Abstract
De vreemd lichaam reactie optreedt bij een kunststof oppervlak is ingevoerd om het lichaam. Het wordt gekenmerkt door adsorptie van bloedeiwitten en de daaropvolgende bevestiging en activatie van bloedplaatjes, monocyten / macrofagen hechting en ontstekingscellen signalering gebeurtenissen, die leiden tot post-procedurele complicaties. De Chandler Loop Apparatus is een experimenteel systeem waarmee onderzoekers om de moleculaire en cellulaire interacties die optreden bij grote hoeveelheden bloed worden doorbloed dan polymere leidingen te bestuderen. Hiertoe is deze inrichting gebruikt als een ex vivo model waarmee de beoordeling van de anti-inflammatoire eigenschappen van verschillende polymeren oppervlaktemodificaties. Ons laboratorium heeft aangetoond dat het bloed leidingen, covalent bewerkt via fotoactivatie chemie met recombinant CD47, kan biocompatibiliteit verlenen aan polymere oppervlakken. Het toevoegen CD47 op polymere oppervlakken, kan een effectief middel om de werkzaamheid van polymere bloed leidingen bevorderen. HaarEin is de methode waarin de fotoactivatie chemie gebruikt om recombinant CD47 klinisch relevante polymère bloed leidingen en het gebruik van de Chandler Loop een ex vivo experimenteel model toevoegen bloed interacties met CD47 gemodificeerd en regelleidingen onderzoeken.
Introduction
Vele klinische procedures zoals cardiopulmonale bypass en nierdialyse, vereisen het gebruik van polymere bloed leidingen en zijn vaak geassocieerd met post-procedurele complicaties 1. Bij geperfuseerd met bloed, deze polymeren ontlokken het vreemdlichaamsreactie (FBR), waardoor adsorptie van bloedeiwitten en bloedplaatjes, monocyten / macrofagen hechting en het vrijkomen van pro-inflammatoire cytokines, die allemaal bijdragen tot post-procedurele complicaties en / of falen apparaat 2,3. Zo strategieën om dit probleem aan te pakken blijft een belangrijke en voortdurende gebied van biomaterialen onderzoek. Onderzoekers hebben geprobeerd om dit probleem aan te pakken door het wijzigen van bloed contactoppervlakken met bioactieve moleculen of bioinert 4-6. Onderzoek in ons laboratorium is gericht op het toevoegen van recombinant CD47 (recCD47) polymere biomaterialen als een strategie om de FBR beperken en toename van de werking van deze materialen. CD47 is een alomtegenwoordig uitgedrukt transmembrane eiwit met een bekende rol in de immuun-ontduiking, het verlenen van de status van 'zelf' op te drukken cellen 7-10 en toont belofte bij het verlenen van biocompatibiliteit wanneer toegevoegd aan polymere oppervlakken 11-13. Signaal-regulerend eiwit alfa (SIRPα), de verwante receptor voor CD47, en een lid van de immunoreceptor tyrosine-gebaseerd remmend motief (ITIM) bevattende familie van transmembraan eiwitten tot expressie wordt gebracht op cellen van myeloïde oorsprong 14. We hebben eerder aangetoond dat CD47, via SIRPα-gemedieerde signalering, down-reguleert de immuunrespons op polyurethaan (PU) en polyvinylchloride (PVC) in in vitro, ex vivo en in vivo modellen 11-13.
Centraal in ons onderzoek is een betrekkelijk nieuwe fotoactivatie chemie hierin beschreven, waarbij chemisch reactieve thiol groepen covalent gehecht aan polymère buis door reactie van de buis met een multifunctioneel polymeer (PDT-BzPh), bestaande uit 2-pyridyldithio (PDT), de fotoreactieve benzofenon (BzPh) en een carboxy-gemodificeerde polyallylamine 11-13. Vermindering van het covalent aangehechte PDT groepen met tris (2-carboxyethyl) fosfine hydrochloride (TCEP) 11 levert een gethioleerde oppervlak dat vervolgens kan worden omgezet met therapeutische groepen. En hierin eerder beschreven 12,13, recCD47, verder gemodificeerd door toevoeging van een C-eindstandige poly-lysine tail 12,13, wordt omgezet met sulfosuccinimidyl-4-[N -maleimidomethyl] cyclohexaan-1-carboxylaat (sulfo-SMCC) gedurende 1 uur tot thiol-reactieve groepen genereren, waardoor een formatie monosulfide binding tussen de buis en recCD47 11. De anti-inflammatoire vermogen van de CD47 gefunctionaliseerde oppervlakken werd getest ex viv o via de Chandler Loop Inrichting met menselijk bloed, die oorspronkelijk werd beschreven in 1958 als een in vitro model van trombose coagulatie 15. De inrichting is gebaseerd op eengesloten buissysteem gedeeltelijk gevuld met lucht en een roterende motor om het bloed circuleren door de buis 15. Dit experimentele model biedt de mogelijkheid om het effect van blootstelling bloed op niet gemodificeerde oppervlakken en het effect van deze oppervlakmodificaties bij de fysiologie van cellen van het bloed onderzocht.
recCD47 kan worden toegevoegd aan een verscheidenheid van polymere oppervlakken met deze fotoactivatie chemie, en de anti-inflammatoire capaciteit kan worden beoordeeld met behulp van een klinisch relevante ex vivo model nabootst bloeddoorstroming via polymere oppervlakken 11,12. Klinische kwaliteit bloed leidingen gemodificeerd met recCD47 significant lagere bloedplaatjes en inflammatoire celhechting vergeleken met ongemodificeerde polymeren bij blootstelling aan menselijk bloed in de inrichting. Een stap-voor-stap beschrijving van deze wijziging wordt hierna beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 wijzigen Polymere Oppervlakken met recCD47
Opmerking. Het protocol is schematisch samengevat in figuur 1 Figuur 1A illustreert generatie thiol-reactieve polymere oppervlakken Figuur 1B illustreert generatie thiol-reactieve recCD47..
- Dag 1
- Bereid een oplossing van PDT-BzPh (1 mg / ml) en kaliumbicarbonaat (KHCO3) (0,7 mg / ml) in steriel water. Roer overnacht bij 4 ° C (beschermd tegen licht).
- Dag 2
- Snijd polymere slang in 40 cm lange stukken (lang genoeg om te passen rond draaiende wielen).
- Geniet buizen in een 0,1% waterige oplossing van hexacylpyridinium gedurende 90 min bij kamertemperatuur op een shaker of Chandler Loop Apparatus. Spoel de buizen met steriel water 3x na 90 min inwerken.
- Zuur de PDT-BzPh vanaf dag 1 door de toevoeging van 15% waterige kalium monobase (KH 2 4). Voeg 50 ul KH 2 PO 4 per ml van PDT-BzPh, de vorming van een troebele micellaire oplossing.
- Week de buizen in de aangezuurde PDT-BzPh oplossing gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur op een shaker of inrichting.
- Spoel de buizen met verdund azijnzuur (1: 1.000) eenmaal.
- Maak de buizen aan UV-bestraling met een totale duur van 60 minuten. Draai buizen ¼ draai om de 15 minuten naar het gehele oppervlak bestralen.
- Week de buizen in een oplossing van 20 mg / ml kaliumbicarbonaat (KHCO3) gedurende 20 min bij kamertemperatuur op een shaker of inrichting.
- Spoel de buizen met steriel water 3x en bewaar bij 4 ° C in steriel water.
- Dag 3
- Los 5 mg Sulfo-SMCC in 200 ul dimethylformamide (DMF) (Let op: Voer in de zuurkast).
- Voeg 50 ul van de Sulfo-SMCC bereid in stap 1 0,1 mg / ml recCD47 poly-lysine oplossing en roer gedurende 60 minuten bij roOM temperatuur.
- Gedurende 60 min roer, ontgas steriele Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) en zet apart.
- Zuiveren Sulfo-SMCC omgezet recCD47 met een 7K molecuulgewicht cut-off rotatie ontzoutingskolom instructies van de fabrikant. Collect final doorstroomsysteem (hoogwaardige thiol-reactieve recCD47) en verdund tot een volume noodzakelijk het bekleden van de binnenkant van de buis met DPBS.
- Spoel de buizen van dag 2 met een steriele, ontgast DPBS 3x.
- React het gemodificeerde oppervlak van de buizen met een oplossing van 20 mg / ml met tris (2-carboxyethyl) fosfine hydrochloride (TCEP) in ontgast DPBS minder dan 2 minuten. Spoel de buizen met steriele ontgast DPBS 4x.
- Voeg de Sulfo-SMCC-gereageerd recCD47 de buizen en incubeer overnacht bij 4 ° C op een schudder of inrichting.
2 Immunochemie Kwantificering van recCD47 op Gewijzigd Surfaces
- Spoel bewerkt buizen worden gekwantificeerd van Dag 3 with DPBS 3x. WINKEL buizen niet voor kwantificering in DPBS bij 4 ° C.
- Gebruik een 4 mm punch biopsie om dubbele buis steekproeven en plaats biopsie stoten in putjes van een 96-well plaat.
- Bereid een negatieve controle bestaande uit een ongemodificeerd buis monster niet behandeld met het detectie-antilichaam. Bereid een antilichaam controle bestaande uit een ongemodificeerde buis monster behandeld met het detectie-antilichaam. Bereid de gemodificeerde buis monsters behandeld met het detectie-antilichaam.
- Vak monsters met 0,4% bovine serum albumine (BSA) in DPBS gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur op een shaker.
- Na blokkering aspireren BSA en spoel met tris-gebufferde zoutoplossing plus 1% Tween-20 (TBST) 3x, 10 min elk op een shaker.
- Bereid een werkende verdunning van antilichamen in 0,4% BSA volgens de aanbevolen verdunning fabrikant voor immunoassays. Verdunnen menselijk CD47 Antibody B6H12-FITC 1: 100 in 0,4% BSA.
- Voeg 200 ul van antilichaamverdunning aan geschikte putjes. IncubaTe negatieve controles met slechts 0,4% BSA. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten op een schudapparaat (beschermd tegen licht).
- Spoelen met TBST 3x, 10 min elk op een shaker. Zuig het laatste TBST spoelen en voeg 200 ul DPBS om buis monsterputjes.
- Verzamel de uiteindelijke doorstroom, die hoogwaardige thiol-reactieve recombinant CD47 en verdun tot een volume noodzakelijk het bekleden van de binnenkant van de buizen met DPBS.
- Lees FITC intensiteit van het signaal met behulp van een microplaataflezer met FITC excitatie (485 nm) en emissie (538 nm) instellingen.
- Bereken recCD47 gebonden aan polymere vlak uitgaande van standaardwaarden, goed voor auto-fluorescentie en niet-specifieke binding van het antilichaam controlemonster.
3 Chandler Loop Apparatus Protocol
Seek Institutional Review Board (IRB) goedkeuring van de bloedafname-protocol en geïnformeerde toestemming papierwerk voorafgaand aan de start van de verzameling van menselijke bloedmonsters. Verkrijgen van informatiermed toestemming van een menselijk bloed donor.
OPMERKING: Een diagram dat de inrichting is weergegeven in figuur 2.
- Vul waterbad met gedestilleerd water tot ongeveer 1/2 van de wielen een diameter worden ondergedompeld. Voeg genoeg bleekmiddel aan het waterbad tot 10% bleekmiddel oplossing te maken. Stel waterbad tot 37 ° C en laat de temperatuur in evenwicht.
- Verzamel metalen adapters (figuur 1B), ongemodificeerde buizen gewijzigde slangen en assembleren ongeveer inrichting wielen, zoals getoond in figuur 1C. Zorg ervoor dat slangen past nauwsluitend rond het wiel met de metalen adapter op zijn plaats.
- Verkrijgen van 30 ml bloedmonster die een IRB-goedgekeurde protocol, in een flacon ingevuld met 2 ml citraat of andere anticoagulantia, en meng door omkeren om te voorkomen dat stolling zodra het monster is verzameld.
- Voeg ongeveer 10 ml bloed aan elke buis met de metalen ventiel en spuit, waardoor lucht in de buis. Bevestig het ventieldopje en rraaien 3 uur.
- Het bloed afvoeren naar een verspilling beker behandeld met een 10% bleekwater-oplossing (of zoals vereist door institutionele beleid).
- Voorzichtig afspoelen slangen interieur met DPBS om alle sporen van bloed te verwijderen. Collect doorstroom in de afvalvaten. Afvoeren van het bloed in overeenstemming met de institutionele beleid.
- Ontsmet het apparaat en eventuele bloed contact oppervlakken met behulp van een 10% bleekwater oplossing of volgens de institutionele beleid.
- Werkwijze monsters voor fluorescentiemicroscopie of scanning elektronenmicroscopie zoals hieronder beschreven.
4 fluorescentie microscopie en Celtelling
- Bereid een 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing (Let op: Voer in de zuurkast).
- Incubeer buizen in een 4% PFA oplossing overnacht bij 4 ° C.
- Na een nacht incubatie, verwijder 4% PFA en spoel films erg voorzichtig met DPBS.
- Snijd de slang in secties om het lumen oppervlak bloot voor vlekken.
- Staineen gedeelte van de buis met een paar druppels fixeermiddelen met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (bescherming tegen licht). Na het kleuren, spoel de slangen heel voorzichtig met DPBS om de achtergrond DAPI signaal te verminderen.
- Afbeelding met een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een DAPI filter en digitale camera het aantal cellen in 9 blindelings geselecteerde gezichtsveld onder 200X vergroting tellen.
- Record cel telt per gezichtsveld en passende statistische analyses uit te voeren om de statistische significantie van de resultaten te bepalen.
5 Scanning Electron Microscopy
- Bereid een 2% glutaaraldehyde-oplossing (Let op: Voer in de zuurkast).
- Incubeer buizen in 2% glutaaraldehyde oplossing overnacht bij 4 ° C.
- Na een nacht incubatie voorzichtig spoel de slangen 3x met DPBS.
- Bereid een oplossing van osmiumtetroxide 1% (Let op: Ernstig gevaar bij inademing! Gebruik in zuurkast).
- Incubeer buizen in een oplossing van 1% osmiumtetroxide gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Voorzichtig Spoel de slang 3x met DPBS.
- Bereid een reeks concentraties ethanol (25%, 50%, 75%, 95% en 100% ethanol).
- Dehydrateer de slang door incubatie in de reeks van ethanol concentraties. Incubeer bij 25%, 50%, 75% en 95% ethanol gedurende 20 minuten elk. Incubeer in 100% ethanol gedurende 30 minuten.
- Superkritische punt droog de buis met CO 2 gedurende 45 minuten om alle vocht te verwijderen.
- Mount buis secties op een specimen stub met zilver pasta of grafiet.
- Coat buis secties met 12,5 nm van goud-palladium.
- Onderzoek in een scanning elektronenmicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genereren thiol-reactieve polymere oppervlakken op het gebruik van PDT-BzPh en TCEP samen met thiol-reactieve recCD47 poly-lysine met SMCC maakt de bevestiging van recCD47 polymere oppervlakken. De modificatie proces is schematisch weergegeven in figuur 1. Het gemak van deze wijziging werkwijze is dat het kan worden toegepast op vele verschillende eiwitten en veel verschillende polymere oppervlakken, uitgaande van het eiwit kan worden gewijzigd met voldoende chemisch reactieve groepen zoals amine bevattende lysines en dat het polymeer voldoende beschikbaar koolwaterstoffen.
Het is al eerder aangetoond dat recCD47 kunnen worden toegevoegd aan polymere oppervlakken met behulp van dit protocol 11-13. Zoals getoond in figuur 3A, significant FITC kleuring zichtbaar voor recCD47 behulp van een FITC-geconjugeerd antilichaam tegen het extracellulaire Ig domein van CD47, dat specifiek is gelokaliseerd op de film zoals getoond door DIC imaging(Figuur 3B). Deze resultaten demonstreren dat recCD47 covalent kunnen worden verbonden aan polyurethaanfilms. Het meten van de fluorescente eenheden en vergelijking met een standaard kromme bepaald de concentratie van het oppervlak gebonden recCD47. We hebben laten zien dat recCD47 kunnen worden toegevoegd aan polymere oppervlakken op niveaus van meer dan 500 ng / cm 2,11-13. Deze resultaten bevestigen dat deze thiol-gebaseerde polymeer modificatie protocol kan worden gebruikt om poly-lysine gemodificeerde recombinante eiwitten voegen aan polymere oppervlakken.
CD47 is aangetoond dat een marker zijn van "zelf 'voorkomen inflammatoire celhechting en het immuunsysteem activatie 7-13. Om bootsen in vivo omstandigheden zo dicht mogelijk in een ex vivo omgeving, kan volledig menselijk bloed worden geperfundeerd door ongemodificeerde en gemodificeerde polymere buis in de Chandler Loop Inrichting (getoond in figuur 2). Cell bevestiging aan de buis kan worden beoordeeld via DAPI kleuring (
Figuur 1 Schematische voorstelling van Oppervlaktemodificatie. A) gethioleerde polymeeroppervlakken werden gegenereerd door het incuberen van het polymere oppervlak met de fotoactiveerbare crosslinker PDT-BzPh en daaropvolgende reductie met TCEP. B) </ Strong> SMCC werd gebruikt thiol-reactieve recCD47, dat vervolgens werd omgezet met het gethioleerde synthetische oppervlak recCD47 gefunctionaliseerde oppervlakken oogst produceren.
Figuur 2 Schematische weergave van Chandler Loop Apparatus. A) Het apparaat bestaat uit een waterbad verwarmd tot 37 ° C, op een metalen paal bevestigd aan een roterende motor vast draaiende wielen. Deze opzet maakt de roterende motor om de wielen draaien, waardoor delen van de buis onder te dompelen in het 37 ° C waterbad en perfusie van bloed door de buis. B) Metaal adapters worden gebruikt om de uiteinden van de buis die een lus sluiten rond een van de roterende wielen. Bloed is aan de buizen toegevoegd door de metalen klep poort en afgetopt met de beschermkap. C) Als alles in elkaar, moet de slang en de metalen klep behaaglijk ar passenond de draaiende wiel, zoals hier getoond met een lege buis.
Figuur 3 Quantisatie van recCD47 van polyurethaan films. Antilichamen gericht tegen het uitwendige Ig domein van CD47 werden gebruikt om de hoeveelheid recCD47 gebonden aan polyurethaanfilms kwantificeren. Fluorescentiemicroscoop beelden genomen op grond van 200X vergroting met een geschikte filter sets waaruit FITC detectie van recCD47 toegevoegd aan polyurethaan (A). (B) DIC beelden laten zien dat FITC-signaal specifiek is voor de polyurethaanfilm.
Figuur 4 Celadhesie ongemodificeerde en recCD47 gemodificeerde polyurethaan. Menselijk bloed werd verzameld en doorbloed dan niet gemodificeerde of recCD47 gemodificeerdePU-films voor 3 uur. Na 3 uur perfusie werden films gespoeld met DPBS, en de gehechte cellen werden gefixeerd met 4% PFA gedurende de nacht bij 4 ° C en DAPI gekleurd gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. DAPI gekleurde cellen werden geteld met behulp van een fluorescentiemicroscoop onder 200x vergroting en geschikte filtersets. (A) 9 willekeurig gekozen gezichtsveld werden geteld voor elke wijziging. (B) gegevens representeert 9 zichtveld en uitgedrukt als gemiddelde ± standaardfout (p = 0.004).
Figuur 5 SEM analyse van recCD47 gemodificeerd en stuurvlakken volgende ex vivo analyse. Menselijk bloed werd verzameld en doorbloed dan niet gemodificeerde of recCD47 gemodificeerde PVC buizen voor 3 uur. Representatieve beelden tonen significante cel gehechtheid aan unmodified oppervlakken terwijl recCD47 gemodificeerde oppervlakken vertonen slechts af en toe een bijgevoegde cel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De fotoactivatie chemie (samengevat in figuur 1) maakt de modificatie van vrijwel elk polymeer oppervlak dat voldoende koolwaterstoffen moet PDT-BzPh hechting en daaropvolgende UV bestraling vergemakkelijking foto-activeren PDT-BzPh. Functionaliseren het polymere oppervlak met reactieve thiolgroepen maakt de latere bevestiging van een reeks testbare moleculen van interesse. In onze specifieke studies kozen we recombinant CD47 11-13. De specifieke conjugatie chemie die we gebruikten betrof de reactie van aminegroepen het eiwit met de bifunctionele verknoper SMCC 11-13. Dit leverde thiol-reactieve recCD47 voor de volgende reactie met het gethioleerde polymere oppervlak. Het eindproduct was een mono-sulfide binding covalent binden de recCD47 het polymeer. Om ervoor te zorgen dat de amine groepen van de aminozuren in CD47 werden niet gebruikt voor de reactie en daardoor de werkzaamheid verminderenvan de geïmmobiliseerde CD47, we verder gewijzigde recCD47 door het met een poly-lysine label van het proteïne C-terminus. Het zou mogelijk zijn dat een soortgelijke moleculaire strategie kan worden toegepast met andere eiwitten. Zo hier conjugatiechemie gepresenteerd en elders 11-13 biedt een belangrijke gelegenheid om het vermogen van potentieel therapeutische moleculen biocompatibiliteit verlenen kunststofoppervlakken beoordelen.
Een nadeel van dit protocol is dat blootstelling bepaalde polymeren, zoals polyurethaan, om langdurig UV straling kan verkleuren. Dit kan worden vermeden door het plaatsen van het polymeer in polystyreen gerechten (gewoonlijk in weefselkweek) om verkleuring van het polymeer voorkomen zonder belemmeren fotoactivering van de PDT-BzPh. De golflengte van UV-licht dat wordt gebruikt in dit protocol is 302 nm; afwijking van deze golflengte kan resulteren in inefficiënte foto-activatie van PDT-BzPh. Bij gebruik van een andere golflengte vanUV licht, optimalisering van UV blootstellingstijd moet significant foto-activatie waarborgen.
Na dit protocol maakt de bevestiging van recCD47 polymere oppervlakken, ten behoeve van immune fraude en transporteren toestand "vrij" om het polymere oppervlak om de vreemd lichaam reactie te voorkomen. Kwantificering van de recCD47 toegevoegd aan het oppervlak te zijn voorzien van een FITC-gelabeld antilichaam aan het Ig domein van CD47 met een immunoassay en fluorescentie microscopie (figuur 3). Deze methode kan worden aangepast aan andere eiwitten toegevoegd aan polymere oppervlakken uitgaande beschikbaarheid antilichaam. Niet-significante aanhangsel van recCD47 (of andere proteïne) verkregen kan worden veroorzaakt door een aantal factoren waaronder niet photoactivate PDT-BzPh, onvoldoende vrije koolwaterstoffen op het polymeer oppervlak hydrofobiciteit polymeer oppervlak of het polymeer kan te dik of ondoorzichtig om licht door te laten voor een adequate quantificatie. Al deze variabelen kan proefondervindelijk worden getest en geoptimaliseerd voor een specifieke polymeer.
De Chandler Loop Apparatus is een unieke tool voor de ex vivo analyse van menselijk bloed blootstelling aan polymere oppervlakken. Dit systeem lijkt op de perfusie van bloed door klinische bloed leidingen gebruikt in verschillende medische procedures, waardoor de analyse van vele fysiologische eindpunten geassocieerd met bloed contactoppervlakken. Fysiologische eindpunten voor de aanhangsel van recCD47 polymere oppervlakken werden celtellingen met DAPI kleuring (figuur 4) en scanning electron microscopie (figuur 5) gebruikt. Andere eindpunten kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de beschikbaarheid van apparatuur, bijvoorbeeld celtellingen vóór en na de perfusie van bloed door polymère bloed leidingen kunnen ook worden gebruikt. Ongeacht, recCD47 gemodificeerde oppervlakken vertoonden significant minder gehecht cellen vergeleken met ongemodificeerde stuurvlakken. Deze data suggereren dat recCD47 overbrengt biocompatibiliteit polymere oppervlakken en kan eventueel worden gebruikt om de FBR in klinische procedures middels polymere bloed leidingen te voorkomen.
Hoewel dit een veel gebruikt model voor in vitro bloed perfusie studies, is beperkt in bepaalde opzichten. De twee belangrijkste nadelen van deze werkwijze voort uit de vereiste voor de lucht in de buis met het bloedmonster. De frequente bloed interactie met lucht kunnen leukocyten en aggregatie van bloedplaatjes en eiwitdenaturatie 16-18, die kunnen interfereren met bepaalde eindpunten veroorzaken. Ten tweede, de lucht blijft op het hoogste punt van het circuit, beperkt de snelheid van de bloedsomloop 19. Ondanks de schijnbare beperkingen van deze werkwijze induceert minder bloedschade dan concurrerende werkwijzen 19 en dient als een manier screenen van de biocompatibiliteit van potentiële biomoleculen op polymere bloed leidingen. Zodra de kandidaat biomoleculen worden geïdentificeerd door middel vandeze werkwijze kan verdere analyse worden verkregen via in vivo diermodellen. Uiteindelijk is de biocompatibiliteit van gemodificeerde polymeren moet worden bevestigd met een geschikte in vivo modelsysteem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, onder nummer award R21 EB015612 (SJS), en het National Heart, Lung, and Blood Institute, onder nummer award T32 HL007915 (JBS en RJL), van de National Institute of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Scientific | 58906 | Caution! Use in fume hood |
| 25% Glutaraldehyde | VWR | AAA17876-AP | Caution! Use in fume hood |
| 2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH) | Synthesized in lab | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059-100G | |
| Citrate | Sigma | S5770-50ML | |
| Digital Camera | Leica | DC500 | Out of production |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547-100ML | Caution! Use in fume hood |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco/Life Technologies | 14190-136 | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TE300 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | Caution! Use in fume hood |
| Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-12730 | |
| Osmium Tetroxide | Acros Organics | 197450050 | Caution! Use in fume hood |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3) | Sigma | 237205-100G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655-100G | |
| PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit) | Terumo Cardiovascular Systems | 60050 | Most clinical-grade tubing will work |
| Scanning Electron Microscope | JEOL | JSM-T330A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | Spectramax Gemini EM | |
| Sulfo-SMCC | Sigma | M6035-10MG | Moisture Sensitive! |
| tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531 | |
| Vectashield with DAPI | Fisher Scientific | H-1200 | Light sensitive! |
| Zeba Spin Desalt Columns – 7 K MWCO | Thermo Scientific | 89891 |
References
- Bruck, S. D.
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin. Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Levy, J. H., Tanaka, K. A. Inflammatory response to cardiopulmonary bypass. Ann. Thorac. Surg. 75, S715-S720 (2003).
- Sperling, C., Maitz, M. F., Talkenberger, S., Gouzy, M. F., Groth, T., Werner, C. In vitro blood reactivity to hydroxylated and non-hydroxylated polymer surfaces. Biomaterials. 28, 3617-3625 (2007).
- Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups. Biomaterials. 26, 6547-6457 (2005).
- Vasita, R., Shanmugam, I. K., Katt, D. S. Improved biomaterials for tissue engineering applications: surface modification of polymers. Curr. Top. Med. Chem. 8, 341-353 (2008).
- Subramanian, S., Parthasarathy, R., Sen, S., Boder, E. T., Discher, D. E. Species- and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPalpha. Blood. 107 (6), 2548-2556 (2006).
- Tsai, R. K., Discher, D. E. Inhibition of 'self' engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells. J Cell Biol. 180 (5), 989-1003 (2008).
- Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends Immunol. 29 (5), 203-206 (2008).
- Oldenborg, P. A., Zheleznyak, A., Fang, Y. F., Lagenaur, C. F., Gresham, H. D., Lindberg, F. P. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2001).
- Finley, M. J., Rauva, L., Alferiev, I. S., Weisel, J. W., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33, 5803-5811 (2012).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34, 8640-8649 (2013).
- Ravetch, J. V., Lanier, L. L.
- Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of blood: a method for producing a thrombus. Lab Invest. 7, 110-114 (1958).
- Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea Hyperb Med. 20 (2), 101-119 (1993).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platlet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. Intl J of Legal Med. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., Fainerman, V. B., Wüstneck, R., Krägel, J., Trukhin, D. V. Characterization of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A. 131 (1-3), 225-230 (1998).
- Oeveren, W. V., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. Int J Biomater. 2012, (2012).
