Abstract
合成表面は、身体に導入されたときに異物反応が起こる。これは、術後の合併症につながる、血液タンパク質の吸着および血小板の付着およびそれに続く活性化、単球/マクロファージの接着性、および炎症性細胞シグナル伝達事象によって特徴付けられる。チャンドラーループ装置は、研究者が、血液の大量のは、ポリマーの導管を介して灌流されているときに発生する分子や細胞間相互作用を研究することを可能にする実験的なシステムです。そのために、この装置は、各種高分子表面修飾の抗炎症特性の評価を可能にex vivoでのモデルとして使用されてきた。当研究室では、共有結合した組換えCD47と光活性化化学により修正された血液導管は、ポリマー表面に生体適合性を付与することができることが示されている。ポリマー表面にCD47を付加することは、ポリマーの血液導管の有効性を促進するための有効な手段である可能性があります。彼女のEINはCD47修正されたと制御導管と血液の相互作用を調べるために臨床的に関連性ポリマー血液導管および ex vivo実験モデルとしてチャンドラーループの使用に組換えCD47を追加するために使用される光活性化化学を詳細に方法論である。
Introduction
そのような人工心肺や腎臓透析などの多くの臨床手順は、ポリマー血液導管の使用を必要とし、多くの場合、術後の合併症1に関連している。血液で灌流すると、これらのポリマーは血液タンパク質および血小板、単球/マクロファージ付着の吸着、その結果、異物反応（FBR）を誘発（illicit）、および、術後の合併症に寄与する全てが炎症誘発性サイトカインの放出/またはデバイスの故障2,3。したがって、この問題に対処するための戦略は、生体材料研究の重要かつ継続的な地域のまま。研究者らは、生体活性または生体不活性分子を4-6と表面を接触させること、血液を変更することによってこの問題に対処しようと試みてきた。私たちの研究室での研究は、FBRを軽減し、これらの材料の有効性を高めるための戦略として、高分子生体材料への組換えCD47（recCD47）を追加に焦点を当てている。 CD47は遍在的に発現transmembrです細胞7-10やショーを表現する際の免疫回避の既知の役割、付与「自己」ステータスを持つメタンタンパク質がポリマー表面11-13に付加するとき、生体適合性を付与するに約束します。シグナル調節タンパク質α（SIRPα）、CD47のための同族受容体、および膜貫通タンパク質のファミリーを含有免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ITIM）のメンバーは、骨髄起源14の細胞に発現しています。私たちは、以前にCD47は、SIRPαを介した細胞シグナリングを介して、 インビトロ 、 エキソビボでポリウレタン（PU）、およびポリ塩化ビニル（PVC）に対する免疫応答を下方制御、およびin vivoモデル 11-13 にすることを実証した。
私たちの研究の中心は化学的に反応性のチオール基が共有結合多官能性ポリマー（PDT-BZでチューブを反応させることによって、ポリマーのチューブに追加された、本明細書に記載され、比較的小説光活性化化学で2 -ピリジルジチオ（PDT）から成る）Phは、光反応性ベンゾフェノン（BzPh）とカルボキシ変性ポリアリルアミン11-13。トリス（2 -カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP）11と共有結合的に付加さPDT基を還元すると、続いて治療的部分と反応させることができるチオール化表面が得られる。本明細書に詳述以前12,13、さらなるC末端のポリ-リジン尾部12,13の添加によって修飾されrecCD47は、スルホスクシンイミジル-4 - [N -maleimidomethyl]シクロヘキサン-1カルボキシレート（スルホ-SMCC）と反応させて1時間チューブとrecCD47 11との間のモノスルフィド結合形成を可能にする、チオール反応性基を生成する。 CD47官能化された表面の抗炎症能力がもともと血栓凝固15 のin vitroモデルとして1958年に記載されたヒト全血、チャンドラーループ装置を使用して、 元VIV O、試験した。この装置は、に依存していますチューブ部分的に空気を充填システムとチューブ15に血液を循環させる回転モータを閉じた。この実験モデルは、修飾および非修飾表面の際に血液暴露の影響、ならびに血液の細胞の生理時にこれらの表面修飾の効果を検討する機会を提供する。
recCD47は、この光活性化化学を用いてポリマー表面の多様に付加することができ、その抗炎症能力は、ポリマー表面11,12の上に血液灌流を模倣する臨床的に関連エキソビボモデルを利用することによって評価することができる。 recCD47で修飾された臨床グレードの血液導管は、装置内のヒト血液にさらされたときに、未修飾ポリマーと比較して有意に低い血小板および炎症細胞の付着を示す。この変形プロセスのステップバイステップの説明は、以下に詳述する。
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Protocol
recCD47 1.変更高分子表面
注：プロトコルは、図1に概略的に要約されているが、 図1Aは、チオール反応性ポリマー表面の生成を示す図1Bは、チオール反応性recCD47の生成を示す。
- 1日目
- 滅菌水中PDT-BzPhの溶液（1 mg / ml）で、および重炭酸カリウム（KHCO 3）（0.7 mg / mlで）を調製。 4℃（ 光から保護する ）で一晩撹拌する。
- 2日目
- （回転車輪の周りにフィットするのに十分な長）長さ40cmの片に、ポリマーチューブをカットします。
- シェーカー上またはチャンドラーループ装置上で室温で90分間hexacylpyridiniumの0.1％水溶液中でチューブを浸す。 90分浸した後、滅菌水で3回でチューブを洗浄します。
- （15％水性リン酸二水素カリウムを添加することにより、1日目からPDT-BzPhの溶液を酸性KH 2 4）。曇ったミセル溶液を形成し、PDT-BzPhの1ml当たり50μlのKH 2 PO 4を追加します。
- シェーカー上又は装置上で室温で40分間、酸性化PDT-BzPh溶液中にチューブを浸す。
- 一度：希酢酸（千1）で管を洗浄します。
- 60分の合計時間のための紫外線照射にチューブを公開します。チューブを回転させて¼表面領域全体を照射するために15分毎に回す。
- シェーカー上又は装置上で室温で20分間、20 mg / mlの炭酸水素カリウム（KHCO 3）の溶液中にチューブを浸す。
- 滅菌水で4℃で滅菌水の3倍と店舗との管を洗浄します。
- 3日目
- （：ドラフト内で実行します。注意 ）200μlのジメチルホルムアミド（DMF）中に5mgのスルホSMCCを溶かす。
- recCD47のポリリジン溶液をステップ1から0.1 mg / mlの中で調製スルホSMCC溶液50μlを追加し、ROで60分間攪拌オム温度。
- 60分攪拌中に、ドガはダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）を無菌で、取っておく。
- 浄化スルホ-SMCCは、製造業者の説明書に従って7K分子量カットオフスピン脱塩カラムを使用してrecCD47を反応させた。最終的なフロースルー（高品質のチオール反応recCD47）を収集し、コートDPBSでチューブの内部に必要な容量まで希釈する。
- 無菌で2日目からのチューブを洗浄し、DPBS 3倍を脱気。
- 以下で2分間、脱気DPBS中の20 mg / mlのとトリス（2 - カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP）の溶液をチューブの表面修飾反応する。無菌脱気DPBS 4倍で管を洗浄します。
- チューブにスルホSMCC反応recCD47を追加し、シェーカー上または装置上で4℃で一晩インキュベートする。
修飾された表面上のrecCD47 0002イムノアッセイ定量
- 3日目ウィットから定量化するように変更さのチューブをすすぐ時間DPBS 3倍。店舗チューブは4℃で、DPBSで定量化のために使用されていません。
- 重複チューブサンプルを作成し、96ウェルプレートのウェル中の生検パンチを配置し4mmの生検パンチを使用する。
- 検出抗体で処理されていない未修正のチューブサンプルからなるネガティブコントロールを準備します。検出抗体で処理された未修正のチューブサンプルからなる抗体コントロールを準備します。検出抗体で処理された修飾されたチューブ試験サンプルを調製する。
- シェーカー上で室温で60分間、DPBS中の0.4％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロック·サンプル。
- 、吸引BSAをブロッキングした後、トリス緩衝生理食塩水を加えた1％のTween-20（TBST）シェーカー上で3倍、10分ごとに洗い流してください。
- 免疫アッセイのための製造業者の推奨希釈率に応じて、0.4％BSA中での抗体の使用希釈を準備します。ヒトCD47抗体B6H12-FITC 1に希釈する：0.4％BSA中100。
- 適切なウェルに抗体希釈液200μlを追加します。 Incubaわずか0.4％BSAを含むTEネガティブコントロール。 （ 光から保護する ）シェーカー上で60分間室温でインキュベートする。
- TBSTで3回、シェーカー上で10分間ずつで洗い流してください。最後TBSTリンスを吸引し、チューブのサンプルウェルに200μlのDPBSを追加。
- 最終的なフロースルー、高品質なチオール反応性の組換えCD47をある収集し、コートDPBSでチューブの内部に必要な容量まで希釈する。
- FITC励起（485 nm）を発光（538 nm）の設定で、マイクロプレートリーダーを用いて、FITCシグナル強度をお読みください。
- 計算recCD47は、自己蛍光および非特異的抗体対照試料からの結合を占め、標準値に基づいて、ポリマー表面に結合した。
3チャンドラーループ装置プロトコル
採血プロトコル前ヒト血液サンプルの収集の開始にインフォームドコンセントの書類の治験審査委員会（IRB）の承認を受けてください。情報を入手rmedヒト血液ドナーの同意。
注：装置の説明図が図2に示されている。
- 約1/2車輪が水没している直径になるまで蒸留水で水浴を埋める。 10％の漂白剤溶液を作るために、水浴に十分な漂白剤を追加します。 37℃に水浴を設定し、温度が平衡化させる。
- 金属アダプタ（ 図1Bに示されている）、非修飾および修飾チューブチューブを収集し、 図1Cに示すように、装置のホイールの周りに組み立てる。チューブが所定の位置に金属製のアダプタを備えている車輪の周りにぴったりとフィットしていることを確認してください。
- クエン酸塩、または他の抗凝固剤の2ミリリットルを予め充填したバイアル中、IRBが承認したプロトコルを使用して、30ミリリットルの血液サンプルを入手し、検体が収集された後、凝固防止するために、転倒混和。
- チューブ内のいくつかの空気を残して、金属バルブとシリンジを使用して、各チューブへの血液の約10ミリリットルを追加します。バルブキャップとrを固定します3時間otate。
- 10％の漂白剤溶液で処理された廃棄物のビーカーに血液を排出（または施設の方針によって必要とされるような）。
- 静かに、血液の痕跡をすべて削除するDPBSで配管内部を洗浄します。フロースルー廃棄物のビーカー内を収集します。制度的方針に基づき、血液廃棄してください。
- 装置および任意の血液の10％漂白剤溶液を用いて、接触面または施設のポリシーに応じて駆除。
- 蛍光顕微鏡または走査型電子顕微鏡のための処理サンプルは、下記のように。
4。蛍光顕微鏡および細胞計数
- 4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液（ 注意：ドラフト内で実行します ）を準備します。
- 4℃で一晩4％PFA溶液中でチューブをインキュベートする。
- 一晩インキュベートした後、4％PFAを削除し、DPBSで非常に優しくフィルムをすすぐ。
- 染色のために内腔面を露出するセクションにチューブをカットします。
- 染み室温で30分間、4 '、6 -ジアミジノ-2 -フェニルインドール（DAPI）でメディアを装着する数滴のチューブ部（ 光から保護 ）。染色した後、バックグラウンドDAPIシグナルを減らすためにDPBSで非常に優しくチューブをすすいでください。
- 200X倍率の下で見ると9盲目的選択されたフィールド内のセルの数をカウントするためにDAPIフィルタとデジタルカメラを装備した蛍光顕微鏡を用いた画像。
- レコードのセルは、視野当たりのカウントし、結果の統計的有意性を決定するために、適切な統計分析を行う。
5。走査型電子顕微鏡
- 2％グルタルアルデヒド溶液（ 注意：ドラフト内で実行します ）を準備します。
- 4℃で一晩、2％グルタルアルデヒド溶液中でチューブをインキュベートする。
- 一晩のインキュベーションの後、静かにDPBSでチューブ3回すすいでください。
- 四酸化オスミウムの1％溶液を準備します（ 注意：重度吸入の危険性！ ）ドラフト内で使用してください。
- 室温で15分間、四酸化オスミウムの1％溶液中でチューブをインキュベートする。
- 静かにDPBSでチューブ3回すすいでください。
- エタノール濃度のシリーズ（25％、50％、75％、95％、および100％エタノール）を調製。
- エタノール濃度の一連のインキュベーションによりチューブを脱水。 25％、50％、75％、20分ごとに、95％エタノール中でインキュベートする。 30分間、100％エタノール中でインキュベートする。
- 臨界点は、すべての水分を除去するために45分間CO 2を有するチューブを乾燥させる。
- 銀ペーストまたはグラファイトで試料スタブ上のマウントチューブセクション。
- 金 - パラジウムの12.5 nmのとコートチューブセクション。
- 走査型電子顕微鏡で調べます。
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Representative Results
SMCCを用いて、チオール反応recCD47のポリリジンと一緒にPDT-BzPhおよびTCEPを使用することにより、チオール反応性高分子表面の生成は、ポリマー表面にrecCD47の取り付けが可能になります。修正処理は、 図1に概略的にまとめられている。この変更処理の利便性タンパク質は、アミン含有リジンのような十分な化学的反応基で修飾することができると仮定すると、それは多くの異なるタンパク質、多くの異なるポリマー表面に適用することが可能であるとポリマーが十分に使用可能な炭化水素を有している。
それはrecCD47このプロトコル11-13を用いてポリマー表面に付加することができることが以前に実証されている。 図3Aに示されるように、有意なFITC染色はDIC画像で示すように膜に特異的に局在化されるCD47の細胞外IgドメインにFITC結合抗体を用いて、recCD47することも可能である（ 図3B）。これらの結果は、recCD47が共有ポリウレタンフィルムに結合させることができることを示している。蛍光単位を測定し、標準曲線と比較することは、表面に結合したrecCD47の濃度を決定した。私たちは、recCD47 500 ngの/ cmで2,11-13を超えたレベルでポリマー表面に付加することができることを示した。これらの結果は、このチオール系ポリマー修飾プロトコルはポリマー表面にポリ - リジン修飾された組換えタンパク質を付加するために使用することができることを確認する。
CD47は、炎症性細胞の付着および免疫系の活性化7-13を予防する」、自己」のマーカーであることが示されている。 ex vivoでの設定で可能な限り厳密に、生体内の状態に模倣するために、ヒト全血がチャンドラーループ装置における非修飾および変更されたポリマーチューブを通して灌流することができる（ 図2参照）。チューブへの細胞接着は、（DAPI染色によって評価することができる
表面改質の図1の回路図。 A）チオール化ポリマー表面は、光活性化架橋剤PDT-BzPhおよびTCEPを用いたその後の減少と高分子表面をインキュベートすることによって生成した。B）</ strong>のSMCCは、その後recCD47官能化表面を得るために、合成チオール化表面と反応させて、チオール反応性recCD47を製造した。
チャンドラーループ装置の2ダイアグラム図。 A）この装置は、回転モータに取り付けられた金属製ポールに固定された車輪を回転させ、37℃に加熱した水浴で構成されています。これはセットアップすることにより、チューブを通る血液の37℃の水槽や灌流への管の一部を沈めると、車輪を回転させる回転モータを可能にします。B）金属のアダプタがループを形成するチューブの両端を接続するために使用されている回転車輪の1の周り。血液は、金属バルブポートを介してチューブに加え、バルブキャップでキャップされている。C）が組み立てられると、チューブと金属弁がぴったりとフィットアルべき空のチューブを用いて以下に示すように、回転ホイールをound。
ポリウレタンフィルム上recCD47の3量子図 。 CD47の外Igドメインに対する抗体は、ポリウレタンフィルムに結合したrecCD47の量を定量するために使用された。 recCD47のFITC検出を示す適切なフィルターセットを200X倍率で撮影した蛍光顕微鏡画像は、ポリウレタン（A）に追加。 （B）DIC画像は、FITC信号がポリウレタンフィルムに特異的であることを示している。
非修飾およびrecCD47変性ポリウレタンに、図4の細胞接着 。ヒト全血を採取し、上で灌流した非修飾またはrecCD47が修飾された3時間のPUフィルム。 3時間の灌流後、フィルムをDPBSですすぎ、そして付着した細胞を4℃で一晩、4％PFAで固定し、DAPIを室温で30分間染色した。 DAPI-染色された細胞を200倍の倍率と適切なフィルターセットの下で蛍光顕微鏡を用いて計数した。ビューの（A）9ランダムに選択されたフィールドは、各修正を計数した。 （B）データビューの9の視野の代表であり、平均値±標準誤差た（p = 0.004）のように表される。
recCD47図5のSEM分析は、変更されたと制御面は、ex vivo分析を以下 。ヒト全血を採取し、3時間非修飾またはrecCD47で修飾されたPVCチューブ上で灌流した。代表的な画像をunmodifiに重要な細胞接着を示しているrecCD47で修飾された表面は時折添付セルを表示しながら、表面を編
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Discussion
（ 図1に要約する）光活性化化学は、光活性化PDT-BzPhをするPDT-BzPhの付着およびそれに続くUV照射を容易にするために十分な炭化水素を有する実質的に任意のポリマー表面の改質を可能にする。反応性チオール基を有するポリマー表面を官能することは興味のある検証可能な分子の範囲のその後の取り付けを可能にします。私たちの特定の研究において、本発明者らは、組換えCD47 11-13を選びました。私たちは、使用される特定のコンジュゲーション化学は、二官能性架橋剤SMCC 11-13を有するタンパク質のアミン基との反応を含んだ。これは、チオール化ポリマー表面との反応のためのチオール反応recCD47を提供した。最終生成物は、ポリマーに共有結合recCD47モノスルフィド結合であった。 CD47中のアミノ酸のアミン基が反応に使用されていなかったことを保証する助け、それによって有効性を軽減するために、固定化されたCD47の、私たちはさらに、タンパク質のC末端にポリ - リジンタグを挿入することによりrecCD47を変更しました。これは、同様の分子戦略が他のタンパク質と適用可能であることが可能であろう。したがって、ここで提示され、他の場所11-13コンジュゲーション化学合成表面上に生体適合性を付与する可能性のある治療用分子の能力を評価するための重要な機会を提供する。
このプロトコルの欠点は、UV照射の長期間に、ポリウレタンのようなポリマーの特定の種類を露出する変色をもたらすことができることである。これはPDT-BzPhの光活性化を妨げることなく、ポリマーの変色を防止するために、（一般的に組織培養に使用される）のポリスチレン皿中にポリマーを配置することによって回避することができる。このプロトコルで使用されるUV光の波長は302 nmである。この波長からのずれがPDT-BzPhの非効率的な光活性化をもたらす可能性がある。の異なる波長を使用している場合UV光は、UV照射時間の最適化は、かなりの光活性化を確保する必要がある。
このプロトコルは、以下の免疫回避及び異物反応を防止するために、ポリマー表面に「自己」状態を伝達する目的のため、ポリマー表面にrecCD47の付着を可能にする。表面に付加recCD47の定量化は、免疫測定法、蛍光顕微鏡法（ 図3）を使用して、CD47のIgドメインにFITC標識抗体を使用して完成する。この方法は、抗体の可用性を想定してポリマー表面に付加された他のタンパク質に適合させることができる。 recCD47（または他のタンパク質）の重要な付属物を得るための障害がPDT-BzPhを光活性化に失敗し、ポリマー表面に十分な空き炭化水素、ポリマー表面の疎水性を含むさまざまな要因により、可能性、またはポリマーが厚すぎるかもしれないか光が十分なquantificのために通過することを可能にするために、不透明ation。これらの変数のすべては、実験的に試験し、特定のポリマーのために最適化することができる。
チャンドラーループ装置は、ポリマー表面へのヒト全血液暴露のex vivo分析のためのユニークなツールです。このシステムは、密接に血液接触面に関連する多くの生理学的エンドポイントの分析を可能にする、さまざまな医療処置に使用される臨床血液導管を通る血液の灌流に似ている。ポリマー表面へrecCD47の付属物のための生理学的エンドポイントとして、DAPI染色（ 図4）および走査電子顕微鏡法（ 図5）を用いて細胞計数を用いた。他のエンドポイントは、ポリマー血液導管を通して血液灌流前後の細胞数を使用することもできる、例えば、機器の可用性に応じて、使用することができる。それにもかかわらず、recCD47が修飾された表面は、変更されていないコントロールサーフェスと比較して有意に少ない接着した細胞を示した。これらのダtaはrecCD47がポリマー表面に生体適合性を伝え、潜在的に、ポリマーの血液導管を用いた臨床手順でFBRを防止するために使用することができることを示唆している。
これは広く血液灌流研究のためのin vitroモデルで使用されるが、それはいくつかの点で制限されている。この方法の2つの主要な欠点は、血液サンプルをチューブ内の空気を含むことを要件から生じる。空気との頻繁な血液の相互作用は、特定のエンドポイントを妨害する可能性の白血球と血小板凝集とタンパク質の変性16-18を引き起こす可能性があります。第二に、空気が血液循環19の速度を制限し、回路の最高点のままである。この方法の明らかな制限があるにもかかわらず、それが競合する方法19未満の血液損傷を誘発し、ポリマー性血液導管の電位の生体分子の生体適合性をスクリーニングする方法として機能します。候補生体分子はを通して識別されるとこの方法は、さらなる分析は、 インビボ動物モデルによって得ることができる。最終的に、変性されたポリマーの生体適合性は、in vivoモデル系における適切なを使用して確認する必要がある。
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Disclosures
この刊行物で報告された研究は、ナショナルの、受賞番号T32 HL007915（JBSとRJL）の下で、受賞番号R21 EB015612（SJS）、国立心肺血液研究所の下で医学と生物工学、総合研究所によってサポートされていました保健研究所。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Scientific | 58906 | Caution! Use in fume hood |
| 25% Glutaraldehyde | VWR | AAA17876-AP | Caution! Use in fume hood |
| 2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH) | Synthesized in lab | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059-100G | |
| Citrate | Sigma | S5770-50ML | |
| Digital Camera | Leica | DC500 | Out of production |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547-100ML | Caution! Use in fume hood |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco/Life Technologies | 14190-136 | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TE300 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | Caution! Use in fume hood |
| Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-12730 | |
| Osmium Tetroxide | Acros Organics | 197450050 | Caution! Use in fume hood |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3) | Sigma | 237205-100G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655-100G | |
| PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit) | Terumo Cardiovascular Systems | 60050 | Most clinical-grade tubing will work |
| Scanning Electron Microscope | JEOL | JSM-T330A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | Spectramax Gemini EM | |
| Sulfo-SMCC | Sigma | M6035-10MG | Moisture Sensitive! |
| tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531 | |
| Vectashield with DAPI | Fisher Scientific | H-1200 | Light sensitive! |
| Zeba Spin Desalt Columns – 7 K MWCO | Thermo Scientific | 89891 |
References
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