Abstract
يحدث رد فعل جسم غريب عند تقديم سطح الاصطناعية للجسم. يتميز امتصاص البروتينات في الدم والمرفق اللاحق وتفعيل الصفائح الدموية، الوحيدات / التصاق البلاعم والخلايا الأحداث يشير التهابات، مما يؤدي إلى مضاعفات ما بعد الإجرائية. جهاز تشاندلر حلقة هو نظام التجريبية التي تسمح للباحثين لدراسة التفاعلات الجزيئية والخلوية التي تحدث عند و perfused كميات كبيرة من الدم خلال قنوات البوليمرية. تحقيقا لهذه الغاية، وقد استخدم هذا الجهاز لتكون نموذجا فيفو السابقين السماح تقييم خصائص مضادة للالتهابات من مختلف التعديلات سطح البوليمر. وقد أظهرت مختبرنا أن قنوات الدم، تعديل تساهميا عبر الكيمياء تنشيط ضوئي مع CD47 المؤتلف، يمكن أن تمنح توافق مع الحياة على الأسطح البوليمرية. يمكن إلحاق CD47 على الأسطح البوليمرية تكون وسيلة فعالة لتعزيز فعالية قنوات الدم البوليمرية. لهاعين هي المنهجية التي تفصل الكيمياء تنشيط ضوئي يستخدم لإلحاق CD47 المؤتلف إلى قنوات الدم البوليمرية ذات الصلة سريريا واستخدام تشاندلر حلقة كنموذج خارج الحي التجريبي لدراسة التفاعلات الدم مع CD47 تعديل وسيطرة القنوات.
Introduction
تتطلب العديد من الإجراءات السريرية، مثل تغيير شرايين القلب وغسيل الكلى، واستخدام قنوات الدم البوليمرية، وغالبا ما يترافق مع مضاعفات ما بعد الإجرائية 1. عندما مع perfused الدم، وهذه البوليمرات غير المشروع رد فعل جسم غريب (FBR)، مما أدى إلى امتصاص البروتينات في الدم والصفائح الدموية، الوحيدات / التصاق البلاعم، وإطلاق سراح السيتوكينات الموالية للالتهابات، وكلها تساهم مضاعفات ما بعد الإجرائية و / أو فشل الجهاز 2،3. وبالتالي، لا تزال استراتيجيات لمعالجة هذه المسألة مجالا هاما والمستمرة لبحوث المواد الحيوية. وقد حاول الباحثون لمعالجة هذه المشكلة عن طريق تعديل الدم الاتصال مع الأسطح النشطة بيولوجيا الجزيئات أو bioinert 4-6. وقد ركزت البحوث في المختبر لدينا على إلحاق CD47 المؤتلف (recCD47) إلى المواد الحيوية البوليمرية كاستراتيجية للتخفيف من FBR وزيادة فعالية هذه المواد. CD47 هو transmembr أعرب بتواجد مطلقالبروتين انو مع دور المعروفة في التهرب المناعي، منح صفة "الأنا" على التعبير عن خلايا 7-10 والعروض نعد في منح توافق مع الحياة عندما إلحاق السطوح البوليمرية 11-13. ، وأعرب عن إشارة التنظيمية بروتين ألفا (SIRPα)، وما شابه ذلك لمستقبلات CD47، وعضوا في عزر مثبط التيروزين استنادا-immunoreceptor (ITIM) المحتوية عائلة من البروتينات عبر الغشاء على خلايا المنشأ النخاعي 14. لقد أثبتنا سابقا أن CD47، عبر SIRPα بوساطة إشارات الخلية، بانخفاض ينظم-الاستجابات المناعية لالبولي يوريثان (PU) والبولي فينيل كلورايد (PVC) في في المختبر، خارج الحي، ونماذج في الجسم الحي 11-13.
المركزي للتحقيقات لدينا هو الكيمياء تنشيط ضوئي جديد نسبيا، الموصوفة هنا، في أي المجموعات ثيول رد الفعل كيميائيا يتم إلحاق تساهميا لأنابيب البوليمرية بتفاعل مع أنابيب البوليمر متعدد الوظائف (PDT بيسةفتاه)، تتألف من 2 pyridyldithio (PDT)، وبينزفينون photoreactive (BzPh) وpolyallylamine المعدلة كربوكسي 11-13. الحد المجموعات PDT إلحاق تساهميا مع تريس (2 carboxyethyl) الفوسفين هيدروكلوريد (TCEP) 11 غلة سطح thiolated التي يمكن أن تكون في وقت لاحق مع رد فعل الأنصاف العلاجية. وسبق تفصيله هنا 12،13، وكان رد فعل recCD47، مما تعديل مع إضافة بولي ذيل يسين-C محطة 12،13، مع Sulfosuccinimidyl-4- [N -maleimidomethyl] الهكسان الحلقي-1-الكربوكسيل (سلفو-SMCC) لمدة 1 ساعة لتوليد مجموعات ثيول رد الفعل، والسماح لتشكيل السندات monosulfide بين أنابيب وrecCD47 11. تم اختبار القدرة المضادة للالتهابات من السطوح CD47 بين functionalized، بحكم فيف س، وذلك باستخدام جهاز تشاندلر حلقة مع الدم البشري كله، الذي وصف في الأصل في عام 1958 لتكون نموذجا في المختبر من التخثر الخثاري 15. ويعتمد الجهاز علىنظام أنابيب مغلقة مملوءة جزئيا مع الهواء ومحرك دوار تعميم الدم عبر أنابيب 15. يوفر هذا النموذج التجريبي الفرصة لدراسة تأثير التعرض الدم على أسطح المعدلة وغير المعدلة وكذلك تأثير تلك التعديلات السطحية على علم وظائف الأعضاء من خلايا الدم.
recCD47 يمكن إلحاق مجموعة متنوعة من السطوح البوليمرية باستخدام هذه الكيمياء تنشيط ضوئي، ويمكن تقييم قدرتها المضادة للالتهابات من خلال الاستفادة من فيفو السابقين نموذج محاكاة ذات الصلة سريريا نضح الدم فوق السطوح البوليمرية 11،12. السريرية قنوات الدم تعديل درجة مع recCD47 تظهر أقل بكثير الصفائح الدموية والتهاب مرفق الخلية بالمقارنة مع البوليمرات غير معدلة عند التعرض للدم البشري في الجهاز. ووصف بالتفصيل خطوة بخطوة من هذه العملية تعديل أدناه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التعديل البوليمرية السطوح مع recCD47
ملاحظة: يتم تلخيص بروتوكول تخطيطي في الشكل رقم 1 يوضح الشكل 1A توليد-ثيول رد الفعل السطوح البوليمرية يوضح الشكل 1B-ثيول جيل من رد الفعل recCD47.
- يوم 1
- تحضير محلول PDT-BzPh (1 ملغ / مل) وبيكربونات البوتاسيوم (KHCO 3) (0.7 ملغ / مل) في الماء المعقم. يقلب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (حماية من الضوء).
- يوم 2
- قطع أنابيب البوليمرية إلى 40 سم قطع طويلة (طويلة بما يكفي لتناسب جميع أنحاء عجلات الدورية).
- نقع الأنابيب في محلول مائي 0.1٪ من hexacylpyridinium لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر أو على جهاز تشاندلر حلقة. شطف الأنابيب مع 3X المياه المعقمة بعد 90 دقيقة نقع.
- تحمض حل PDT-BzPh من يوم 1 وذلك بإضافة 15٪ البوتاسيوم أحادي القاعدة فوسفات مائي (KH 2 4). إضافة 50 ميكرولتر KH 2 PO 4 في مل من PDT-BzPh، وتشكيل الحل micellar غائم.
- نقع الأنابيب في حل PDT-BzPh لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة المحمضة على شاكر أو على الجهاز.
- شطف الأنابيب مع حمض الخليك المخفف (1: 1،000) مرة واحدة.
- فضح أنابيب للأشعة فوق البنفسجية لمدة إجمالية قدرها 60 دقيقة. تدوير أنابيب ¼ تتحول كل 15 دقيقة لأشرق المساحة بأكملها.
- نقع الأنابيب في حل 20 ملغ / مل بيكربونات البوتاسيوم (KHCO 3) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر أو على الجهاز.
- شطف الأنابيب مع 3X الماء المعقم وتخزينها في 4 درجة مئوية في الماء المعقم.
- يوم 3
- حل 5 ملغ سلفو-SMCC في 200 ميكرولتر ثنائي الميثيل (DMF) (تنبيه: نفذ في غطاء الدخان).
- إضافة 50 ميكرولتر من الحل سلفو-SMCC أعدت في الخطوة 1 و 0.1 مغم / مل من recCD47 حل بولي يسين، ويقلب لمدة 60 دقيقة في ريال عمانيدرجة الحرارة أوم.
- خلال 60 دقيقة ضجة، ديغا العقيمة Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) وتوضع جانبا.
- رد تنقية سلفو-SMCC recCD47 باستخدام 7K الوزن الجزيئي قطع تدور تحلية العمود فقا لتعليمات الشركة الصانعة. جمع النهائي التدفق من خلال (عالية الجودة ثيول رد الفعل recCD47) وتمييع إلى وحدة تخزين الضروري معطف الداخل من الأنبوب مع DPBS.
- شطف الأنابيب من يوم 2 مع عقيمة، نزع الغاز DPBS 3X.
- رد فعل السطح معدلة من أنابيب بمحلول مكون من 20 ملغ / مل مع تريس (2 carboxyethyl) الفوسفين هيدروكلوريد (TCEP) في DPBS نزع الغاز لأقل من 2 دقيقة. شطف مع أنابيب معقمة نزع الغاز DPBS 4X.
- إضافة recCD47 سلفو-SMCC رد فعل للأنابيب واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر أو على الجهاز.
2. المناعية الكمي لrecCD47 على السطوح التعديل
- شطف الأنابيب تعديلها ليكون كميا من يوم 3 الطرافةح DPBS 3X. مخزن الأنابيب لا تستخدم في القياس الكمي في DPBS في 4 درجات مئوية.
- استخدام 4 ملم خزعة لكمة لجعل عينات أنبوب مكررة ووضع اللكمات الخزعة في الآبار من 96 لوحة جيدا.
- إعداد سيطرة سلبية تتكون من أنبوب عينة معدلة لا تعامل مع الأجسام المضادة الكشف. يعد عنصر تحكم الأجسام المضادة التي تتكون من أنبوب عينة معدلة تعامل مع الأجسام المضادة الكشف. إعداد تعديل اختبار عينات أنابيب تعامل مع الأجسام المضادة الكشف.
- عينات كتلة مع ألبومين المصل البقري بنسبة 0.4٪ (BSA) في DPBS لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر.
- بعد حظر، نضح BSA وشطف مع مخزنة المالحة تريس زائد 1٪ (TBST) 3X-20 توين، 10 دقيقة لكل منهما على شاكر.
- إعداد تخفيف العمل من الأجسام المضادة في 0.4٪ BSA فقا لتخفيف المصنعة الموصى بها لالمناعية. تمييع الأجسام المضادة البشرية CD47 B6H12-FITC 1: 100 في 0.4٪ BSA.
- إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة لتخفيف الآبار المناسبة. Incubaضوابط السلبية مع الشركة المصرية للاتصالات 0.4٪ BSA فقط. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة على شاكر (حماية من الضوء).
- شطف مع TBST 3X، 10 دقيقة لكل منهما على شاكر. نضح TBST الماضي شطف وإضافة 200 ميكرولتر DPBS إلى الآبار عينة الأنبوب.
- جمع من خلال تدفق النهائي، الذي هو عالية الجودة ثيول رد الفعل CD47 المؤتلف وتمييع إلى وحدة تخزين الضروري معطف الداخلية من الأنابيب مع DPBS.
- قراءة FITC كثافة إشارة باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية مع الإثارة FITC (485 نانومتر) والانبعاثات (538 نانومتر) الإعدادات.
- حساب recCD47 بد أن سطح البوليمر على أساس القيم القياسية، وهو ما يمثل صناعة السيارات في مضان وغير محددة ملزمة من العينة الضابطة الأجسام المضادة.
بروتوكول جهاز 3. حلقة تشاندلر
يسعى مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) الموافقة على بروتوكول جمع الدم وأبلغ الأوراق موافقة قبل الشروع في جمع عينات دم الإنسان. الحصول على المعلوماتrmed من موافقة المتبرع بالدم البشري.
ملاحظة: يظهر رسم بياني يصور الجهاز في الشكل 2.
- ملء حمام الماء مع الماء المقطر حتى حوالي 1/2 من العجلات قطر والمغمورة. إضافة ما يكفي من التبييض إلى حمام الماء لجعل محلول التبييض 10٪. مجموعة حمام المياه إلى 37 درجة مئوية ودرجة حرارة تسمح للتوازن.
- جمع محولات المعادن (كما هو موضح في الشكل 1B)، وأنابيب وأنابيب معدلة تعديل، والتجمع حول العجلات جهاز، كما هو مبين في الشكل 1C. التأكد من أن أنابيب يناسب سنججلي حول عجلة مع محول المعدنية في المكان.
- الحصول على 30 مل عينة الدم باستخدام بروتوكول افق IRB، في قارورة مملوءة مسبقا مع 2 مل من سترات مضادة للتخثر أو غيرها، ومزيج من قبل انقلاب لمنع تخثر مرة واحدة تم جمع العينة.
- إضافة حوالي 10 مل من الدم إلى كل أنبوب باستخدام صمام معدني والمحاقن، وترك بعض الهواء في الأنبوب. تأمين غطاء صمام وصدوير في اتجاه لمدة 3 ساعة.
- استنزاف الدم في كوب العادمة المعالجة باستخدام محلول التبييض 10٪ (أو على النحو المطلوب في السياسة المؤسسية).
- شطف بلطف الأنابيب الداخلية مع DPBS لإزالة كل آثار الدم. جمع من خلال تدفق في الدورق النفايات. التخلص من الدم وفقا لسياسة مؤسسية.
- تطهير أجهزة وأي دم الاتصال الأسطح باستخدام محلول التبييض 10٪ أو وفقا لسياسة مؤسسية.
- نماذج عملية لفلوري المجهر أو المجهر الإلكتروني كما هو موضح أدناه.
4. نيون المجهر والفرز الخلية
- إعداد بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) حل (تنبيه: إجراء في غطاء الدخان).
- احتضان الأنابيب في حل PFA 4٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، وإزالة 4٪ PFA وشطف الأفلام بلطف شديد مع DPBS.
- قطع الأنابيب إلى أقسام لفضح سطح التجويف للتلطيخ.
- وصمة عارقسم من أنابيب مع بضع قطرات من تصاعد سائل الاعلام مع 4 '، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (حماية من الضوء). بعد تلطيخ، وشطف الأنبوب بلطف شديد مع DPBS للحد خلفية إشارة دابي.
- الصورة باستخدام المجهر الفلورسنت مجهزة مرشح دابي وكاميرا رقمية لحساب عدد الخلايا في 9 الحقول المحددة عمياء نظر تحت 200X التكبير.
- خلية سجل بحساب في مجال الرؤية وأداء التحليلات الإحصائية المناسبة لتحديد الدلالة الإحصائية للنتائج.
5. المجهر الإلكتروني
- إعداد 2٪ محلول غلوتارالدهيد (تنبيه: إجراء في غطاء الدخان).
- احتضان الأنابيب في حل غلوتارالدهيد 2٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، وشطف بلطف 3X أنابيب مع DPBS.
- إعداد محلول 1٪ من رباعي أكسيد الأوزميوم (تحذير: خطر استنشاق حاد! استخدام في غطاء الدخان).
- احتضان الأنابيب في محلول 1٪ من رباعي أكسيد الأوزميوم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف بلطف 3X أنابيب مع DPBS.
- إعداد سلسلة من تركيزات الإيثانول (25٪، 50٪، 75٪، 95٪، والإيثانول بنسبة 100٪).
- يذوى الأنابيب بواسطة حضانة في سلسلة من تركيزات الإيثانول. في احتضان 25٪، 50٪، 75٪، و 95٪ من الإيثانول لمدة 20 دقيقة لكل منهما. احتضان في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 30 دقيقة.
- نقطة فوق الحرجة تجف أنابيب مع CO 2 لمدة 45 دقيقة لإزالة كل الرطوبة.
- أقسام أنبوب جبل على كعب عينة مع عجينة الفضة أو الجرافيت.
- أقسام أنبوب معطف مع 12.5 نانومتر من الذهب والبلاديوم.
- دراسة في المجهر الإلكتروني الماسح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
المدرة للثيول رد الفعل السطوح البوليمرية من خلال استخدام PDT-BzPh وTCEP جنبا إلى جنب مع ثيول رد الفعل recCD47 بولي يسين باستخدام SMCC يسمح المرفق من recCD47 على الأسطح البوليمرية. تتلخص عملية التعديل تخطيطي في الشكل 1. راحة من هذه العملية تعديل هو أنه يمكن تطبيقها على العديد من البروتينات المختلفة والعديد من الأسطح البوليمرية المختلفة، على افتراض البروتين يمكن تعديلها مع ما يكفي من مجموعات متفاعلة كيميائيا مثل lysines التي تحتوي على الأمينات و أن البوليمر لديه الهيدروكربونات المتاحة بما فيه الكفاية.
وقد ثبت سابقا أن recCD47 يمكن إلحاق السطوح البوليمرية باستخدام هذا البروتوكول 11-13. كما هو مبين في الشكل 3A، وتلطيخ FITC كبير هو recCD47 مرئية، وذلك باستخدام الأجسام المضادة FITC مترافق إلى المجال الإيج خارج الخلية من CD47، والتي يتم ترجمتها خصيصا للفيلم كما يتضح من DIC التصوير(الشكل 3B). هذه النتائج تثبت أن recCD47 يمكن تركيبها تساهميا لأفلام البولي يوريثان. قياس وحدات الفلورسنت ومقارنة مع منحنى القياسية تحديد تركيز سطح ملزمة recCD47. لقد أثبتنا أن recCD47 يمكن إلحاق السطوح البوليمرية عند مستويات تزيد عن 500 نانوغرام / سم 2،11-13. هذه النتائج تؤكد أن هذا البروتوكول تعديل البوليمر المستندة ثيول يمكن استخدامها لإلحاق بولي يسين البروتينات المؤتلف تعديل على الأسطح البوليمرية.
وقد تبين CD47 أن تكون علامة على "الذات" منع مرفق الخلية التهابات وتنشيط الجهاز المناعي 7-13. لتقليد في ظروف فيفو بأكبر قدر ممكن في بيئة خارج الحي، ويمكن perfused لدم الإنسان كله من خلال أنابيب البوليمر معدلة وتعديل في جهاز تشاندلر حلقة (كما هو موضح في الشكل 2). مرفق الخلية إلى الأنابيب يمكن تقييمها عبر تلطيخ دابي (
الرقم 1. تخطيطي لتعديل السطح. أ) تم إنشاء أسطح البوليمر Thiolated التي يحتضنها سطح البوليمر مع crosslinker photoactivatable PDT-BzPh والحد احق مع TCEP. B) </ قوي> SMCC كان يستخدم لإنتاج ثيول recCD47 رد الفعل، وكان في حينها تفاعلت مع سطح الاصطناعية thiolated لانتاج recCD47 بين functionalized السطوح.
الرقم 2. مخطط من جهاز تشاندلر حلقة. A) ويتكون الجهاز من حمام الماء الساخن إلى 37 درجة مئوية، وتناوب عجلات ثابتة على عمود معدني تعلق على المحرك الدوار. وضع هذا الأمر يسمح للمحرك دوار لتحويل العجلات، وبالتالي الغمر أجزاء من الأنابيب في حمام الماء 37 درجة مئوية، ونضح الدم خلال الأنبوب. B) تستخدم محولات معدنية لربط نهايات الأنابيب تشكيل حلقة حول واحدة من عجلات الدورية. يضاف الدم إلى أنابيب عبر ميناء صمام معدني وتوج مع غطاء صمام. C) تجميعها مرة واحدة، ينبغي للصمام أنابيب ومعدنية تناسب AR سنججليound عجلة دوارة، كما هو موضح هنا مع أنبوب فارغ.
الرقم 3. تكميم recCD47 على أفلام البولي يوريثان. تم استخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد الإيج المجال الخارجي CD47 لقياس كمية من recCD47 ملزمة لأفلام البولي يوريثان. صور المجهر الفلورسنت المتخذة بموجب 200X التكبير مع مجموعات مرشح المناسبة تبين من الكشف FITC recCD47 إلحاق البولي يوريثين (A). الصور (B) DIC تبين أن إشارة FITC تقتصر على فيلم البولي يوريثين.
الرقم التصاق 4. خلية معدلة والبولي يوريثين لتعديل recCD47. تم جمع الدم البشري كله وperfused لأكثر من معدلة أو تعديل recCD47-الأفلام PU لمدة 3 ساعة. بعد نضح 3 ساعة، تم تشطف الأفلام مع DPBS، وتم إصلاح الخلايا الالتزام مع PFA 4٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ودابي الملون لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. احصي خلايا دابي الملون باستخدام مجهر فلوري تحت 200X التكبير ومجموعات مرشح المناسبة. (A) تم إحصاء 9 حقول تم اختيارها عشوائيا النظر عن كل تعديل. (B) البيانات هي ممثل 9 حقول النظر ويتم التعبير عن متوسط ± الخطأ المعياري (ع = 0.004).
تعديل الشكل 5. التحليل SEM من recCD47 وأسطح التحكم بعد تحليل فيفو السابقين. تم جمع الدم البشري كله وperfused لأكثر من معدلة أو تعديل recCD47-أنابيب PVC لمدة 3 ساعة. تظهر الصور التمثيلية مرفق الخلية كبيرا لunmodifiإد السطوح في حين تشير الأسطح تعديل recCD47-خلية تعلق في بعض الأحيان فقط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الكيمياء تنشيط ضوئي (ملخصة في الشكل 1) يسمح لتعديل أي سطح تقريبا البوليمر التي تحتوي الهيدروكربونات كافية لتسهيل PDT-BzPh التعلق واللاحقة الأشعة فوق البنفسجية إلى الصور تفعيل PDT-BzPh. Functionalizing سطح البوليمر مع جماعات ثيول تفاعلية تسمح للمرفق لاحق مجموعة من جزيئات قابلة للاختبار من الفائدة. في دراساتنا معينة اخترنا المؤتلف CD47 11-13. الكيمياء اقتران معين التي استخدمناها المشاركة رد فعل مجموعات أمين البروتين مع الصليب رابط bifunctional SMCC 11-13. قدمت هذا ثيول رد الفعل recCD47 للتفاعل لاحقا مع السطح البوليمرية thiolated. وكان المنتج النهائي صلة أحادية كبريتيد تساهميا ربط recCD47 للبوليمر. للمساعدة على ضمان أن الجماعات أمين من الأحماض الأمينية في CD47 لم تستخدم للتفاعل، وبالتالي التخفيف من فعاليةمن CD47 يجمد، ونحن كذلك تعديل recCD47 عن طريق إدراج علامة بولي يسين في البروتين C-محطة. سيكون من الممكن أن استراتيجية الجزيئية مماثلة يمكن تطبيقها مع بروتينات أخرى. وهكذا فإن الكيمياء اقتران قدم هنا وفي أماكن أخرى 11-13 يوفر فرصة هامة لتقييم قدرة الجزيئات العلاجية المحتملة للتشاور توافق مع الحياة على الأسطح الاصطناعية.
عيوب إلى هذا البروتوكول هو أن تعريض بعض أنواع البوليمرات مثل البولي يوريثين، لفترات طويلة من الأشعة فوق البنفسجية يمكن أن يؤدي إلى تغير لونها. هذا يمكن تجنبها من خلال وضع البوليمر في أطباق البوليسترين (يشيع استخدامها في زراعة الأنسجة) لمنع تلون البوليمر دون إعاقة تنشيط ضوئي من PDT-BzPh. الطول الموجي للضوء الأشعة فوق البنفسجية المستخدمة في هذا البروتوكول هو 302 نانومتر؛ الانحراف عن هذا الطول الموجي يمكن أن يؤدي إلى عدم كفاءة الصور تفعيل PDT-BzPh. إذا باستخدام طول موجي مختلف منضوء الأشعة فوق البنفسجية، والتحسين من وقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية ضروري لضمان هام الصور التنشيط.
بعد هذا البروتوكول يسمح لمرفق من recCD47 على الأسطح البوليمر، لغرض التهرب من المناعة، ونقل الحالة "الذات" إلى السطح البوليمرية لمنع رد فعل جسم غريب. الكمي لrecCD47 إلحاق سطح اكتمال يستخدم الأجسام المضادة FITC المسمى إلى المجال الإيج من CD47 باستخدام المناعية والمجهري الفلورسنت (الشكل 3). يمكن تكييف هذه المنهجية إلى بروتينات أخرى إلحاق السطوح البوليمرية افتراض توفر الأجسام المضادة. يمكن أن الفشل في الحصول على أطرافهم كبير من recCD47 (أو غيرها من البروتين) يكون بسبب مجموعة متنوعة من العوامل بما في ذلك الفشل في photoactivate PDT-BzPh، والهيدروكربونات حرة كافية على سطح البوليمر، للا مائية من سطح البوليمر، البوليمر أو يمكن أن تكون سميكة جدا أو غير شفاف للسماح للضوء بالمرور لquantific كافيةأوجه. كل هذه المتغيرات يمكن اختبارها تجريبيا والأمثل للبوليمر معين.
جهاز تشاندلر حلقة هو أداة فريدة للتحليل خارج الجسم كله من التعرض الدم البشري على الأسطح البوليمرية. هذا النظام يشبه نضح الدم من خلال قنوات الدم السريرية المستخدمة في الإجراءات الطبية المختلفة، مما يتيح تحليل العديد من نقاط النهاية الفسيولوجية المرتبطة مع أسطح الاتصال بين في الدم. كما النهاية الفسيولوجية لأطرافهم من recCD47 على الأسطح البوليمرية، واستخدمت عدد الخلايا باستخدام تلطيخ دابي (الشكل 4) والمجهر الإلكتروني (الشكل 5). ويمكن أيضا أن تستخدم نقاط النهاية الأخرى، اعتمادا على توافر المعدات، وعلى سبيل المثال، قبل وبعد عدد الخلايا نضح الدم من خلال قنوات الدم البوليمرية ويمكن أيضا أن تستخدم. بغض النظر الأسطح، recCD47 المعدلة أظهرت بشكل كبير خلايا أقل التزمت مقارنة أسطح التحكم معدلة. هذه داتا أقترح أن ينقل recCD47 توافق مع الحياة على الأسطح البوليمرية ويمكن استخدامها لمنع FBR في الإجراءات السريرية باستخدام قنوات الدم البوليمرية.
على الرغم من أن هذا هو تستخدم على نطاق واسع في المختبر نموذج للدراسات نضح الدم، فمن محدود في بعض النواحي. تنشأ مساوئ الرئيسيتين لهذه الطريقة من شرط لتشمل الهواء في الأنبوب مع عينة الدم. التفاعل الدم المتكرر مع الهواء يمكن أن يسبب تراكم الصفائح الدموية وخلايا الدم البيضاء والبروتين 16-18 تمسخ، والتي قد تتداخل مع بعض النهاية. ثانيا، يبقى الهواء في أعلى نقطة من الدائرة، مما يحد من معدل الدورة الدموية 19. على الرغم من القيود الواضحة لهذا الأسلوب، فإنه يدفع الضرر الدم أقل من 19 الأساليب المتنافسة ويخدم كوسيلة لفحص للتوافق مع الحياة من الجزيئات الحيوية المحتملة على قنوات الدم البوليمرية. وبمجرد تحديد الجزيئات الحيوية بمرشحههذه الطريقة، يمكن الحصول على مزيد من التحليل من خلال النماذج الحيوانية في الجسم الحي. في نهاية المطاف، وتوافق مع الحياة من البوليمرات المعدلة يحتاج إلى تأكيد استخدام مناسبة في نظام نموذجي الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وأيد البحث عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية والهندسة الحيوية، تحت رقم R21 جائزة EB015612 (SJS)، والوطني للقلب والرئة والدم المعهد، تحت رقم جائزة T32 HL007915 (JBS وRJL) من الوطني معهد الصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Scientific | 58906 | Caution! Use in fume hood |
| 25% Glutaraldehyde | VWR | AAA17876-AP | Caution! Use in fume hood |
| 2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH) | Synthesized in lab | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059-100G | |
| Citrate | Sigma | S5770-50ML | |
| Digital Camera | Leica | DC500 | Out of production |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547-100ML | Caution! Use in fume hood |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco/Life Technologies | 14190-136 | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TE300 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | Caution! Use in fume hood |
| Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-12730 | |
| Osmium Tetroxide | Acros Organics | 197450050 | Caution! Use in fume hood |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3) | Sigma | 237205-100G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655-100G | |
| PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit) | Terumo Cardiovascular Systems | 60050 | Most clinical-grade tubing will work |
| Scanning Electron Microscope | JEOL | JSM-T330A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | Spectramax Gemini EM | |
| Sulfo-SMCC | Sigma | M6035-10MG | Moisture Sensitive! |
| tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531 | |
| Vectashield with DAPI | Fisher Scientific | H-1200 | Light sensitive! |
| Zeba Spin Desalt Columns – 7 K MWCO | Thermo Scientific | 89891 |
References
- Bruck, S. D. Medical applications of polymeric materials. Med. Prog. Technol. 9 (1), 1-16 (1982).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin. Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Levy, J. H., Tanaka, K. A. Inflammatory response to cardiopulmonary bypass. Ann. Thorac. Surg. 75, S715-S720 (2003).
- Sperling, C., Maitz, M. F., Talkenberger, S., Gouzy, M. F., Groth, T., Werner, C. In vitro blood reactivity to hydroxylated and non-hydroxylated polymer surfaces. Biomaterials. 28, 3617-3625 (2007).
- Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups. Biomaterials. 26, 6547-6457 (2005).
- Vasita, R., Shanmugam, I. K., Katt, D. S. Improved biomaterials for tissue engineering applications: surface modification of polymers. Curr. Top. Med. Chem. 8, 341-353 (2008).
- Subramanian, S., Parthasarathy, R., Sen, S., Boder, E. T., Discher, D. E. Species- and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPalpha. Blood. 107 (6), 2548-2556 (2006).
- Tsai, R. K., Discher, D. E. Inhibition of 'self' engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells. J Cell Biol. 180 (5), 989-1003 (2008).
- Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends Immunol. 29 (5), 203-206 (2008).
- Oldenborg, P. A., Zheleznyak, A., Fang, Y. F., Lagenaur, C. F., Gresham, H. D., Lindberg, F. P. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2001).
- Finley, M. J., Rauva, L., Alferiev, I. S., Weisel, J. W., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33, 5803-5811 (2012).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34, 8640-8649 (2013).
- Ravetch, J. V., Lanier, L. L. Immune inhibitory receptors. Science. 290, 84-89 (2000).
- Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of blood: a method for producing a thrombus. Lab Invest. 7, 110-114 (1958).
- Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea Hyperb Med. 20 (2), 101-119 (1993).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platlet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. Intl J of Legal Med. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., Fainerman, V. B., Wüstneck, R., Krägel, J., Trukhin, D. V. Characterization of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A. 131 (1-3), 225-230 (1998).
- Oeveren, W. V., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. Int J Biomater. 2012, (2012).
