Summary
Neste estudo, um romance plataforma para investigar assinaturas moleculares intraneuronal de resposta ao tratamento do transtorno bipolar (TB) foi desenvolvido e validado. O epitélio olfatório de pacientes com TB foi obtido através de biópsias nasais. Em seguida, captura a laser microdissection foi combinado com Tempo real RT PCR para investigar a assinatura molecular de resposta de lítio em BD.
Abstract
O transtorno bipolar (TB) é uma doença neuropsiquiátrica grave com fisiopatologia mal compreendido e, normalmente tratados com o estabilizador de humor, carbonato de lítio. Os estudos em animais, bem como estudos genéticos humanos indicam que o lítio afecta alvos moleculares que estão envolvidas no crescimento neuronal, a sobrevivência e a maturação, e nomeadamente as moléculas envolvidas na sinalização de Wnt. Dado o desafio ético para a obtenção de biópsias cerebrais para investigar as alterações moleculares associadas a dinâmicas de lítio-resposta no sistema nervoso central (SNC), pode-se considerar o uso de neurônios obtidos a partir de tecidos olfativos para alcançar este goal.The epitélio olfatório contém neurônios receptores olfativos em diferentes fases de desenvolvimento e glia do tipo células de suporte. Isso proporciona uma oportunidade única para estudar as alterações dinâmicas do CNS de pacientes com doenças neuropsiquiátricas, usando tecido olfativo obtido com segurança a partir de biópsias nasais. Para superar o problema colocado por substantial contaminação de tecido biopsiado olfactivo com células não neuronais, uma nova abordagem para a obtenção de populações de células neuronais enriquecido foi desenvolvido através da combinação de biópsias nasais com captura por laser microdissecação. Neste estudo, um sistema para investigar as alterações moleculares dinâmicas associadas ao tratamento no tecido neuronal foi desenvolvido e validado, utilizando uma pequena amostra piloto de pacientes com TB recrutados para o estudo dos mecanismos moleculares de resposta ao tratamento de lítio.
Introduction
O transtorno bipolar (TB) é uma doença neuropsiquiátrica grave, caracterizada por alterações patológicas do humor, conduzir e cognição 1. Lítio utilizada para o tratamento de BD tem sido mostrado para alterar os níveis de mRNA de estado estacionário de um grande número de genes em estudos com animais 2, mas continua a ser desconhecida, se qualquer destas moléculas está associada com a resposta clínica em seres humanos 2. Compreender o mecanismo de resposta de lítio exigiria investigar alterações moleculares induzidas por lítio em tecidos neuronais. Infelizmente, não é prático para a obtenção de biópsias do cérebro de pacientes com TB pré e pós-terapia de lítio para identificar assinaturas moleculares de resposta de lítio. Tecidos cerebrais pós-morte foram usados para estudar biomarcadores em BD, no entanto, eles não podem ser usados para avaliar marcadores moleculares associados com mudanças dinâmicas na emoções, cognição e dirigir; e a validade do retrospectivamente apurado resposta ao tratamento de lítio pode ser problemático 4. Os linfócitos e outras células do sangue pode ser útil, mas as mudanças moleculares nas células do sangue podem não refletir alterações neuronal 3-5. O líquido cefalorraquidiano pode ser insuficiente para obter informações sobre as moléculas intracelulares que podem refletir mudanças intrínsecas associados à doença e medicação reversível.
O epitélio olfatório (OE) é uma parte única do sistema nervoso central (SNC), relacionada com a embryologically de estruturas límbicas 6; e é facilmente acessível através de biópsias nasais. É constituída por glial-células como células de suporte (ou seja, sustentaculares), basais em proliferação e neurónios dos receptores olfactivos em diferentes fases de desenvolvimento 7-9. Portanto, OE oferece uma oportunidade única para estudar acessível mudanças dinâmicas no SNC de pacientes com doenças neuropsiquiátricas 7. Estudos demonstram a utilidade do OE como um substituto do tecido para investigar acontecimentos de doença associados que reflectem aquelas occurring nos neurônios do cérebro 8,9. Por exemplo, estudos têm utilizado OE para investigar os perfis moleculares associados com condições psiquiátricas 10-14. Olfactiva sistema também serve para identificar endophenoytpes clínicos, tais como défices cheiro que estão associados com sintomas negativos da esquizofrenia 15. Além disso, os processos de desenvolvimento neurológico continuar no OE ao longo da vida, fornecendo um caminho útil para modelar a fisiopatologia subjacente de condições psiquiátricas 8,9.
No entanto, uma desvantagem da utilização deste tecido é a contaminação substancial de biópsias olfactivos com células não-neuronais 16. Por exemplo, o RNA total usado para estudos de expressão de genes em estudos anteriores OE continha RNA extraído de todo o tecido biopsiado nasal incluindo ARN a partir de células não-neuronais 17. Portanto, abordagens anteriores têm sido limitados pela qualidade das células. Para superar esse problema, uma nova abordagem para obter populações de células neuronais enriquecido por combinando biópsias nasais com captura a laser microdissection (LCM) foi desenvolvido 18.
LCM é uma técnica que permite o isolamento selectivo de células usando corte por laser combinado com UV de infra-vermelho do laser 19-21. Combinando LCM com OE abordagem minimiza a contaminação substancial de OE por células não-neuronais, aumentando assim o enriquecimento de células neuronais 18. Além disso, a camada neuronal pode ser distinguida a partir da submucosa, sob um microscópio, eliminando assim a necessidade de coloração. Tipos de células neuronais pode ainda ser distinguida de outras populações de células, utilizando anticorpos primários que são expressas pelo tipo celular de interesse 7. Por conseguinte, este procedimento estabelece um método mais fácil para o enriquecimento da população de células quase puramente neuronal que pode ser utilizada para estudos de expressão de genes, imuno-histoquímica e outras investigações morfológicas.
ve_content "> Este estudo visa estabelecer uma plataforma experimental para investigar as alterações moleculares em neurônios olfativos associadas a estados de doença e resposta ao tratamento. Para resolver isso, um pequeno grupo de pacientes não-fumantes, que preencheram os critérios diagnósticos do DSM-IV para BD baseado em Entrevista Diagnóstica para Estudos Genéticos (DIG) 22 foi recrutado para passar por duas biópsias nasais: uma biópsia pré-tratamento com lítio e a segunda biópsia, após 6 semanas de tratamento com lítio oral diária Além disso, os pacientes com TB elegíveis devem ser:. sintomático para a depressão , com base na pontuação ≥10 de 60 em o clínico administrado Montgomery-Asberg Rating Scale (MADRS) 23; sintomática de hipomania ou mania, baseado em uma pontuação ≥10 de 56 sobre o clínico administrado Young-Mania Rating Scale (YMRS) 24;. ≥10 ou em ambos MADRS e YMRS coeficiente Rater-Inter-Rater de acordo entre os clínicos para ambas as escalas é> 0,96 Depois de biópsias, os neurônios foram enri.ched do OE por LCM. Na sequência das medidas adicionais de controle de qualidade, para garantir a extração de RNA de alta qualidade a partir do tecido e enriquecimento neuronal, Tempo real RT PCR foi realizado para investigar os níveis pré e pós-tratamento de expressão de genes de interesse. As seções seguintes, conter uma descrição da validação desta abordagem, com destaque para a otimização do protocolo e as estratégias que foram aplicadas para o protocolo de resolução de problemas.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Todos os voluntários da pesquisa neste estudo foram administrados documentos de consentimento aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Howard e Johns Hopkins University. Somente os participantes que consentiram ao assinar os documentos de consentimento informado foram incluídos no estudo. A base de estudo para esta análise foram: 20 indivíduos (12 BD e 10 controles, 30% do sexo masculino) e idade (DP) de 38,2 (14,1) anos significam.
NOTA: Spray de todas as superfícies com RNase Zap para eliminar a contaminação RNase de superfícies de vidro e plástico.
1. Biópsia Procedimento
- Pulverize tópica lidocaína (xilocaína) líquido 4% e oximetazolina HCl 0,05% na cavidade nasal do participante do estudo e permitir que 15 minutos de tempo de entorpecente.
- Mergulhe cotonóides cirúrgicos ½ x 3 polegadas em uma mistura de lidocaína e oxymetazoline e inserir na cavidade nasal ao longo da parte superior do septo nasal e deixe descansar por 15 min.
- Usando um 30 ° rígidaendoscópio nasal para localizar a seção superior da cavidade nasal, remover mucosa nasal, utilizando-se de roer forceps nasais a partir da porção superior do septo nasal, tendo várias pequenas amostras.
2. Preparação de blocos de tecidos
- Imediatamente antes da biópsia, preencher cryomolds tamanho padrão com tecido congelamento médio.
- Com uma pinça autoclavado, montar tecido fresco no meio de congelamento e congelar em gelo seco. Preencha restante cryoblock com o meio de congelamento, congelar cryoblock em gelo seco, e armazenar blocos a -80ºC.
3. cryosectioning
- Prepare o naftalato de polietileno (PEN) lâminas de vidro imediatamente antes da membrana cryosectioning. Spray de slides com solução RNase Zap por 5 min. Em seguida, lavar as lâminas em dietilpirocarbonato (DEPC) de água e deixe secar por 30 min. Ative lâminas secas sob luz UV por 30 minutos.
- Cada criocorte bloquear completamente a 30 um. Mantenha lâminas sobre i secaCE e cortes congelados, tanto quanto possível. Loja slides em -80 ºC após a conclusão.
4. Laser-Capture Microdissection
- Comece por desidratação lâminas imediatamente antes microdissection. Vamos lâminas congeladas descongelar por 10 s, e em seguida, aplique a seguinte série de etanol para cada slide: 60% (2 ml, 15 segundos), 80% (2 ml, 15 segundos), 95% (3 ml, 25 seg), 100 % (7 ml, 60 seg).
- Vire microscopia localização fotoactivado (PALM) microscópio e definido para as seguintes condições: Para aumento de 10x definir a energia para 82, o foco para 74, e velocidade para 25 - 30. Para ampliação de 20x, defina a energia para 63, o foco para 67, e velocidade de 5 - 6. Ajustar conforme necessário para se obter resultados óptimos de corte.
- Visualmente identificar neurônios utilizando 20X ou 10X de ampliação. Distinguir a superfície fina camada subjacente neurónio olfactivo de sub-mucosa sob um microscópio sem o uso do procedimento de coloração. Observe neurônios como um aspecto colunar densa 18.
- Usando a função Pencil no microscópio acima mencionado na etapa 4.2, contorne a camada neuronal. Traçar um pouco longe de neurônios para evitar a queima de neurônios de laser. Isto é essencial para a obtenção de RNA de alta qualidade. Em seguida, inicie o corte a laser guiada.
- Pegue seções dissecadas usando uma pinça de ponta fina microdissecção e colocar o tecido em um microtubo contendo 100 mL de tampão de lise em gelo. Repita o procedimento para todas as seções neuronais obtidos a partir de uma única amostra. Tempo de dissecção total por amostra não deve ultrapassar 50 min.
- Uma vez que a dissecção é completas, imediatamente lisados amostra de vórtice e manter em gelo seco. Armazene as amostras a -80ºC para isolamento do RNA total.
5. Isolamento de ARN total e análise de controle de qualidade
- Lisados amostra Descongele no gelo. Realizar isolamento total RNA com RNAqueous Micro Kit com DNase-I inativação, seguindo o protocolo do fabricante, sem modificações (veja <forte> Figura 1). O volume total de eluição é de aproximadamente 20 l.
- Medir a concentração de RNA e avaliar a qualidade do RNA com RNA Integrity Number (RIN) usando Bioanalyzer. As amostras que atendem aos critérios de controle de qualidade na Figura 2 pode ser usado para a síntese de cDNA.
6. Síntese de ADNc
- Sintetizar cDNA utilizando um kit comercial validado (ver Tabela de Reagentes). Realizar o passo de recozimento através da combinação de 0,1-1,0 ng de ARN (dependendo da disponibilidade) e RNase isenta de água para um volume total de 8 ul por tubo. Em seguida, adicionar 1 ml de oligo d (T) 20 e iniciador 1 ul de 10 mM de dNTP mix por tubo, para um volume total de 10 ul.
- Delicadamente amostras de vórtice e centrifugação e amostras de recozimento a 65 ° C por 5 min. Depois da reacção estar completa, as amostras frescas imediatamente em gelo.
- Preparar a solução de mistura principal de acordo com as especificações da Tabela 1. Em seguida, adicione 9,5 μmistura l mestre e 0,5 ul de preparados comercialmente transcriptase reversa (TR) para cada tubo. Adicionar 0,5 mL de água livre de RNase para controlar tubo em vez de RT.
- Executar uma reacção de RT com a primeira incubação a 50 ºC durante 50 min, em seguida 85 ° C durante 5 min e uma retenção finais 4 ° C, sem ciclagem.
- Diluir todas as amostras de 5x com água e alíquota. Armazene as amostras a -80 ºC.
7. PCR em Tempo Real - Confirme Neuronal Enriquecimento
- Preparar a solução de mistura principal de acordo com as especificações da Tabela 2. Use um controle interno, como GAPDH. Compare expressão olfativa proteína marcadora (OMP) no tecido microdissecados com expressão OMP no tecido não dissecado para determinar enriquecimento neuronal.
NOTA: OMP é um marcador de neurônios olfativos.
OMP sequência: para a frente, 5'-CTGTCGGACCTGGCCAAG-3 '
reverso, 5'-CACCCTCGCCAAAGGTGA-3 '
Seqüência GAPDH: para a frente, 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 '
reverso, 5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 '. - Configurar placa PCR adicionando 7 l de mistura principal em cada poço e 3 l de cDNA.
- Placa Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg (1300 rpm). Reação Run real Time-PCR utilizando as condições de ciclos térmicos padrão especificado para Supermix comercial tal como SYBR Greener qPCR.
- Analisar dados (ver Figura 2 para as especificações).
8. PCR em Tempo Real - Expressão de genes de interesse
- Realizar em amostras que mostram o enriquecimento neuronal de 2 vezes ou mais.
- Prepare mix mestre em gelo para cada sonda (sonda marcada com FAM de interesse e VIC marcado GAPDH) em tubos separados de acordo com as especificações da Tabela 3.
- Configurar uma placa de PCR com mix mestre 8 mL em cada poço e 2 l de cDNA.
- Centrifugar a placa durante 5 minutos a 300 xg (1300 rpm). Execute reação real Time-PCR usando o defcondições de ciclos térmicos ault conforme o protocolo de mistura principal expressão do gene fornecido pelo fabricante. Analisar os resultados de expressão (veja a Figura 2 para obter as especificações).
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Representative Results
A estratégia de protocolo e solução de problemas no estudo de assinaturas moleculares foram otimizados com sucesso. Qualidade e critérios de enriquecimento de ARN para neuronais amostras para ser utilizado em mais a jusante análise PCR em tempo real foram padronizadas. RIN e concentração de RNA foram examinados como fatores de confusão para os níveis de expressão detectados. Com base na análise de diversas amostras com RINs variando de 1 - 10, foi determinado que um RIN mínimo de ~ 3,0 e acima é suficiente para a análise a jusante no presente estudo. Como resultado, a quantidade de ARN para a síntese de cDNA foi padronizado a 1,0 ng. Assim, amostras de alta qualidade com um RIN acima ~ 3.0 e ARN quantidade de 1,0 ng foram convertidos em ADNc. As amostras com 0,1-1,0 ng de RNA pode ser usada se um tamanho de amostra suficiente, é difícil de obter.
Enriquecimento Neuronal foi confirmada por meio de análise Time-PCR Real. OMP níveis de expressão de genes em amostras microdissecadas foram comparados com aqueles na amostra não dissecados para determinar se a camada neuronal foi enriquecido. São utilizados com amostras microdissecadas duas vezes ou mais em comparação com a expressão de OMP tecido não dissecado.
Portanto, aplicando-se estes parâmetros, a viabilidade desta abordagem proposta para estudar alterações moleculares em neurónios de OE foi validado. A Figura 3 ilustra que níveis de GSK-3β expressão são afectados por lítio, em vez de por factores exógenos não-específicos, indicando que esta metodologia é suficiente para detectar alterações moleculares específicos antes e após o tratamento com lítio. Mais especificamente, as alterações de assinaturas moleculares associados com a resposta ao tratamento de lítio em BD pode ser abordada através da combinação desses dados moleculares com os dados clínicos.
Figura 1. Extração de RNA e ADNase Inactivação protocolo. O flowchart ilustra o método de extracção de RNA a partir de amostras após LCM. O RNA total é eluído duas vezes para se obter um volume máximo de ARN de aproximadamente 20 jil. Amostras eluídas submetidos a um tratamento DNase I para DNase inativação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Protocolo Resumo. Esta figura resume todo o protocolo para experiências de estudo. Tecido nasal é feita a biópsia e congelados como cryoblocks primeiro. Após o corte do tecido, as camadas neuronais são dissecados usando LCM. Extracção de ARN e a inactivação de DNase são realizadas utilizando as orientações do fabricante (ver Figura 1). As amostras que atendem aos critérios de controle de qualidade (RIN e quantidade RNA) são usados para sintetizar cDNA e nosed para análise enriquecimento neuronal. Amostras enriquecidas são utilizados em análise real Time-PCR com os objectivos desejados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Expressão de GSK-3β em amostras de controlo e BD. Esta figura ilustra as alterações nos níveis de expressão de GSK-3β em amostras BD antes e depois de tratamento de lítio e de consistência dos níveis de expressão de GSK-3β em amostras de controlo entre a primeira e segunda biopsia. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que a expressão de GSK-3β é afectada por lítio em vez de factores exógenos não específicos.
| Reagentes | Volume |
| 10 x tampão de RT | 2 ul |
| MgCl 25 mM | 4 ul |
| 0,1 M DDT | 2 ul |
| RNase Fora | 0,5 ul |
| SuperScript III | 0,5 ul |
| Rnase livre água | 1 ul |
Tabela 1. Síntese de ADNc Solução Mistura Mestre.
| Reagentes | x1 | x (número de amostras) |
| DNA Template | 3 ul | - |
| SYBR Green | 5 ul | |
| Mix Primer | 0,8 l | |
| Água | 1,2 l | |
| Total | 10 ul | - |
Tabela 2. Neuronal Enriquecimento PCR Master Mix solução.
| Reagentes | x1 | x (número de amostras / primer) |
| dWater | 2 ul | |
| Master Mix | 5 ul | |
| FAM sonda marcada | 0,1 l | |
| VIC sonda marcada | 0,5 ul | |
| cDNA | 2 ul | - |
Tabela 3. Alvo PCR Master Mix.
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Discussion
Uma nova plataforma para a obtenção de camadas de neurônios olfativos enriquecidos pela combinação de biópsia nasal e LCM é apresentado e foi validado neste estudo. Esta técnica pode ter grandes implicações. Ele pode ser aplicado para os estudos de biomarcadores, incluindo aqueles para a resposta ao tratamento, e os esforços de descoberta de medicamentos para outras doenças neuropsiquiátricas, fazendo um impacto mais amplo no campo.
Para obter neurônios de alta qualidade passíveis de aplicações a jusante, a poucos passos críticos e solução de problemas deve ser anotado. Em primeiro lugar, obter 4-6 pedaços de tecido olfativo por paciente para ter uma amostra de dimensão adequada. Em segundo lugar, uma vez que as amostras são suscetíveis à degradação do RNA, manter o tecido a temperaturas adequadas, trabalhar com RNase equipamentos e superfícies livres, utilize luvas e evitar respirar diretamente sobre amostras. Se a qualidade de RNA ainda é baixo, considere completando microdissection dentro de 50 min e executar extração de RNA imediatamente após a dissecação ou vortex amostras imediatamente e manter em gelo seco, até que o armazenamento a -80 ° C. Para aumentar o rendimento de ARN, aumentar o número de secções dissecados durante LCM.
Um desafio de estudar alterações moleculares associados a cerebrais em desordens neuropsiquiátricas existe, devido à falta de acessibilidade para estudar o cérebro humano. Abordagens alternativas incluem o estudo de células do sangue periférico, cérebros autopsiados, e-tronco pluripotentes induzidas (iPS) células. As células do sangue podem não representar mudanças neuronais associados à doença. Cérebros autopsiados não pode ser o recurso para estudar mudanças dinâmicas e estaduais associados à progressão da doença e resposta à medicação. células iPS podem não refletir diretamente as mudanças de estado, porque tais traços são susceptíveis de ser apagada durante o curso de reprogramação e manutenção das células. Portanto, as vantagens da utilização de tecidos OE são a capacidade de estudar ambos os estaduais e dinâmicas mudanças no contexto neuronal. Em particular, iPS derivadas haste neuronalcélulas podem não refletir adequadamente o efeito de 6 semanas de tratamento com lítio, devido ao cultivo e de reprogramação etapas. A metodologia apresentada neste trabalho nos permite estudar alterações moleculares associadas ao tratamento e relacioná-los com mudanças nos sintomas clínicos. Deve notar-se que, pelo menos actualmente, a quantidade de neurónios obtido a partir de tecidos de OE é suficiente para estudos ao nível molecular, mas não pode ser limitado para a caracterização de proteínas por meio de aplicações de imuno-histoquímica. Assim, também são esperadas novas melhorias técnicas.
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Disclosures
Os autores relatam relações financeiras com interesses comerciais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Tissue-Tek Cryomold Molds | Sakura Finetek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cryosectioning | |||
| Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 | |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 | |
| DEPC Treated Water | Quality Biological | 351-068-131 | |
| Microdissection | |||
| Microscope: PALM Series MicroLaser System | Carl Zeiss Microscopy | Model: Axiovert 200M Software: Robo v3.2 |
|
| No. 5 Dumont Microdissction Forceps | Roboz | RS-49085 | |
| RNA Extraction | |||
| RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| cDNA Synthesis | |||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| OMP qPCR | |||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 | |
| Taqman qPCR | |||
| TaqMan Expression Assay Probes | Applied Biosystems | Various | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
References
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