Abstract
תגובת הגוף הזר מתרחשת כאשר משטח סינטטי הוא הציג לגוף. הוא מאופיין על ידי ספיחה של חלבוני דם ואת הקובץ המצורף וההפעלה הבאים של טסיות דם, מונוציטים / הידבקות מקרופאג, ואירועי תא איתות דלקתיים, שמוביל לסיבוכים לאחר פרוצדורליים. מכשירי צ'נדלר Loop הוא מערכת ניסיונית המאפשרת לחוקרים ללמוד את יחסי גומלין המולקולריים ותאיים המתרחשים כאשר כמויות גדולות של דם הן perfused מעל תעלות פולימריים. לשם כך, מנגנון זה שמש כמודל ex vivo המאפשר ההערכה של התכונות אנטי דלקתיות של שינויי משטח פולימרים שונים. המעבדה שלנו הראתה כי תעלות דם, הותאמו קוולנטית באמצעות כימיה photoactivation עם CD47 רקומביננטי, יכולות להעניק biocompatibility למשטחים פולימריים. צירוף CD47 למשטחים פולימריים יכול להיות אמצעי יעיל לקידום היעילות של צינורות דם פולימריים. שלהעין היא מתודולוגיה המפרטת את הכימיה photoactivation נהגה לצרף CD47 רקומביננטי לתעלות רלוונטיות קליני פולימריים דם והשימוש בלולאת צ'נדלר כvivo לשעבר מודל ניסיוני לבחינת אינטראקציות דם עם תעלות CD47 שונה ושליטה.
Introduction
נהלים רבים קליניים, כגון מעקף לב ודיאליזה, מחייבים את השימוש של צינורות דם פולימרים ולעתים קרובות קשורים לסיבוכים לאחר פרוצדורליים 1. כאשר perfused עם דם, פולימרים אלו לא חוקיים תגובת הגוף הזר (FBR), וכתוצאה מכך הספיחה של חלבוני דם וטסיות דם, הידבקות מונוציטים / מקרופאג, והשחרור של ציטוקינים פרו דלקתיים, כולם תורמים לסיבוכים וכדי שלאחר פרוצדורליים / או 2,3 כשל בהתקן. לפיכך, אסטרטגיות כדי לטפל בבעיה זו תישאר באזור חשוב ומתמשך של מחקר חומרים ביולוגיים. חוקרים ניסו לטפל בבעיה זו על ידי שינוי משטחי דם פנייה עם מולקולות ביו או bioinert 4-6. מחקר במעבדה שלנו התמקד בצירוף CD47 רקומביננטי (recCD47) לחומרים ביולוגיים פולימרים כאסטרטגיה לצמצום FBR ולהגדיל את היעילות של חומרים אלה. CD47 הוא transmembr הביע בכל מקוםחלבון ane עם תפקיד ידוע בהתחמקות חיסונית, מעמד של "עצמי" המקנה לי לבטא בתאים 7-10 ומופעים מבטיח בהענקת התאמה ביולוגית כאשר צורף למשטחים פולימריים 11-13. אות הרגולציה אלפא חלבון (SIRPα), קולטן מאותו המקור לCD47, וחבר במוטיב המבוסס על טירוזין immunoreceptor המעכב (עתים) המכיל משפחה של חלבונים הטרנסממברני, באה לידי ביטוי בתאים ממוצא מיאלואידית 14. אנחנו הוכחנו בעבר כי CD47, באמצעות איתות תא בתיווך SIRPα, למטה מסדיר את התגובות חיסוניות לפוליאוריטן (PU) ופולי ויניל כלוריד (PVC) במבחנה, vivo לשעבר, ובמודלי vivo 11-13.
מרכזי לחקירות שלנו היא כימיה יחסית רומן photoactivation, שתתואר בהמשך, שבו קבוצות תיאול כימי תגובתי הן קוולנטית המצורפות לצינורות פולימריים ידי מגיב צינורות עם פולימר רב תכליתי (PDT-BZPh), מורכב מ2-pyridyldithio (PDT), benzophenone photoreactive (BzPh) וpolyallylamine-הותאם carboxy 11-13. צמצום קבוצות PDT המצורף קוולנטית עם טריס (2-carboxyethyl) hydrochloride phosphine (TCEP) 11 מניב משטח thiolated שיכול להיות לאחר מכן הגיב בmoieties הטיפולי. המפורטים כאן ובעבר 12,13, recCD47, הותאם עוד יותר עם התוספת של זנב poly-ליזין C-מסוף 12,13, הוא הגיב עם Sulfosuccinimidyl-4 [N -maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) עבור שעה 1 כדי ליצור קבוצות תיאול-reactive, המאפשר קשר monosulfide היווצרות בין צינורות ו11 recCD47. היכולת אנטי דלקתית של משטחי CD47 פונקציונליות נבדקה, לשעבר יו o, באמצעות מכשירי צ'נדלר Loop עם דם אנושי כולו, שתואר בשנת 1958 במקור כמודל במבחנה של קרישה טרומבוטיים 15. המנגנון מסתמך עלמערכת צינור סגורה באופן חלקי עם אוויר ומנוע סיבובי כדי להפיץ את הדם דרך צינורות 15. מודל ניסיוני זה מספק את ההזדמנות כדי לבחון את ההשפעה של חשיפת דם על משטחים שונה וללא שינוי, כמו גם את ההשפעה של שינויי שטח אלה על הפיסיולוגיה של תאי הדם.
יכול יצורף recCD47 למגוון משטחים פולימריים באמצעות כימיה photoactivation זה, והיכולת אנטי דלקתית שלה ניתן להעריך על ידי ניצול מודל ex vivo רלוונטי קליני מחקה זלוף דם על משטחים פולימריים 11,12. צינורות דם קליניים כיתה שונה עם recCD47 להראות פחות באופן משמעותי הטסיות ומצורפת תא דלקתי בהשוואה לפולימרים ללא שינוי כאשר הם נחשפים לדם אדם במנגנון. תיאור צעד אחר צעד של תהליך שינוי זה הנו כמפורט להלן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 משטחים פולימריים שינוי עם recCD47
הערה:. הפרוטוקול מסוכם סכמטי באיור 1 איור 1 א ממחיש דור של משטחים פולימריים תיאול-reactive איור 1 מדגים דור של recCD47 תיאול-reactive..
- יום 1
- הכן פתרון של PDT-BzPh (1 מ"ג / מ"ל) ואשלגן ביקרבונט (KHCO 3) (0.7 מ"ג / מ"ל) במים סטריליים. מערבבים לילה ב 4 ° C (להגן מפני אור).
- יום 2
- חותכים צינורות פולימריים לחתיכות ארוכות 40 סנטימטר (ארוך מספיק כדי להתאים סביב גלגלים מסתובבים).
- משרים צינורות בפתרון 0.1% מימיים של hexacylpyridinium ל90 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר או במכשירי צ'נדלר Loop. יש לשטוף את הצינורות עם 3x מים סטריליים לאחר דקות 90 לספוג.
- להפוך לחומצת הפתרון של PDT-BzPh מיום 1 על ידי הוספת 15% monobasic אשלגן זרחה מימיים (KH 2 4). הוסף 50 μl KH 2 PO 4 לכל מ"ל של PDT-BzPh, ויצר פתרון micellar מעונן.
- משרים את הצינורות בפתרון PDT-BzPh acidified ל40 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר או במנגנון.
- יש לשטוף את הצינורות עם חומצה אצטית מהולה (1: 1,000) פעם אחת.
- לחשוף את הצינורות לקרינת UV למשך כולל של 60 דקות. סובב צינורות ¼ להפוך כל 15 דקות כדי להקרין את פני השטח כולו.
- משרים את הצינורות בתמיסה של אשלגן ביקרבונט / מ"ל 20 מ"ג (KHCO 3) ל20 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר או במנגנון.
- יש לשטוף את הצינורות עם 3x מים סטריליים ולאחסן ב 4 ° C במים סטריליים.
- יום 3
- ממיסים 5 מ"ג Sulfo-SMCC ב200 dimethylformamide μl (DMF) (זהירות: בצע במנדף).
- הוסף 50 μl של פתרון Sulfo-SMCC הכין בשלב 1 כדי 0.1 מ"ג / מ"ל של תמיסת פולי ליזין recCD47, ומערבבים ל60 דקות ב roטמפרטורת אום.
- במהלך 60 מערבבים דק ', דגת סטרילית בופר פוספט של Dulbecco (DPBS) ומניחים בצד.
- לטהר Sulfo-SMCC הגיב recCD47 באמצעות טור 7K משקל מולקולרי חתוך ספין desalting לפי הוראות יצרן. אסוף זרימה דרך סופי (recCD47 תיאול-reactive באיכות גבוהה) ולדלל את נפח דרוש למעייל הפנימי של הצינור עם DPBS.
- יש לשטוף את הצינורות מיום 2 עם סטרילי, degassed 3x DPBS.
- מגיב משטח שונה של הצינורות עם פתרון של 20 מ"ג / מ"ל עם טריס hydrochloride phosphine (2-carboxyethyl) (TCEP) בDPBS degassed פחות מ 2 דקות. יש לשטוף את הצינורות עם 4x DPBS degassed סטרילי.
- הוסף את recCD47 הגיב-Sulfo-SMCC לצינורות ודגירת הלילה בשעה 4 ° C על שייקר או במנגנון.
.2 Immunoassay כימות recCD47 על משטחים השתנה
- יש לשטוף את הצינורות שונה כדי לכמת מיום 3 שנינותDPBS 3x h. צינורות חנות אינו משמשים לכימות בDPBS על 4 מעלות צלזיוס.
- השתמש בביופסית 4 מ"מ כדי להפוך את דגימות צינור כפולות ומניח את האגרופים ביופסיה בבארות של צלחת 96 היטב.
- הכן שליטה שלילית בהיקף של מדגם צינור ללא שינוי לא טופל בנוגדן זיהוי. הכן שליטת נוגדן המורכבת ממדגם צינור ללא שינוי טופל בנוגדן זיהוי. הכן את דגימות בדיקת צינורות שונה שטופלו בנוגדן זיהוי.
- דגימות בלוק עם אלבומין 0.4% בסרום שור (BSA) בDPBS ל60 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר.
- לאחר חסימה, BSA לשאוב ולשטוף עם שנאגרו מלוח טריס בתוספת 1% 3x (TBST) 20-Tween, 10 דקות כל אחד על שייקר.
- הכן דילול עבודה של נוגדן בBSA 0.4% בהתאם לדילול המומלץ של היצרן לimmunoassays. לדלל CD47 האנושי נוגדן B6H12-FITC 1: 100 בBSA 0.4%.
- הוסף 200 μl דילול נוגדן לבארות מתאימות. אינקובטוריםבקרות שליליות te עם BSA 0.4% בלבד. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 60 דקות על שייקר (להגן מפני אור).
- לשטוף עם TBST 3x, 10 דקות כל אחד על שייקר. לשאוב שטיפת TBST האחרונה ולהוסיף 200 DPBS μl לבארות מדגם צינור.
- לאסוף את הזרימה דרך סופית, שהוא CD47 רקומביננטי תיאול-reactive באיכות גבוהה ולדלל את נפח דרוש למעייל הפנימי של צינורות עם DPBS.
- קראו עוצמת אות FITC באמצעות קורא microplate עם עירור FITC (485 ננומטר) ופליטה (538 ננומטר) הגדרות.
- חישוב מחויב recCD47 למשטח פולימרים המבוססים על ערכים סטנדרטיים, והיוו אוטומטי הקרינה ואינה ספציפי מחייב ממדגם שליטת נוגדן.
פרוטוקול מכשירים .3 צ'נדלר Loop
לחפש מוסדי מועצה לביקורת אישור (IRB) של פרוטוקול איסוף דם וניירת הסכמה מדעת לפני תחילת איסוף דגימות דם של בני אדם. השג מידעrmed הסכמת מתורם דם אדם.
הערה: תרשים המתאר את המנגנון מוצג באיור 2.
- מלא אמבט מים עם מים מזוקקים עד כ 1/2 של הגלגלים בקוטר שקועים. להוסיף מספיק אקונומיקה לאמבטיה המים כדי להפוך את פתרון אקונומיקה 10%. אמבטיה להגדיר מים ל37 מעלות צלזיוס ולאפשר טמפרטורה לאזן.
- לאסוף מתאמי מתכת (שמוצגים באיור 1 ב '), צינורות ללא שינוי וצינורות שונה, ולהרכיב סביב גלגלי מנגנון, כפי שמוצג באיור 1 ג. ודא צינורות שמתאים מלבב סביב הגלגל עם מתאם המתכת במקום.
- להשיג 30 מ"ל דגימת דם באמצעות פרוטוקול שאושר IRB, בבקבוקון מלא מראש עם 2 מ"ל של ציטראט או נוגדי קרישה אחרים, ומערבבים על ידי היפוך כדי למנוע קרישת פעם אחת את הדגימה שנאספה.
- להוסיף כ 10 מ"ל של דם לכל צינור באמצעות שסתום המתכת ומזרק, והשאיר קצת אוויר בצינור. אבטח את כובע השסתום וrסוב ל3 שעות.
- מסננים את הדם לתוך מבחנה פסולת שטופלה בתמיסת אקונומיקה 10% (או כפי שנדרש על ידי מדיניות מוסדית).
- בעדינות ולשטוף פנים צינורות עם DPBS כדי להסיר כל העקבות של דם. אסוף זרימה דרך בכוס הפסולת. השלך דם בהתאם למדיניות מוסדית.
- לחטא את המכשירים וכל דם מחלקת משטחים באמצעות פתרון אקונומיקה 10% או פי מדיניות מוסדית.
- דגימות תהליך למיקרוסקופ אלקטרונים מיקרוסקופי או סריקת ניאון כפי שתתוארנה להלן.
.4 פלורסנט מיקרוסקופית וספירה תאים
- הכן פתרון paraformaldehyde 4% (PFA) (זהירות: בצע במנדף).
- דגירה צינורות ב4% פתרון PFA הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- לאחר דגירה הלילה, להסיר את PFA 4% ולשטוף סרטים מאוד בעדינות עם DPBS.
- חותך את צינורות לחלקים על מנת לחשוף את פני השטח לומן לצביעה.
- כתםסעיף של הצינור עם כמה טיפות של הרכבה תקשורת עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ל30 דקות בטמפרטורת חדר (להגן מפני אור). לאחר צביעה, יש לשטוף את צינורות בעדינות עם DPBS להפחית אות DAPI רקע.
- תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במסנן DAPI ומצלמה דיגיטלית לספור את מספר התאים ב9 שדות בצורה עיוורת שנבחרו להציג תחת הגדלה 200X.
- רשומה התא סופר לכל שדה ראיה ולבצע ניתוחים סטטיסטיים מתאימים כדי לקבוע מובהקות סטטיסטיות של תוצאות.
.5 מיקרוסקופית אלקטרונים סורק
- הכן 2% פתרון glutaraldehyde (זהירות: בצע במנדף).
- דגירה צינורות בפתרון glutaraldehyde 2% בין לילה ב 4 ° C..
- לאחר דגירה הלילה, בעדינות לשטוף 3x צינורות עם DPBS.
- הכן פתרון 1% מtetroxide אוסמיום (זהירות: סכנת משאיפת חמורה! השתמש במנדף).
- דגירה צינורות בפתרון 1% מtetroxide אוסמיום 15 דקות בטמפרטורת חדר.
- לשטוף בעדינות את 3x צינורות עם DPBS.
- הכן סדרה של ריכוזי אתנול (25%, 50%, 75%, 95%, ו100% אתנול).
- מייבש את צינורות על ידי דגירה בסדרה של ריכוזי אתנול. דגירה ב25%, 50%, 75%, ו95% אתנול ל20 דקות כל אחד. דגירה ב100% אתנול למשך 30 דקות.
- נקודה קריטית לייבש את צינורות עם CO 2 דקות 45 כדי להסיר את כל הלחות.
- חלקי צינור הר על בדל דגימה עם דבק כסף או גרפיט.
- חלקי צינור מעיל עם 12.5 ננומטר של זהב-פלדיום.
- בדוק במיקרוסקופ אלקטרונים סורק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
יצירת משטחים פולימריים תיאול-reactive באמצעות PDT-BzPh וTCEP יחד עם תיאול-reactive פולי ליזין recCD47 באמצעות SMCC מאפשרת החיבור של recCD47 למשטחים פולימריים. תהליך השינוי הוא סיכם באופן סכמטי באיור 1. הנוחות של תהליך השינוי הזה היא שהוא יכול להיות מיושם על חלבונים רבים ושונים ומשטחים פולימריים שונים, הנחה החלבון יכולה להיות שונה עם קבוצות כימי תגובתי מספיק כגון lysines ומכיל האמינים שיש לו את הפולימר פחמימנים זמינים במידה מספקת.
זה כבר הוכיח בעבר שrecCD47 יכול יצורף למשטחים פולימריים באמצעות פרוטוקול זה 11-13. כפי שניתן לראות באיור 3 א, מכתים FITC משמעותי גלוי לrecCD47, באמצעות נוגדן FITC- מצומדות לתחום תאי איג של CD47, אשר מותאם במיוחד לסרט, כפי שמוצגת על ידי ההדמיה דסק"ש(איור 3 ב). תוצאות אלו מראות כי recCD47 יכול להיות מחוברת קוולנטית לסרטי פוליאוריטן. מדידת יחידות ניאון והשוואה עם עקומת תקן שנקבע הריכוז של פני השטח הכרוך recCD47. אנחנו הראינו כי recCD47 יכול יצורף למשטחים פולימריים ברמות עולה על 500 ng / סנטימטר 2,11-13. תוצאות אלו מאשרות כי פרוטוקול שינוי זה מבוסס תיאול פולימר יכול לשמש כדי לצרף חלבונים רקומביננטי הותאם פולי ליזין למשטחים פולימריים.
CD47 הוכח להיות סמן של "עצמי", המונעת מצורף תא דלקתי והפעלת מערכת חיסונית 7-13. כדי לחקות בתנאי vivo ככל האפשר בסביבה vivo לשעבר, יכול להיות perfused דם אדם שלם דרך צינורות פולימריים ללא שינוי והותאמו במכשירי צ'נדלר Loop (שמוצג באיור 2). תא קובץ מצורף לצינורות ניתן להעריך באמצעות מכתים DAPI (
סכמטי 1 דמותו של שינוי פני שטח. ) משטחים פולימריים Thiolated נוצרו על ידי דוגרים משטח פולימרים עם crosslinker photoactivatable PDT-BzPh וההפחתה שלאחר מכן עם TCEP. B) </ Strong> SMCC שימש כדי לייצר recCD47 תיאול-reactive, שהיה אז הגיב במשטח הסינתטי thiolated להניב משטחים פונקציונליות recCD47.
איור 2 תרשים של מכשירי צ'נדלר Loop. ) המנגנון מורכב של אמבט מים מחומם ל37 מעלות צלזיוס, גלגלים מסתובבים קבועים על מוט מתכת המחובר למנוע רוטרי. זה הקים מאפשר למנוע הסיבובי כדי לסובב את הגלגלים, ובכך submersing חלקים של הצינור לתוך האמבטיה 37 ° C המים והטפטוף של דם דרך צינורות. B) מתאמי מתכת משמשים לחיבור הקצוות של צינורות ויוצרים לולאה סביב אחד מהגלגלים מסתובבים. דם נוסף לצינורות דרך יציאת שסתום המתכת והכתיר עם כובע השסתום. C) לאחר הרכבה, שסתום צינורות ומתכת צריך להתאים מלבב around הגלגל מסתובב, כפי שמוצג כאן עם צינור ריק.
איור 3 קוונטיזציה של recCD47 על סרטי פוליאוריטן. נוגדנים המכוונים נגד תחום איג החיצוני של CD47 שמשו לכמת את כמות recCD47 חייב סרטי פוליאוריטן. תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי נלקחו תחת הגדלה 200X עם מערכות סינון מתאימות מראים זיהוי FITC של recCD47 המצורף לפוליאוריטן (). תמונות (ב ') דסק"ש מראות כי אות FITC היא ספציפית לסרט פוליאוריטן.
איור הידבקות .4 סלולארי לפוליאוריטן ללא שינוי והותאם-recCD47. דם אדם שלם נאסף וperfused מעל ללא שינוי או שונה-recCD47סרטי PU עבור 3 שעות. בעקבות זלוף 3 שעות, סרטים היו שטופים עם DPBS, והתאים דבקו תוקנו עם PFA 4% לילה בשעה 4 מעלות צלזיוס וDAPI מוכתם עבור 30 דקות בטמפרטורת חדר. תאים צבעוניים DAPI נספרו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תחת הגדלה 200X ומערכות סינון מתאימות. (א) 9 שדות שנבחרו באקראי מבט נספרו עבור כל שינוי. (ב) נתונים הוא נציג של 9 שדות מבט ובאו לידי ביטוי כממוצע שגיאה סטנדרטית ± (p = 0.004).
איור 5 ניתוח SEM של recCD47 שונה ומשטחי השליטה הבאים ניתוח ex vivo. דם אדם שלם נאסף וperfused מעל צינורות PVC ללא שינוי או שונה-recCD47 ל3 שעות. נציג תמונות להראות מצורף תא משמעותי לunmodifiעורך משטחים בעוד משטחים שונה-recCD47 להראות רק תא מצורף מדי פעם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הכימיה photoactivation (המסוכמת באיור 1) מאפשרת לשינוי של כל משטח כמעט פולימר שיש פחמימנים מספיק כדי להקל על התקשרות PDT-BzPh וקרינת UV לאחר צילום להפעיל PDT-BzPh. Functionalizing משטח פולימרים עם קבוצות תיאול תגובתי מאפשר לקובץ המצורף שלאחר מכן של מגוון רחב של מולקולות הניתנות לבדיקה של עניין. במחקרים מסוימים שלנו בחרנו רקומביננטי CD47 11-13. הכימיה נטיה המסוימת שהשתמשנו בי מעורבת התגובה של הקבוצות האמינים של החלבון עם מקשר צלב bifunctional SMCC 11-13. זה סיפק recCD47 תיאול-reactive לתגובה שלאחר מכן עם משטח פולימרי thiolated. המוצר הסופי היה הצמדה מונו גופרתי קוולנטית מחייבת recCD47 לפולימר. כדי להבטיח שהקבוצות האמינים מחומצות אמינו בCD47 לא בשימוש לתגובה, ובכך מקלים את היעילותשל CD47 המשותק, אנחנו שונה יותר recCD47 ידי הוספת תג פולי ליזין בחלבון C-הסופי. זה יהיה אפשרי שאסטרטגיה מולקולרית דומה ניתן ליישם עם חלבונים אחרים. כך הכימיה נטיה שהוצגה כאן ובמקומות אחרים 11-13 מספק הזדמנות חשובה כדי להעריך את היכולת של מולקולות פוטנציאליות טיפוליות להעניק biocompatibility על משטחים סינטטיים.
חסרון לפרוטוקול זה הוא שחשיפה לסוגים מסוימים של פולימרים, כגון פוליאוריטן, לתקופות ממושכות של קרינת UV יכולה לגרום לשינוי צבע. זה יכול להימנע על ידי הצבת הפולימר במנות פוליסטירן (נפוצה בתרבית רקמה), כדי למנוע שינוי צבע של הפולימר ללא מפריע photoactivation של PDT-BzPh. אורך הגל של אור UV שימוש בפרוטוקול זה הוא 302 ננומטר; חריגה מאורך גל זה יכול לגרום לתמונה-הפעלה לא יעילה של PDT-BzPh. אם אתם משתמשים באורך גל של שונהאור UV, אופטימיזציה של זמן חשיפה לקרינת UV יש צורך להבטיח צילום הפעלה משמעותית.
בעקבות פרוטוקול זה מאפשר לקובץ המצורף של recCD47 למשטחים פולימריים, לצורך התחמקות חיסונית ומצב "עצמי" מעביר למשטח פולימרים כדי למנוע תגובת הגוף הזרה. כימות recCD47 צירפו אל פני השטח הושלמה באמצעות נוגדן שכותרתו FITC לתחום איג של CD47 באמצעות immunoassay ומיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 3). מתודולוגיה זו יכולה להיות מותאמת לחלבונים אחרים שצורפו למשטחים פולימריים בהנחה זמינות נוגדן. כישלון בהשגת תוספת משמעותית של recCD47 (או חלבון אחר) יכול להיות בגלל מגוון גורמים, כולל, אי photoactivate PDT-BzPh, פחמימנים חופשיים מספיק על פני השטח הפולימר, הידרופוביות של פני השטח פולימר, או הפולימר יכול להיות עבה מדי או אטום כדי לאפשר לאור לעבור לquantific ההולםני. כל אחד מהמשתנים הללו ניתן לבדוק באופן ניסויי ומותאם במיוחד לפולימר מסוים.
מכשירי צ'נדלר Loop הוא כלי ייחודי לניתוח vivo לשעבר של חשיפת דם אדם שלמה למשטחים פולימריים. מערכת זו דומה מאוד לטפטוף של דם דרך צינורות דם קליניים בשימוש בפרוצדורות רפואיות שונות, המאפשרת הניתוח של נקודות קצה פיסיולוגיות רבות הקשורים למשטחי פנייה דם. כנקודתי קצה פיסיולוגיות לתוספת של recCD47 למשטחים פולימריים, ספירת תאים באמצעות מכתים DAPI (איור 4) ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (איור 5) היו בשימוש. יכולים לשמש גם נקודות קצה אחרות, בהתאם לזמינות ציוד, למשל, ספירת תאים לפני ואחרי זלוף הדם דרך צינורות דם פולימרים יכולים לשמש גם. משטחים ללא קשר, הותאם-recCD47 הציגו באופן משמעותי תאים פחות דבקים בהשוואה למשטחי שליטה ללא שינוי. דה ואלהת"א מצביעה על כך שrecCD47 מעביר biocompatibility למשטחים פולימריים ועלול לשמש כדי למנוע FBR בהליכים קליניים באמצעות צינורות דם פולימריים.
למרות זאת הוא בשימוש נרחב במודל חוץ גופית ללימודי זלוף הדם, היא מוגבלת במובנים מסוימים. שני החסרונות העיקריים של שיטה זו נובעים מהדרישה לכלול אוויר בצינור עם דגימת הדם. האינטראקציה הדם תכופה עם אוויר יכולה לגרום ליקוציט והצטברות טסיות דם והחלבון denaturation 16-18, שעלול להפריע לנקודתי קצה מסוימים. שנית, האוויר נשאר בנקודה הגבוהה ביותר במעגל, המגביל את שיעור זרימת דם 19. למרות המגבלות ברורות של שיטה זו, זה גורם פחות נזק דם מאשר שיטות מתחרות 19 ומשמש כדרך של הקרנת biocompatibility של מולקולות ביולוגיות פוטנציאליות על צינורות דם פולימריים. ברגע שמזוהים מולקולות ביולוגיות מועמד דרךבשיטה זו, ניתן להשיג ניתוח נוסף באמצעות מודלים של בעלי החיים in vivo. סופו של דבר, ההתאמה הביולוגית של פולימרים שונה צריכה להיות מאושרת על שימוש מתאים במערכת מודל vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחקר המדווח בפרסום זה נתמכה על ידי המכון הלאומי ליו הדמיה וההנדסה ביוטכנולוגיה, תחת מספר הפרסים R21 EB015612 (SJS), והלאומי ללב, ריאות ודם מכון, תחת מספר הפרסים T32 HL007915 (JBS וRJL), של הלאומי מכון לבריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Scientific | 58906 | Caution! Use in fume hood |
| 25% Glutaraldehyde | VWR | AAA17876-AP | Caution! Use in fume hood |
| 2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH) | Synthesized in lab | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059-100G | |
| Citrate | Sigma | S5770-50ML | |
| Digital Camera | Leica | DC500 | Out of production |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547-100ML | Caution! Use in fume hood |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco/Life Technologies | 14190-136 | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TE300 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | Caution! Use in fume hood |
| Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-12730 | |
| Osmium Tetroxide | Acros Organics | 197450050 | Caution! Use in fume hood |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3) | Sigma | 237205-100G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655-100G | |
| PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit) | Terumo Cardiovascular Systems | 60050 | Most clinical-grade tubing will work |
| Scanning Electron Microscope | JEOL | JSM-T330A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | Spectramax Gemini EM | |
| Sulfo-SMCC | Sigma | M6035-10MG | Moisture Sensitive! |
| tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531 | |
| Vectashield with DAPI | Fisher Scientific | H-1200 | Light sensitive! |
| Zeba Spin Desalt Columns – 7 K MWCO | Thermo Scientific | 89891 |
References
- Bruck, S. D. Medical applications of polymeric materials. Med. Prog. Technol. 9 (1), 1-16 (1982).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin. Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Levy, J. H., Tanaka, K. A. Inflammatory response to cardiopulmonary bypass. Ann. Thorac. Surg. 75, S715-S720 (2003).
- Sperling, C., Maitz, M. F., Talkenberger, S., Gouzy, M. F., Groth, T., Werner, C. In vitro blood reactivity to hydroxylated and non-hydroxylated polymer surfaces. Biomaterials. 28, 3617-3625 (2007).
- Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups. Biomaterials. 26, 6547-6457 (2005).
- Vasita, R., Shanmugam, I. K., Katt, D. S. Improved biomaterials for tissue engineering applications: surface modification of polymers. Curr. Top. Med. Chem. 8, 341-353 (2008).
- Subramanian, S., Parthasarathy, R., Sen, S., Boder, E. T., Discher, D. E. Species- and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPalpha. Blood. 107 (6), 2548-2556 (2006).
- Tsai, R. K., Discher, D. E. Inhibition of 'self' engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells. J Cell Biol. 180 (5), 989-1003 (2008).
- Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends Immunol. 29 (5), 203-206 (2008).
- Oldenborg, P. A., Zheleznyak, A., Fang, Y. F., Lagenaur, C. F., Gresham, H. D., Lindberg, F. P. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2001).
- Finley, M. J., Rauva, L., Alferiev, I. S., Weisel, J. W., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33, 5803-5811 (2012).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34, 8640-8649 (2013).
- Ravetch, J. V., Lanier, L. L. Immune inhibitory receptors. Science. 290, 84-89 (2000).
- Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of blood: a method for producing a thrombus. Lab Invest. 7, 110-114 (1958).
- Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea Hyperb Med. 20 (2), 101-119 (1993).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platlet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. Intl J of Legal Med. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., Fainerman, V. B., Wüstneck, R., Krägel, J., Trukhin, D. V. Characterization of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A. 131 (1-3), 225-230 (1998).
- Oeveren, W. V., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. Int J Biomater. 2012, (2012).
