Introduction
肺炎球菌 、鼻咽頭の多菌コミュニティの共通の植民は、細菌によって生産抗菌ペプチド（バクテリオシン）の産生を介して他の肺炎球菌や近縁種と競合することができます。今日までに調べすべて完全に配列決定肺炎球菌株は、B acteriocin- リットル IKE のp eptide座、BLPのバージョンが含まれています。肺炎球菌によるバクテリオシン産生は、 インビトロおよびインビボの競争1-4 の両方の結果に重要であることが実証されている。競争のダイナミクスは、特定のペプチドフェロモンに反応して同族の免疫タンパク質とともに多様なバクテリオシンの発現により影響を受ける。 BLP座の誘導は、ペプチドフェロモン、BLPCは、センサーキナーゼ、BlpHに結合し、その結果シグナル伝達カスケードを開始するクオラムセンシングシステムによって制御されているBLP軌跡5,6の転写。 BLPCの4対立遺伝子変異その同族BlpH 6にそれぞれ結合することがあります。細胞がそれ自身のバクテリオシンの効果を生き残るためには、同族の免疫タンパク質をコードする遺伝子は、バクテリオシン遺伝子のそれぞれと同じオペロン上に転写される。株は保護のために必要な特定の免疫遺伝子を欠いている場合は、競合他社の株は、外因性フェロモンに反応してBLP軌跡を上方制御することができない場合、または殺害が発生します。トランスポーター複合体、BlpABは、ペプチドフェロモンとバクテリオシンペプチド2,4の分泌および処理するために必要です。最近では、肺炎球菌株の大部分は、彼らは彼らができないフェロモン及びバクテリオ1,2を分泌するレンダリングblpA遺伝子における保存された変異を有する意味する「詐欺師」であることが示されている。これらの株は、いななきが分泌する外因BLPC 2に応答することができる免疫タンパク質の産生を可能にする退屈な菌株。
清からのバクテリオシンの、粗調製物は、純度を達成するために、生化学的方法のステップを使用して産生株から調製することができるが、この手法は、単離物の大規模なコレクションをスクリーニングするために有用ではないとバクテリオシンの発現のレベルは、ブロス増殖させた培養物において低い場合2,7- 9。オーバーレイアッセイは、インビトロで存在し得る菌株間の競合力学を調査するために迅速な方法として使用される。これを行うには、肺炎球菌株は、予め接種寒天プレートの上およびBLP座の誘導に十分なローカルの細菌濃度を達成するように成長させている。第二株を、次いで、感度をテストするための事前接種菌株の上に塗布される溶融ソフトアガー溶液中に接種する。 BLP軌跡（阻害活性とは無関係）の活性のために評価するために、株は番目の一連の重ねることができるリーは以前BLPCのレポーター株を記載した。これらの株は肺炎球菌により分泌される最も一般的な3つのBLPCフェロモンに反応する三つの異なるblpH対立遺伝子のいずれかを含むように構築された。レポーター株はBlpH依存性プロモーターの制御下にあり、自己刺激10,11を防止BLPC遺伝子における欠失を運ぶ統合されたlacZ遺伝子を有している。
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Protocol
産生株の作製
- ストリーク肺炎球菌株は、-80°Cの冷凍庫ストックから5％ヒツジ血液をトリプシン大豆寒天プレート上バクテリオシン産生について試験される。
NOTE：阻害について試験されるべき株の初期成長のための血液プレートの使用が大幅アッセイの再現性を増大させる。成長条件は、特定の生物のために修正する必要があるかもしれないが、また、バクテリオシンを産生する他の非肺炎球菌株を使用することができる。私たちは、成功したオーバーレイアッセイでストレプトコッカス·ミティス及びラクトコッカス·ラクティスを使用している。 - 5％CO 2で37℃で一晩プレート（O / N）でインキュベートする。
- プロデューサー株のインキュベーション後、TSAの25ミリリットルを含有するプレート上にカタラーゼの3,000〜4,000台をピペッティングすることによりトリプシン大豆寒天（TSA）プレートを用意し、滅菌ガラスビーズを用いてカタラーゼ液を広げた。下に約10分間、プレートの乾燥をしましょう生物学的安全キャビネット。
- ピペットチップ上に細菌の可視量を収集する。乾燥したTSAプレートにピペットチップを刺す。
注：複数の産生株は、単一のTSAプレートに刺したことができます。結果のハローが重ならないように、それはスタブアウトスペースに重要です。- 可能であれば、陽性対照及び陰性対照としてオーバーレイで使用される菌株として知られているバクテリオシンプロデューサーが含まれています。
注：正および負の対照は、以前に公開されているで、リクエスト10を承ります。
- 可能であれば、陽性対照及び陰性対照としてオーバーレイで使用される菌株として知られているバクテリオシンプロデューサーが含まれています。
- 6時間、5％のCO 2、37℃で、複数のスタブを含むTSAプレートをインキュベートする。
2オーバーレイ株のグリセロールストックを作る
- オーバーレイアッセイの日に先立って（グリセロールを添加した後、中期指数期まで増殖させ、その後、-80℃で保存した培養物）グリセロールストックを準備します。肺炎球菌strの5-10コロニーを接種するアインは、0.5％酵母抽出物（THY）とトッドヒューイット培地中の感受性またはフェロモン分泌について試験される。
注：BLPC誘導性レポーターの構築は、以前に2に記載されていると株はリクエストを承ります。 - 振盪せずに37℃の水浴中に密閉蓋つきTHY 5mlでガラス管中5-10コロニーをインキュベートする。
- 彼らは0.5にOD 0.3の620に到達するまで37℃で培養をインキュベートする。
注：これは使用した株に依存して、約4〜5時間かかります。- 静かにチューブを外径を測定する前に、数回転倒。
- 実験は、同じ日に行うことができないか、株はグリセロールストックを作成し、後日実験を再開、将来的には複数回使用する場合。グリセロールストックの場合、20％の最終濃度に培養液にグリセロールを追加します。 -80℃で1.5 mlマイクロチューブやストアに分注し培養。注：サンプルは、sすることができ-80℃で数ヶ月のためにtored。グリセロールストックをしていない場合は、オーバーレイアッセイに直接サンプルを使用。
3オーバーレイアッセイ
- 直前に、アプリケーションをオーバーレイオーバーレイ成分を混合する。 15ミリリットルコニカルチューブでは、THYの5ミリリットル、カタラーゼ3,000-4,000 U、およびいずれかその日または室温で解凍し、培養のグリセロールストックを増殖させたオーバーレイ株ブロス培養液200μlを加える。レポーター株を使用する場合は、オーバーレイ混合物にX-galを（40 mg / ml）を50μlを加える。プレートごとに1つの円錐管を使用してください。
- 前の溶融TSAの添加、室温でオーバーレイ混合物を平衡化する。
- インキュベーターから刺した株で、TSAプレートを取り外します。電子レンジで固体TSA溶融状態で使用可能になるまで55℃の水浴させること。 1.5％寒天で溶融し、TSAの3ミリリットルを追加し、混合物をオーバーレイする55℃に冷却した。
- ピペッティングの直前にオーバーレイ混合物を準備し、混合物は非常に固化し始めますすぐに。注：オーバーレイは、めっき前に固化し始めた場合、結果は解釈不可能になります。
- ピペッティングによって、5mlのピペットが混合物中に気泡を導入しないように注意しながら数回上下オーバーレイ混合物を混ぜる。ゆっくりと刺したTSAプレート上に直接オーバーレイの混合物をピペット。寒天を硬化させること数分間ベンチトップ上でプレートを保管してください。
- これはオーバーレイに刺した文化からの成長を引っ張ってくる、オーバーレイ混合物を配布するプレートを回転させないでください。
- 慎重に、5％CO 2、O / N（約16〜18時間）を含む37℃のインキュベーター内にオーバーレイして、TSAプレートを配置。
- 一晩成長させた後、プレートを観察します。プレートは、阻害またはフェロモンシグナルが発生した場所以外のオーバーレイ株の増殖から不透明に表示されます。これらはそれぞれ、刺さ歪み周りクリアまたは青のゾーンのいずれかとして表示されます。
注：なお、MEASUR青色またはクリアリングの直径のements定量的評価のために決定することができ、直径の差は、プレートに刺された細菌の量に依存して変化し得る。オーバーレイアッセイは、任意の定量的評価は慎重に解釈されるべきで、定性的な分析である。陰性対照と比較して目に見えるクリアが活性とみなされる。
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Representative Results
オーバーレイアッセイで2の可能な結果があります。それは、一晩のインキュベーション後に刺した株の増殖を見ることが可能なはずである。 図1Aに、オーバーレイ株が産生されるバクテリオシンに感受性である。クリアランスのゾーンは刺さ歪みを取り巻く可視化することができる。また、オーバーレイ混合物に刺した菌株の旋回が可能であり、 図1Aに見ることができる。 図1Bでは、オーバーレイ株は刺しを囲むハローが存在しないことによって示されるように分泌されるバクテリオシンの影響を受けている。これは、刺さ株はバクテリオシンを分泌しないことも可能である。シグナル伝達アッセイのために、二つの異なる結果が可能である。刺した株は、 図2Aに示すようにX-galでの分解を通して見られるように、オーバレイ株のヒスチジンキナーゼと相互作用するフェロモンを分泌することができる。フェロモンは、転写を活性化していない場合BLPレポーター株における遺伝子座、または刺さ株はフェロモンを分泌していない場合は、 図2（b）に示すように、X-galをブレークダウンが発生しません。
オーバーレイアッセイにおけるBLP媒介阻害と免疫の図1外観。 （A）株P133、バクテリオシンプロデューサーは、TSAプレートにスパイクし、6時間増殖させた。ひずみP250、バクテリオシン陰性株は、オーバーレイに接種した。プレートをO / Nインキュベーション後に撮影した。クリアランス区域は、矢印で示されている。（B）株P133は、TSAプレートにスパイクし、6時間インキュベートした。 blpAにおけるフレームシフト突然変異を含む菌株130は、オーバーレイに接種した。 O / Nインキュベーション後、プレートを写真撮影した。
図2：フェロモンは、アッセイのシグナル伝達にBLP座の活性化を媒介する。 （A）ひずみP133、BLPC型のR6分泌は、TSAプレートにスパイクと6時間インキュベートした。ひずみP981、BLPCにおける欠失を有するBLPC型のR6記者は、オーバーレイに接種した。写真はO / Nインキュベーション後に採取した。（B）P133は、TSAプレートにスパイクした。 6時間のインキュベーション後、P845、BLPCにおける欠失を有するBLPC型P164のレポーターは、オーバーレイに接種した。写真は、O / Nの成長後に採取した。
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Discussion
このオーバーレイアッセイは、バクテリオシンの生産者のための活動の範囲を決定し、肺炎球菌株の間で発生する可能性があり、競争力の相互作用を実証するために迅速な方法です。オーバーレイアッセイは、単一のプレート上にバクテリオシン産生のための複数の株をスクリーニングするために使用するように適合させることができる。私たちは、成功した96ウェルプレートの半分からSBAプレートに接種するために48ピンレプリケーターを使用して、このアッセイと大ひずみコレクションをスクリーニングしました。一晩のインキュベーションの後、成長はレプリケータを使用し、リプリケータのピンとプレートの寒天表面を貫通TSAプレートに移す。
ランチビオティックのような密度依存的に調節されている他の細菌により分泌される抗菌ペプチドはまた、オーバーレイ技術7,12,13を用いて検査することができます。バクテリオシンまたはランチビオティックの精製が困難な場合に特に便利です。上清は、抗微生物について試験することができるものの活動は、培養液中のBLP派生バクテリオシンの発現は、（データは示していない）非常に限られていたり、存在しない。オーバーレイアッセイは、生物が液体中で増殖させた場合に達成されていない、より高い密度に成長することができます。固体培地上での増殖はまた、より密接に鼻咽頭のin vivo成長条件を反映している可能性があります。
オーバーレイアッセイはまた、バクテリオシン特定のシグナリングフェロモンを分泌する刺し株の能力を調べるために使用することができる。これは、フェロモン受容体タンパク質を発現しているフェロモン応答プロモーターがlacZ遺伝子の上流に配置されているレポーター株の構築を必要とする。刺さ株は、オーバーレイ歪みを抑制しない場合は、刺した株によるフェロモン分泌の鑑賞は、BLP軌跡活動の読み出しとして特に有用である。オーバーレイ歪みを抑制することができないことなどのような非機能BLP遺伝子座（の結果である可能性がトランスポーターの変異を有する株）、または分泌されたバクテリオシンは、試験した特定のオーバーレイ株に対して活性ではないので。レポーター株オーバーレイ生産における遺伝子座は完全に機能する2成分系とフェロモンのアップレギュレーションおよび分泌を可能にBlpA輸送体を持っていることを追加情報を提供します。これは、任意のコードされたバクテリオシンでも分泌されることを意味します。
このアッセイにはいくつかの制限があります。異なる株の阻害活性またはフェロモン分泌の間の比較は、慎重に行わなければならないので、オーバーレイアッセイは、定性的なアッセイである。アッセイの結果は、オーバーレイと刺した株の成長率に大きく依存しているため、異なる株を比較した場合の成長率や条件を考慮すべきである。プレートオーバーレイの両方にカタラーゼを添加すると、上の肺炎球菌H 2 O 2産生の阻害効果を除去するために重要であるオーバーレイ株の成長は、特にオーバーレイカタラーゼ陰性生物を使用するとき。肺炎球菌集団内のゲノムのコンテンツの既知の多様性を考えると、このアッセイで見られるあらゆる阻害活性は、自動的に欠失分析することなく、BLP軌跡に起因することはできません。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH2O autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH2O autoclave |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
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