Abstract
Sentetik yüzey gövdesine içeri getirildiği zaman, yabancı cisim reaksiyon meydana gelir. Bu işlem sonrası komplikasyonlara yol açan, kan proteinleri adsorpsiyon ve trombositlerin arkaya takılmasının ve aktivasyonu, monosit / makrofaj yapışma, ve inflamatuar hücre sinyal olayları ile karakterize edilir. Chandler Döngü Aparatı araştırmacılar kan geniş hacimli polimerik kanallar üzerinde perfüze zaman meydana gelen moleküler ve hücresel etkileşimleri çalışmak için izin veren deneysel bir sistemdir. Bu amaçla, bu cihaz, çeşitli polimer yüzey modifikasyonları, anti-enflamatuar özellikleri tahmin edilmesine izin veren bir ex vivo bir modeli olarak kullanılmıştır. Laboratuvarımız kovalent rekombinant CD47 ile aktifleştirme kimyası ile modifiye kan kanallar, polimerik yüzeylere biyouyumluluk kazandıran göstermiştir. Polimerik yüzeylere CD47 ekleme polimerik kan kanalların etkinliğini teşvik etmek etkili bir araç olabilir. HerEin CD47 değiştirilebilir ve kontrol kanallarına kan etkileşimleri incelemek için klinik olarak anlamlı bir polimer, kan ve boru, bir ex vivo deney modeli olarak Chandler özenin kullanımının, rekombinant CD47 eklemek için kullanılan foto-aktifleştirme kimyası ayrıntılı bir yöntemdir.
Introduction
Örneğin kardiyopulmoner baypas ve böbrek diyalizi gibi pek çok klinik uygulamalar ise, polimerik kan kanalların kullanılmasını gerektirir ve genellikle işlem sonrası komplikasyonlara 1 ile ilişkilidir. Kan ile perfüze edilmiş olduğunda, bu polimerler, kan proteinleri ve trombositler, monosit / makrofaj yapışma emdirme ile sonuçlanır, yabancı cisim reaksiyonu (FBR) kural dışı, ve işlem sonrası komplikasyonlara ve katkı yapan tüm bu pro-enflamatuar sitokinlerin salınması / veya aygıt hatası 2,3. Böylece, bu sorunu çözmek için stratejiler biomateryaller önemli bir araştırma ve devam eden alan kalır. Müfettişler biyoaktif veya biyoinert molekülleri 4-6 kan temas yüzeyleri değiştirerek bu sorunu çözmek için çalıştılar. Laboratuvarımızda Araştırma FbR hafifletmek ve bu malzemelerin etkinliğini artırmak için bir strateji olarak polimerik biyomalzeme rekombinant CD47 (recCD47) ekleyerek odaklanmıştır. CD47 bir yerde ifade transmembr olduğuhücreleri 7-10 ve gösterileri ifade üzerine bağışıklık kaçırma bilinen bir rol kazandıran "öz" durumu ile ane protein polimerik yüzeyler 11-13 eklendiği takdirde biyouyumluluk veren de söz veriyorum. Sinyal-düzenleyici proteini alfa (SIRPα), CD47 için ortak kökenli alıcı, ve zar-ötesi proteinlerin ailesi-ihtiva-eden immüno reseptör tirosin bazlı inhibisyon motifi (İTİM) üyesi, miyeloid kökenli 14 hücreleri üzerinde ifade edilir. Daha önce CD47, SIRPα aracılı hücre sinyal iletimi yoluyla, in vitro, ex vivo olarak, poliüretan (PU) ve polivinil klorür (PVC) için bağışıklık tepkilerini aşağı regüle eder ve in vivo modellerde 11-13 olduğunu göstermiştir.
Yapılan incelemelerde Orta kimyasal olarak reaktif tiyol gruplar kovalent olarak bir çok fonksiyonlu bir polimer (PDT Bz ile reaksiyona sokulması suretiyle borunun polimerik boru eklenmiş olduğu, burada tarif edilen bir nispeten yeni bir foto-aktifleştirme kimyası, bir2-piridilditiyo (PDT) oluşan) Ph, fotoreaktif benzofenon (BzPh) ve bir karboksi-değiştirilmiş polialilamin 11-13. Tris kovalent ekteki PDT gruplarının indirgenmesi (2-karboksietil) fosfin hidroklorür (TCEP); 11 sonradan olarak bir yüzey tiollenmiş terapotık kısımlar ile reaksiyona verir. Bu tarifnamede daha önce ayrıntılı 12,13, ayrıca bir C-terminali poli-lisin 12,13 kuyruk ilavesiyle modifiye recCD47, Sülfosukinimidil-4-[N -maleimidomethyl] sikloheksan-1-karboksilat ile reaksiyona sokulur (sülfo-SMCC) 1 saat boyunca ve boru 11 arasında bir recCD47 monosulfide bağ oluşumuna müsaade eden, tiol-reaktif gruplar oluşturmak için. CD47 fonksiyonalize yüzeylerinin anti-enflamatuar kapasitesi orjinal trombotik pıhtılaşma 15 bir in vitro modeli olarak, 1958 de tarif edilmiştir bütün insan kanı ile Chandler döngü aygıtı kullanılarak ex viv o test edilmiştir. Aparat bir dayanırkapalı bir boru sisteminin kısmen hava ve boru 15 yoluyla kan dolaşımı için bir döner motor ile doldurulur. Bu deneysel modelde, modifiye edilmiş ve modifiye edilmemiş yüzeyleri üzerine kan maruz kalma etkisi ve aynı zamanda kan hücrelerinin fizyolojisi üzerine, bu yüzey modifikasyon etkisini incelemek için bir fırsat sağlar.
recCD47 Bu aktifleştirme kimyası kullanılarak polimer çeşitli yüzeyler eklenmiş olabilir, ve anti-enflamatuar kapasitesi polimer yüzeyleri 11,12 üzerinden kan perfüzyonunun taklit eden klinik olarak anlamlı bir eks vivo modeli kullanılarak değerlendirilebilir. Aparat insan kanı maruz kaldığında, değiştirilmemiş polimerlere kıyasla recCD47 modifiye klinik sınıf kan kanalları önemli ölçüde daha az trombosit ve inflamatuar hücre eki göstermektedir. Bu modifikasyon işleminin bir adım-adım bir açıklaması aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
RecCD47 ile 1. değiştirme Polimer Yüzeyler
NOT:. Protokol, Şekil 1 'de şematik olarak özetlenmiştir Şekil 1A, tiol-reaktif polimer yüzeylerinin oluşumunu göstermektedir Şekil 1B, tiol-reaktif recCD47 yaratılışını gösterir..
- 1. Gün
- , Steril su içinde bir PDT-BzPh çözeltisi (1 mg / ml) ve potasyum bikarbonat (KHCO 3) (0.7 mg / ml) hazırlayın. 4 ° C (ışıktan koruma) gece boyunca karıştırın.
- Gün 2
- (Dönen tekerlekler etrafında sığacak kadar uzun) 40 cm uzunluğunda parçalar halinde polimerik borunun kesin.
- Bir çalkalama ya da Chandler döngü aygıtı üzerinde oda sıcaklığında 90 dakika boyunca hexacylpyridinium bir% 0.1 sulu çözelti içinde tüpler bekletin. 90 dakika bekletin sonra steril su 3x tüpleri durulayın.
- (% 15 sulu potasyum fosfat monobazik eklenerek Gün 1 PDT BzPh çözeltisinin asitleştirilmesi KH 2 4). Bulanık bir misel çözeltisinin oluşturulması, PDT BzPh ml'si başına 50 ul KH 2 PO 4 ekleyin.
- Bir çalkalama veya aparat üzerinde oda sıcaklığında 40 dakika boyunca asidifiye PDT BzPh çözelti içinde tüpler bekletin.
- Bir defa, seyrek asetik asit (1.000 1) ile boru durulayın.
- 60 dakikalık bir toplam süresi boyunca UV-ışını tüpleri için Açığa. Tüm yüzey alanını aydınlatmak için her 15 dakikada ¼ tüpler döndürmek.
- Bir çalkalama veya aparat üzerinde oda sıcaklığında 20 dakika boyunca, 20 mg / ml potasyum bikarbonat çözeltisine (KHCO 3) tüpler bekletin.
- , Steril su içinde, 4 ° C'de steril su ve 3 x deposuyla tüpleri durulayın.
- Gün 3
- (: Çeker ocak içinde gerçekleştirme Dikkat) 200 ul dimetilformamid (DMF) içerisinde 5 mg Sülfo-SMCC çözülür.
- RecCD47 poli-lizin çözeltisi 0.1 mg / ml aşama 1 'de hazırlanmış olan Sülfo-SMCC çözeltisi 50 ul, ve RO' de 60 dakika karışmasınaom sıcaklığı.
- 60 dakika süreyle karıştırılmaya sırasında gazını Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ve bir kenara, steril.
- Saflaştınlır Sülfo-SMCC, üretici talimatlarına göre bir 7K molekül ağırlıklı bir kesim sıkma tuz giderme kolonu kullanılarak recCD47 tepki gösterdi. Nihai akış yoluyla (yüksek kaliteli tiol-reaktif recCD47) toplayın ve kat DPBS ile borunun iç için gerekli hacme kadar seyreltin.
- Steril ile 2 gün tüpleri durulayın, DPBS 3x gazı alındı.
- En az 2 dakika süreyle gazdan arındırılmış DPBS içinde 20 mg / ml 'si ile tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorür (TCEP) bir çözeltisi ile, tüplerin olarak değiştirilmiş bir yüzeyi React. Steril gazı alınmış DPBS 4x'te tüpleri durulayın.
- Tüplerine Sülfo-SMCC-reaksiyona recCD47 ekleyin ve bir çalkalama cihazında ya da 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
Modifiye Yüzeyler üzerinde recCD47 2. İmmünotest Kantitasyonu
- Modifiye tüpleri durulayın Gün 3 zekâ gelen sayısal edilecekh DPBS 3x. Mağaza tüpler 4 ° C'de DPBS ölçümü için kullanılmaz.
- 96 çukurlu bir levhanın gözleri içine biyopsi zımbaları çift boru örnekleri yapmak ve yerleştirmek için 4 mm biyopsi zımbası kullanın.
- Tespit antikoru ile tedavi edilmeyen modifiye edilmemiş bir boru numunesinin oluşan bir negatif kontrol hazırlayın. Tespit antikoru ile tedavi edilmiş bir modifiye edilmemiş boru numunesi aşağıdakilerden oluşan bir antikor kontrolü hazırlayın. Tespit antikoru ile muamele edilmiş tadil edilmiş boru test numunelerini hazırlayın.
- Bir karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında 60 dakika boyunca DPBS içinde% 0.4 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ile blok örnekleri.
- Engelleme aspirat BSA ve tris-tamponlu tuzlu su ve% 1 Tween-20 (TBST) 3x, bir çalkalayıcı üzerinde 10 dakika her biri ile yıkayın.
- Bağışıklık için üreticinin tavsiye edilen seyreltme göre% 0.4 BSA içinde antikorun bir seyreltme çalışma hazırlayın. İnsan CD47 Antikor B6H12-FITC 1 seyreltilir: 100% 0.4 BSA içinde.
- Uygun oyuklara antikor seyreltme 200 ul ilave edin. Tekni% 0.4 BSA, sadece Te negatif kontrol eder. Bir çalkalayıcı üzerinde 60 dakika boyunca (ışıktan koruma) için oda sıcaklığında inkübe edilir.
- TBST'dir 3x, 10 dakika bir çalkalayıcı her ile durulayın. Son TBST'dir durulama aspire ve tüp numune kuyulara 200 ul DPBS ekleyin.
- Nihai akış yoluyla yüksek kalitede tiol-reaktif rekombinant CD47 bir toplayın ve kat DPBS ile tüplerin iç için gerekli hacme kadar seyreltin.
- FITC uyarma (485 nm) ve emisyon (538 nm) ayarları ile bir mikrotablaya okuyucu kullanarak FITC sinyal yoğunluğu okuyun.
- Hesaplayın recCD47 otomatik floresans ve non-spesifik antikor, kontrol örneğinden bağlayıcı oluşturacak şekilde standart değerlere dayalı polimer yüzeyine bağlanır.
3. Chandler Döngü Aparatı Protokolü
Kan toplama protokolü Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) onayı ve bilgilendirilmiş onam evrak önce insan kan numunelerinin toplanması başlamadan isteyin. Bilgi edininonaylanmamis bir insan kanı donörden onayı.
Not: aparatı gösteren bir diyagramı Şekil 2 de gösterilmiştir.
- Yaklaşık olarak 1/2 tekerleklerinin çapı kadar damıtılmış su ile doldurun su banyosu içine monte edilmiştir. % 10 ağartıcı çözelti yapmak için su banyosu için yeterli çamaşır suyu ilave edin. Ayarlama, su 37 ° C banyo ısısı ve dengelenmeye gelmeye bırakın.
- Metal (Şekil 1 B 'de gösterildiği gibi) bağdaştırıcılar, modifiye edilmemiş ve modifiye edilmiş boru boru toplayın, ve Şekil 1C' de gösterildiği gibi, cihaz tekerlekleri etrafında bir araya getirin. Bu boru yerine metal adaptör ile tekerleğin etrafında kuytu uyduğundan emin olun.
- Sitrat ya da diğer antikoagülan, 2 ml ile doldurulmuş bir şişe içinde, bir IRB onaylı protokol kullanılarak 30 ml'lik bir kan örneği elde edilir, ve numune, bir kez tıkama bilmek çevirerek karıştırın.
- Tüp içinde bir hava bırakarak metal valfi ve bir şırınga kullanarak her bir tüp için kan yaklaşık 10 ml ilave edilir. Valf kapağını ve r Secure3 saat boyunca otate.
- % 10 çamaşır suyu çözeltisi ile muamele edilmiş bir atık behere kan akıtmak (ya da kurumsal politika tarafından gerekli).
- Yavaşça bütün kan izlerini kaldırmak için DPBS boru içini durulayın. Akış yoluyla atık beher toplayın. Kurumsal politikası uyarınca kan imha edin.
- Aparatı ve yüzeyleri% 10 çamaşır suyu çözeltisi kullanılarak ya da kurumsal politikaya göre temas herhangi bir kan dezenfekte edin.
- Fluoresan mikroskobu ya da tarama elektron mikroskobu için işlem örnekleri aşağıda tarif edildiği gibi.
4. Floresan Mikroskopi ve Hücre Sayım
- % 4 paraformaldehid (PFA) solüsyonu (Dikkat: davlumbaz gerçekleştirin) hazırlayın.
- 4 ° C de bir gece% 4 PFA çözeltisi içinde boru inkübe edin.
- Gece boyunca inkübasyondan sonra,% 4 PFA çıkarın ve DPBS filmler çok yavaşça çalkalayın.
- Boyama için lümen yüzey ortaya bölüme hortumu kesilir.
- LekeOda sıcaklığında 30 dakika boyunca 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile ortam monte edilmesi için bir kaç damla ise, borunun bir bölümü (ışıktan koruma). Boyama sonra, arka plan DAPI sinyali azaltmak için DPBS ile çok yavaşça tüp durulayın.
- DAPI filtre ve dijital kamera ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanılarak görüntü 200X büyütmede görüntüsü altında 9 körü körüne seçilen alanlarda hücrelerin sayısını saymak için.
- Tutanak hücre görüş alanı başına sayar ve sonuçların istatistiksel önemini belirlemek için uygun istatistiksel analizler gerçekleştirmek.
5. Taramalı Elektron Mikroskobu
- % 2 glutaraldehit çözeltisi (Dikkat: davlumbaz gerçekleştirin) hazırlayın.
- Gece boyunca 4 ° C'de% 2 glutaraldehid solüsyonunda boru inkübe edin.
- Gece boyunca inkübasyondan sonra, yavaşça DPBS ile boru 3 kez yıkayın.
- Ozmiyum tetroksit bir% 1 çözeltisi hazırlayın (Dikkat: Şiddetli inhalasyon tehlike! ) Davlumbaz kullanın.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca ozmiyum tetroksit bir% 1 çözeltisi içinde boru inkübe edin.
- Yavaşça DPBS boru 3x durulayın.
- Etanol konsantrasyonları bir dizi (% 25,% 50,% 75,% 95 ve% 100 etanol) hazırlayın.
- Etanol konsantrasyonu dizi içinde inkübe edilerek, boru kurutmak. % 25,% 50,% 75, ve 20 dakika her biri için% 95 etanol içinde inkübe edin. 30 dakika boyunca% 100 etanol içinde inkübe edin.
- Süper kritik nokta nemi çıkarmak için 45 dakika boyunca CO2 ile boru kurutun.
- Gümüş macun veya grafit ile bir örnek saplama Mount tüp bölümleri.
- Altın paladyum 12.5 nm ile kaplayın tüp bölümleri.
- Bir taramalı elektron mikroskobunda inceleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SMCC ile tiyol-reaktif recCD47 poli-lisin ile birlikte PDT BzPh ve TCEP kullanımı yoluyla tiol-reaktif polimer yüzeyleri oluşturma polimerik yüzeylere recCD47 eklenmesine izin verir. Modifikasyon işlemi Şekil 1 şematik olarak özetlenmiştir. Bu modifikasyon işleminin rahatlık, bu protein varsayarak, örneğin amin içeren bir lisin ve yeterli kimyasal yönden reaktif gruplar ile modifiye edilebilir, bir çok farklı protein ve bir çok farklı polimerik yüzeylere uygulanabilir olmasıdır , polimer yeteri kadar mevcut hidrokarbonlar yer alır.
Bu recCD47 bu protokolü kullanarak 11-13 polimerik yüzeylere eklenebilir daha önce gösterilmiştir. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, önemli bir FITC ile boyama DİK görüntüleme ile gösterildiği gibi, filme özellikle lokalize CD47 hücre dışı Ig domeyninde, bir FITC-konjuge antikoru kullanılarak, recCD47 için görünür(Şekil 3B). Bu sonuçlar recCD47 kovalent poliüretan filmler monte edilebilir olduğunu göstermektedir. RecCD47 bağlı yüzey konsantrasyonu tespit floresan birimlerinin ölçülmesi ve standart bir eğri ile mukayese etmek. Bu recCD47, 500 ng / cm 2,11-13 aşan seviyelerde polimerik yüzeylere eklenebilir göstermiştir. Bu sonuçlar, bu, tiyol-temelli polimer tadil protokol polimerik yüzeylere poli-lisin modifiye edilmiş rekombinant proteinleri eklemek için kullanılabileceğini teyit etmektedir.
CD47 inflamatuar hücre eki ve bağışıklık sistemi aktivasyonu 7-13 önlenmesi ", kendini" bir göstergesi olduğu gösterilmiştir. Bir ex vivo ortamda mümkün olduğu kadar yakın in vivo koşullarda taklit etmek için, bütün insan kanı Chandler Döngü Aygıtı ile modifiye edilmemiş veya modifiye polimer boru içinden perfüze edilebilir (Şekil 2'de gösterilmiştir). Hücre bağlantı borusuna (DAPI lekelemesi yoluyla değerlendirilebilir
Yüzey modifikasyonu Şekil 1. Şematik. A), polimer yüzeylerinin sahip tiollenmiş TCEP. B) çapraz bağlayıcı foto-aktifleştirilebilen PDT BzPh ve sonradan azalma ile birlikte, polimerik yüzey inkübe edilmesi ile oluşturulmuştur </ Strong> SMCC, daha sonra recCD47 fonksiyonalize yüzey elde etmek üzere, sentetik tiollenmiş yüzeyi ile reaksiyona sokuldu, tiol-reaktif recCD47 üretilmesi için kullanılmıştır.
Chandler Döngü Aparatı 2. Şeması Şekil. A), aparat 37 ° C'de döner bir motora bağlı bir metal kutup sabitlenmiş döner silindir ısıtılmış bir su banyosu oluşur. Bu metal adaptörler olarak çemberi meydana getiren boru uçlarını bağlamak için kullanılır), böylece boru. B ile 37 ° C su banyosu ve kan perfüzyonunun içine boru bölümlerini batırmak, tekerleklerin açmak için döner motor sağlar ayarlamak Döner tekerleklerden birinin etrafında. Kan monte edildikten sonra, boru ve metal kapak kuytu ar oturmalıdır metal kapak bağlantı noktası üzerinden tüplere ilave edildi ve valf kapağının. ° C) ile örtülüdürduyulsa da boş bir boru ile burada gösterildiği gibi, döner tekerlek.
Poliüretan filmlerde recCD47 3. Nicelendirme Şekil. CD47 dış Ig domeyninde karşı yönlendirilen antikorlar, poliüretan filmler bağlı recCD47 miktarını belirlemek için kullanılmıştır. Floresan mikroskop görüntüleri poliüretan (A) eklenen recCD47 FITC saptanmasını gösteren uygun filtre setleri ile 200X büyütme altında alınır. (B), DIC görsel FITC sinyali poliüretan film özgü olduğunu göstermektedir.
Değiştirilmemiş ve recCD47-modifiye poliüretan Şekil 4. Hücre yapışma. Tüm insan kanı toplanır ve üzerine zerkedilmektedir modifiye edilmemiş veya modifiye edilmiş-recCD473 saat poliüretan filmler. 3 saat perfüzyon sonrasında, sinema DPBS ile yıkandı ve yapışan hücreler, 4 ° C'de bir gece boyunca% 4 PFA ile sabitlendi ve DAPI oda sıcaklığında 30 dakika boyunca boyanmıştır. DAPI boyanan hücreler 200X büyütme ve uygun filtre setleri altında floresan mikroskop kullanılarak sayıldı. (A), 9 izleme rastgele seçilen alanlar, her değişiklik için sayıldı. (B) veri 9 izleme alanları temsil eder ve ortalama ± standart hata (p = 0.004) olarak ifade edilir.
RecCD47 Şekil 5. SEM analizleri modifiye ve kontrol yüzeyleri ex vivo analizi takip. Tüm insan kanı toplanır ve 3 saat için modifiye edilmemiş veya modifiye edilmiş recCD47-PVC boru donanımına daha fazla perfüze edildi. Temsilcisi görüntüleri unmodifi önemli hücre eki göstermekrecCD47-değiştirilmiş yüzeyler sadece arada bir bağlı hücre göstermek ise ed yüzeyleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
(Şekil 1 'de özetlenen veriler) foto-aktifleştirme kimyası PDT-BzPh eki ve daha sonra UV ışınlaması kolaylaştırmak için yeterli hidrokarbonlara hemen hemen herhangi bir polimer yüzeyinin değişimine olanak sağlar PDT BzPh fotoğrafı dışı bırakacaktır. Reaktif tiyol grupları ile polimerik yüzey fonksiyonalize ilgi test edilebilir bir molekül, bir dizi daha sonra eklenmesine izin verir. Bizim özel çalışmalarda biz rekombinant CD47 11-13 seçti. Bu iki fonksiyonlu çapraz bağlayıcı SMCC ile 11-13 protein amin gruplarının reaksiyonu dahil, kullanılan özel birleşme kimyası. Bu tiollenmiş polimer yüzeyi ile bir sonraki reaksiyon için tiol-reaktif recCD47 sağladı. Son ürün, kovalent olarak polimere recCD47 bağlayıcı bir mono-sülfid bağ oldu. CD47 yer alan amino asitlerden amin grupları, reaksiyon için kullanılmadığından emin olmak ve böylece etkinliğini azaltmak yardımcı olmakHareketsizleştirilmiş CD47 arasında, daha ayrıntılı bir şekilde, proteinin C-ucunda bir poli-lisin etiketi sokulmasıyla modifiye recCD47. Benzer bir strateji, moleküler diğer proteinler ile uygulanabilir olduğu pek uygun olur. Böylece birleşme kimya Burada sunulan ve başka yerlerde 11-13 sentetik yüzeyler üzerine biyouyumluluk kazandırmak için potansiyel terapötik moleküllerin yeteneğini değerlendirmek için önemli bir fırsat sağlar.
Bu protokol bir dezavantajı UV ışınlaması uzun süreler için poliüretan gibi polimerlerin belirli türleri, açığa renk neden olabilir. Bu PDT BzPh fotoaktivasyon engellemeksizin, polimerin solmasını önlemek üzere (genel olarak doku kültüründe kullanılan) polistiren yemekler polimerin yerleştirilmesi ile önlenebilir. Bu protokolde kullanılan UV ışığın dalga boyu 302 nm; Bu dalga sapma PDT BzPh verimsiz foto-aktivasyon neden olabilir. Farklı dalga boyu kullanılarak EğerKızıl ötesi ışık, UV ışınlarına maruz kalma süresi optimizasyonu önemli foto-aktivasyon sağlamak için gereklidir.
Bu protokol yabancı cisim reaksiyonu önlemek için polimer yüzey bağışıklık kaçırma ve taşıma "öz" durumunun amacıyla, polimerik yüzeylere recCD47 eklenmesine izin verir. Yüzeyine ekli recCD47 miktar tayini, bir bağışıklık tahlilini ve floresan mikroskobu (Şekil 3) ile CD47 Ig domeyninde bir FITC-etiketli bir antikor kullanılarak tamamlanır. Bu yöntem, antikor durumunu farz polimerik yüzeylere ekteki başka proteinler için adapte edilebilir. RecCD47 (ya da diğer protein) önemli bir ek düzen alınmaması PDT BzPh photoactivate başarısızlık, polimer yüzeyi üzerinde yeterli serbest hidrokarbon, polimer yüzeyinin hidrofobiklik, aşağıdakileri içeren faktörlere bağlı olarak çeşitli olabilir, ya da polimerin çok kalın olabilir ya da Işık yeterli quantific için geçmesine izin vermek için opaktirme. Bu değişkenlerin tüm deneysel olarak test edilmiş ve belli bir polimer için optimize edilebilir.
Chandler Döngü Aparatı polimerik yüzeyler için bütün insan kanı maruz ex vivo analizi için eşsiz bir araçtır. Bu sistem daha sıkı kan temas yüzeyleri ile ortaya çıkan bir çok fizyolojik bitiş noktası analizi sağlayan çeşitli tıbbi prosedürlerde kullanılan klinik kan kanalların kanın perfüzyonunu benzer. Polimerik yüzeylere recCD47 ekinin fizyolojik uç noktalar olarak, Dapi (Şekil 4) ve taramalı elektron mikroskobu (Şekil 5) kullanılarak hücre sayımları kullanıldı. Diğer uç noktaları aynı zamanda, örneğin, hücre sayısı ve polimerik önce kan borular boyunca kan akışı bittikten sonra bile kullanılabilecek, ekipman durumuna bağlı olarak kullanılabilir. Ne olursa olsun, recCD47-modifiye yüzeyler değiştirilmemiş kontrol yüzeylere oranla daha az yapışık hücreleri sergiledi. Bu data recCD47 polimerik yüzeylere biyouyumluluk taşır ve potansiyel polimerik kan olukları kullanarak klinik işlemlerde FbR önlemek için kullanılan olabileceğini düşündürmektedir.
Bu, yaygın olarak kan perfüzyon çalışmaları için kullanılan bir in vitro model olsa da, bazı açılardan sınırlıdır. Bu yöntemin iki önemli dezavantajı bir kan örneği ile, boru içinde havanın dahil edilmesi ihtiyacı ortaya çıkar. Hava ile sık kan etkileşim bazı uç noktaları ile uğratabilecek lökosit ve trombosit agregasyonu ve protein denatürasyonu 16-18, neden olabilir. İkinci olarak, hava, kan dolaşımı 19 oranını sınırlandırarak devrenin en yüksek noktasında kalır. Bu yöntemin belirgin kısıtlamalara rağmen, bu yöntemler rakip 19 daha az kan zarardan sorumlu olan, ve polimerik kan boruları potansiyel biyomoleküllerin biyouyumluluk elenmesi için bir yol olarak hizmet vermektedir. Aday biomoleküller yoluyla tespit edildikten sonraBu yöntem, daha fazla analiz in vivo hayvan modellerinde elde edilebilir. Son olarak, modifiye edilmiş polimerlerin biyouyumluluk bir canlı sisteminde uygun bir ile teyit edilmesi gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu yayında rapor Araştırma National, ödül sayısı T32 HL007915 (JBS ve RJL) kapsamında, ödül sayısı R21 EB015612 (SJS) ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü bünyesinde Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik, Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen Sağlığı Enstitüsü.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Scientific | 58906 | Caution! Use in fume hood |
| 25% Glutaraldehyde | VWR | AAA17876-AP | Caution! Use in fume hood |
| 2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH) | Synthesized in lab | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059-100G | |
| Citrate | Sigma | S5770-50ML | |
| Digital Camera | Leica | DC500 | Out of production |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547-100ML | Caution! Use in fume hood |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco/Life Technologies | 14190-136 | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TE300 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | Caution! Use in fume hood |
| Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-12730 | |
| Osmium Tetroxide | Acros Organics | 197450050 | Caution! Use in fume hood |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3) | Sigma | 237205-100G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655-100G | |
| PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit) | Terumo Cardiovascular Systems | 60050 | Most clinical-grade tubing will work |
| Scanning Electron Microscope | JEOL | JSM-T330A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | Spectramax Gemini EM | |
| Sulfo-SMCC | Sigma | M6035-10MG | Moisture Sensitive! |
| tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531 | |
| Vectashield with DAPI | Fisher Scientific | H-1200 | Light sensitive! |
| Zeba Spin Desalt Columns – 7 K MWCO | Thermo Scientific | 89891 |
References
- Bruck, S. D.
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin. Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Levy, J. H., Tanaka, K. A. Inflammatory response to cardiopulmonary bypass. Ann. Thorac. Surg. 75, S715-S720 (2003).
- Sperling, C., Maitz, M. F., Talkenberger, S., Gouzy, M. F., Groth, T., Werner, C. In vitro blood reactivity to hydroxylated and non-hydroxylated polymer surfaces. Biomaterials. 28, 3617-3625 (2007).
- Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups. Biomaterials. 26, 6547-6457 (2005).
- Vasita, R., Shanmugam, I. K., Katt, D. S. Improved biomaterials for tissue engineering applications: surface modification of polymers. Curr. Top. Med. Chem. 8, 341-353 (2008).
- Subramanian, S., Parthasarathy, R., Sen, S., Boder, E. T., Discher, D. E. Species- and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPalpha. Blood. 107 (6), 2548-2556 (2006).
- Tsai, R. K., Discher, D. E. Inhibition of 'self' engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells. J Cell Biol. 180 (5), 989-1003 (2008).
- Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends Immunol. 29 (5), 203-206 (2008).
- Oldenborg, P. A., Zheleznyak, A., Fang, Y. F., Lagenaur, C. F., Gresham, H. D., Lindberg, F. P. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2001).
- Finley, M. J., Rauva, L., Alferiev, I. S., Weisel, J. W., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33, 5803-5811 (2012).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34, 8640-8649 (2013).
- Ravetch, J. V., Lanier, L. L.
- Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of blood: a method for producing a thrombus. Lab Invest. 7, 110-114 (1958).
- Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea Hyperb Med. 20 (2), 101-119 (1993).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platlet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. Intl J of Legal Med. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., Fainerman, V. B., Wüstneck, R., Krägel, J., Trukhin, D. V. Characterization of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A. 131 (1-3), 225-230 (1998).
- Oeveren, W. V., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. Int J Biomater. 2012, (2012).
