب عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد الانتهاء من رد الفعل، وعينات باردة على الفور على الجليد.
- يعد حل مزيج الرئيسي وفقا للمواصفات في الجدول 1. ثم يضاف 9.5 μل مزيج الرئيسي و 0.5 ميكرولتر من الناسخ العكسي استعداد تجاريا (RT) إلى كل أنبوب. إضافة 0.5 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية المياه للسيطرة على أنبوب بدلا من RT.
- تشغيل رد فعل RT مع الحضانة الأولى في 50 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة، ثم 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والنهائي على عقد 4 درجات مئوية، مع عدم ركوب الدراجات.
- تمييع جميع العينات التي 5X بالماء وقسامة. عينات في مخزن -80 درجة مئوية.
7. في الوقت الحقيقي PCR - تأكيد العصبية التخصيب
- إعداد الحل مزيج الرئيسي وفقا لمواصفات في الجدول 2. استخدم الرقابة الداخلية مثل GAPDH. قارن حاسة الشم البروتين علامة (المرصد المغربي للسجون) التعبير في الأنسجة microdissected مع التعبير المرصد المغربي للسجون في الأنسجة undissected لتحديد تخصيب الخلايا العصبية.
ملاحظة: المرصد المغربي للسجون هو علامة للحصول على الخلايا العصبية الشمية.
المرصد المغربي للسجون تسلسل: إلى الأمام، 5'-CTGTCGGACCTGGCCAAG-3 "
عكس، 5'-CACCCTCGCCAAAGGTGA-3 "
تسلسل GAPDH: إلى الأمام، 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 "
عكس، 5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 ". - إعداد PCR لوحة بإضافة 7 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في كل بئر و 3 ميكرولتر من [كدنا].
- لوحة أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x ج (1،300 دورة في الدقيقة). رد فعل تشغيل في الوقت الحقيقي-PCR باستخدام الافتراضي الظروف الدراجات الحرارية المحددة لsupermix التجاري مثل SYBR خضرة QPCR.
- تحليل البيانات (انظر الشكل 2 للمواصفات).
8. في الوقت الحقيقي PCR - التعبير عن الجينات الاهتمام
- أداء على عينات التي تظهر تخصيب الخلايا العصبية من 2 أضعاف أو أكثر.
- تحضير مزيج الرئيسي على الجليد لكل التحقيق (التحقيق المسمى FAM المصالح وVIC المسمى GAPDH) في أنابيب منفصلة وفقا للمواصفات الواردة في الجدول 3.
- إعداد لوحة PCR مع 8 ميكرولتر مزيج الرئيسي في كل بئر و 2 ميكرولتر من [كدنا].
- أجهزة الطرد المركزي لوحة لمدة 5 دقائق في 300 x ج (1،300 دورة في الدقيقة). تشغيل ريال مدريد رد فعل الزمن-PCR باستخدام مواطنهأولت الظروف الدراجات الحرارية حسب التعبير الجيني بروتوكول مزيج الرئيسي المقدمة من قبل الشركة المصنعة. تحليل النتائج التعبير (انظر الشكل 2 للمواصفات).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم الأمثل استراتيجية البروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في دراسة التوقيعات الجزيئية بنجاح. جودة RNA ومعايير تخصيب الخلايا العصبية للعينات لاستخدامها في مزيد من المصب الحقيقي تحليل الوقت-PCR وموحدة. تم فحص RIN وتركيز الحمض النووي الريبي عن العوامل المربكة لمستويات التعبير الكشف عنها. استنادا إلى تحليل العديد من العينات مع RINs تتراوح ما بين 1 - 10، تقرر أن الحد الأدنى للRIN من ~ 3.0 وما فوق يكفي لتحليل المصب في هذه الدراسة. ونتيجة لذلك، تم توحيد كمية RNA ل[كدنا] التوليف إلى 1.0 نانوغرام. وهكذا، وعينات جودة عالية مع RIN فوق ~ تم تحويل 3.0 و RNA مبلغ 1.0 نانوغرام في كدنا]. العينات مع 0،1-1،0 نانوغرام من الحمض النووي الريبي يمكن أن تستخدم إذا كان حجم كاف عينة من الصعب الحصول عليها.
وأكد تخصيب الخلايا العصبية باستخدام التحليل الحقيقي الوقت-PCR. وتمت مقارنة المرصد المغربي للسجون مستويات التعبير الجيني في عينات microdissected مع تلك الموجودة في العينة undissectedالصورة لتحديد ما إذا كان إثراء طبقة الخلايا العصبية. وتستخدم عينات Microdissected مع اثنين أضعاف أو أكبر تعبير المرصد المغربي للسجون مقارنة مع الأنسجة غير تشريح.
ولذلك، من خلال تطبيق هذه المعايير، وجدوى هذا النهج المقترح لدراسة التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية OE تم التحقق من صحتها. الشكل (3) يوضح أن مستويات التعبير عن GSK-3β تتأثر الليثيوم بدلا من عوامل خارجية غير محددة، مشيرا إلى أن هذه المنهجية غير كافية للكشف عن التغيرات الجزيئية محددة قبل وبعد العلاج الليثيوم. وبشكل أكثر تحديدا، التعديلات التوقيعات الجزيئية المرتبطة الاستجابة للعلاج الليثيوم في BD يمكن معالجتها عن طريق الجمع بين هذه البيانات الجزيئية مع البيانات السريرية.
الشكل 1. استخراج الحمض النووي الريبي وبروتوكول التعطيل الدناز. وflowcharر يوضح الإجراء لاستخراج الحمض النووي الريبي من عينات بعد LCM. ومزال الحمض النووي الريبي مجموع مرتين لتسفر عن حجم RNA أقصى ما يقرب من 20 ميكرولتر. عينات مزال ثم يخضع I العلاج الدناز لتعطيل الدناز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. بروتوكول ملخص. ويلخص هذا الرقم بروتوكول كامل للتجارب الدراسة. وتحتاج فحص الأنسجة الأنفية أولا وتجميد كما cryoblocks. بعد باجتزاء من الأنسجة، وطبقات الخلايا العصبية يتم تشريح تستخدم LCM. يتم تنفيذ استخراج الحمض النووي الريبي والدناز تعطيل باستخدام المبادئ التوجيهية الشركة المصنعة (انظر الشكل 1). وتستخدم العينات التي تلبي معايير مراقبة الجودة (رين وكمية RNA) لتجميع كدنا] ولناإد لتحليل تخصيب الخلايا العصبية. وتستخدم عينات المخصب في ريال مدريد تحليل الوقت-PCR مع الأهداف المرجوة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. GSK-3β التعبير في BD ومراقبة العينات. ويوضح هذا الرقم التغيرات في مستويات التعبير GSK-3β في عينات BD قبل وبعد العلاج الليثيوم والاتساق في مستويات التعبير GSK-3β في عينات السيطرة بين خزعة الأول والثاني. أخذت معا، وتظهر هذه البيانات أن GSK-3β التعبير يتأثر الليثيوم بدلا من عوامل خارجية غير محددة.
| الكواشف | حجم |
| 10 × RT العازلة | 2 ميكرولتر |
| 25 ملي MgCl | 4 ميكرولتر |
| 0.1 M DDT | 2 ميكرولتر |
| ريبونوكلياز خارج | 0.5 ميكرولتر |
| مرتفع III | 0.5 ميكرولتر |
| ريبونوكلياز المياه مجانا | 1 ميكرولتر |
الجدول 1. [كدنا] التجميعي ماستر الحل ميكس.
| الكواشف | X1 | س (# للعينات) |
| DNA قالب | 3 ميكرولتر | - |
| SYBR الخضراء | 5 ميكرولتر | |
| مزيج التمهيدي | 0.8 ميكرولتر | |
| ماء | 1.2 ميكرولتر | |
| مجموع | 10 ميكرولتر | - |
ق ق = "jove_content"> الجدول 2. العصبية التخصيب PCR ماستر الحل ميكس.
| الكواشف | X1 | س (# العينات / التمهيدي) |
| dWater | 2 ميكرولتر | |
| ميكس ماجستير | 5 ميكرولتر | |
| FAM التحقيق المسمى | 0.1 ميكرولتر | |
| VIC التحقيق المسمى | 0.5 ميكرولتر | |
| [كدنا] | 2 ميكرولتر | - |
الجدول 3. الهدف PCR ميكس ماجستير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويرد منصة جديدة للحصول على المخصب طبقات الخلايا العصبية الشمية من خلال الجمع بين خزعة الأنف وLCM وتم التأكد من صلاحيتها في هذه الدراسة. هذه التقنية يمكن أن يكون لها آثار واسعة النطاق. ويمكن تطبيقه نحو الدراسات العلامات البيولوجية، بما فيها تلك المتعلقة الاستجابة للعلاج، وجهود اكتشاف الأدوية لحالات عصبية ونفسية أخرى، مما يجعل تأثير أوسع في هذا المجال.
للحصول على الخلايا العصبية عالية الجودة قابلة للتطبيقات المصب، لا بد من الإشارة بضع خطوات حاسمة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. أولا، يجب الحصول 4-6 قطع من الأنسجة حاسة الشم لكل مريض أن يكون هناك حجم كاف العينة. وثانيا، لأن عينات عرضة للتدهور RNA، والحفاظ على الأنسجة في درجات الحرارة المناسبة، والعمل مع ريبونوكلياز المعدات والأسطح الحرة، قفازات الاستخدام، وتجنب التنفس مباشرة عبر العينات. إذا كانت جودة RNA لا تزال منخفضة، والنظر في استكمال تسليخ مجهري بعد 50 دقيقة وأداء استخراج الحمض النووي الريبي مباشرة بعد تشريح أو vortعينات السابقين فورا والحفاظ على الثلج الجاف حتى التخزين في -80 ° C. لزيادة العائد من الحمض النووي الريبي، وزيادة عدد الأقسام تشريح خلال LCM.
وثمة تحد من دراسة التغيرات الجزيئية المرتبطة الدماغ في الاضطرابات العصبية والنفسية موجود نظرا لعدم إمكانية الوصول لدراسة الدماغ البشري. وتشمل النهج البديلة دراسة خلايا الدم الطرفية، والعقول تشريحها، والجذعية المحفزة (آي بي إس) الخلايا. قد لا تمثل خلايا الدم التغيرات العصبية المصاحبة للمرض. أدمغة تشريحها لا يمكن أن يكون المورد إلى دراسة التغيرات الدينامية والدولة المرتبطة تطور المرض واستجابة المريض للأدوية. قد لا تعكس خلايا الجذع مباشرة التغييرات الدولة، لأن مثل هذه الاثار من المرجح أن تمحى من خلال إعادة برمجة وصيانة الخلايا. ولذلك، فإن مزايا استخدام الأنسجة OE هي القدرة على دراسة كلا من التغيرات الدولة وديناميكية في سياق الخلايا العصبية. على وجه الخصوص، الجذع المستمدة الجذعية العصبيةقد لا تعكس الخلايا بشكل كاف تأثير 6 أسابيع من العلاج الليثيوم، وذلك بسبب زراعة وإعادة برمجة الخطوات. منهجية الواردة في هذه الورقة يسمح لنا لدراسة التغيرات الجزيئية المرتبطة العلاج وربطها التغييرات في الأعراض السريرية. وتجدر الإشارة إلى أنه، على الأقل في الوقت الحاضر، فإن كمية الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها من الأنسجة OE كافية للدراسات على المستوى الجزيئي، ولكن قد لا يقتصر على توصيف البروتينات من خلال تطبيقات المناعية. وبالتالي، من المتوقع أيضا إدخال المزيد من التحسينات التقنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
واضعو التقرير أي علاقات مالية مع المصالح التجارية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Tissue-Tek Cryomold Molds | Sakura Finetek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cryosectioning | |||
| Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 | |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 | |
| DEPC Treated Water | Quality Biological | 351-068-131 | |
| Microdissection | |||
| Microscope: PALM Series MicroLaser System | Carl Zeiss Microscopy | Model: Axiovert 200M Software: Robo v3.2 |
|
| No. 5 Dumont Microdissction Forceps | Roboz | RS-49085 | |
| RNA Extraction | |||
| RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| cDNA Synthesis | |||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| OMP qPCR | |||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 | |
| Taqman qPCR | |||
| TaqMan Expression Assay Probes | Applied Biosystems | Various | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
References
- Goodwin, F. K., Jamison, K. R. Manic-depressive illness. , Oxford University Press. (1990).
- Einat, H., Manji, H. K. Cellular plasticity cascades: genes-to-behavior pathways in animal models of bipolar disorder. Biol Psychiatry. 59 (12), 1160-1171 (2006).
- Severino, G., et al.
- Beech, R. D., et al. Gene-expression differences in peripheral blood between lithium responders and non-responders in the Lithium Treatment-Moderate dose Use Study (LiTMUS). Pharmacogenomics J. 14 (2), 182-191 (2013).
- Horiuchi, Y., et al. Olfactory cells via nasal biopsy reflect the developing brain in gene expression profiles: utility and limitation of the surrogate tissues in research for brain disorders. Neurosci Res. 77 (4), 247-250 (2013).
- Dryer, L., Graziadei, P. P. Projections of the olfactory bulb in an elasmobranch fish, Sphyrna tiburo: segregation of inputs in the telencephalon. Anat Embryol (Berl. 190 (6), 563-572 (1994).
- Hahn, C. G., et al. In vivo and in vitro neurogenesis in human olfactory epithelium. J Comp Neurol. 483 (2), 154-163 (2005).
- Cascella, N. G., Takaki, M., Lin, S., Sawa, A. Neurodevelopmental involvement in schizophrenia: the olfactory epithelium as an alternative model for research. J Neurochem. 102 (3), 587-594 (2007).
- Sawa, A., Cascella, N. G. Peripheral olfactory system for clinical and basic psychiatry: a promising entry point to the mystery of brain mechanism and biomarker identification in schizophrenia. Am J Psychiatry. 166 (2), 137-139 (2009).
- Mor, E., et al. MicroRNA-382 expression is elevated in the olfactory neuroepithelium of schizophrenia patients. Neurobiol Dis. 55, 1-10 (2013).
- Kano, S., et al. Genome-wide profiling of multiple histone methylations in olfactory cells: further implications for cellular susceptibility to oxidative stress in schizophrenia. Mol Psychiatry. 18 (7), 740-742 (2013).
- Toritsuka, M., et al. Deficits in microRNA-mediated Cxcr4/Cxcl12 signaling in neurodevelopmental deficits in a 22q11 deletion syndrome mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17552-17557 (2013).
- Evgrafov, O. V., et al. Olfactory neuroepithelium-derived neural progenitor cells as a model system for investigating the molecular mechanisms of neuropsychiatric disorders. Psychiatr Genet. 21 (5), 217-228 (2011).
- Fan, Y., et al. Focal adhesion dynamics are altered in schizophrenia. Biol Psychiatry. 74 (6), 418-426 (2013).
- Ishizuka, K., et al. Negative symptoms of schizophrenia correlate with impairment on the University of Pennsylvania smell identification test. Neurosci Res. 66, 106-110 (2010).
- Sattler, R., et al. Human nasal olfactory epithelium as a dynamic marker for CNS therapy development. Exp Neurol. 232 (2), 203-211 (2011).
- Rimbault, M., Robin, S., Vaysse, A., Galibert, F. RNA profiles of rat olfactory epithelia: individual and age related variations. BMC Genomics. 10, 572 (2009).
- Tajinda, K., et al. Neuronal biomarkers from patients with mental illnesses: a novel method through nasal biopsy combined with laser-captured microdissection. Mol Psychiatry. 15 (3), 231-232 (2010).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Fink, L., et al. Real-time quantitative RT-PCR after laser-assisted cell picking. Nat Med. 4 (11), 1329-1333 (1998).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Nurnberger, J. I. Jr, et al. Diagnostic interview for genetic studies. Rationale, unique features, and training. NIMH Genetics Initiative. Arch Gen Psychiatry. 51 (11), 849-859 (1994).
- Montgomery, S. A., Asberg, M. A new depression scale designed to be sensitive to change. Br J Psychiatry. 134, 382-389 (1979).
- Young, R. C., Biggs, J. T., Ziegler, V. E., Meyer, D. A. A rating scale for mania: reliability, validity and sensitivity. Br J Psychiatry. 133, 429-435 (1978).
