Introduction
肺炎链球菌 ，鼻咽部的多种微生物社会的共同殖民者，能够通过生产细菌产生抗菌肽（细菌素）与其他肺炎球菌和密切相关的物种竞争。每一个完全测序肺炎球菌菌株检测到包含最新版本的B acteriocin- 升 IKE p eptide轨迹，BLP的。细菌素生产由肺炎球菌已被证明是既在体外的结果，并在体内竞争1-4重要。竞争的动力学是由沿与同源免疫蛋白多样的细菌素的表达响应于一个特定的肽信息素的影响。感应的BLP轨迹是由一个群体感应系统，其中的肽信息素，BLPC，结合到传感器激酶，BlpH控制，并开始导致信号级联转录BLP轨迹5,6。有BLPC四个等位基因变异，每绑定到其同源BlpH 6。对于细胞生存其自身细菌素的影响，其编码同源免疫蛋白的基因被转录于同一操纵子作为各细菌的基因。如果竞争者应变是不能够上调BLP轨迹响应于外源信息素，或如菌株缺少所需的保护的特定免疫基因发生杀伤。该转运体复合物，BlpAB是所必需的肽信息素的分泌，加工和细菌的肽2,4。最近，它已被证明，肺炎球菌菌株的显著一部分是“骗子”，这意味着他们在blpA基因，使它们无法分泌信息素和细菌素1,2保守突变。这些菌株能够外感BLPC 2所分泌的嘶鸣回应无聊株允许生产的免疫蛋白。
虽然细菌素，从上清液粗制剂可以从生产者菌株用生化方法步骤，以达到纯度来制备，这种方法是不实用的筛选分离的大的集合，如果细菌素的表达水平是低的肉汤生长培养2,7- 9。覆盖测定法作为一种快速的方法来调查可能存在的在体外的菌株之间的竞争动态。要做到这一点，肺炎球菌菌株是预先接种到琼脂平板，让它生长，以达到局部细菌浓度足以诱导BLP轨迹。第二应变，然后接种到熔融的软琼脂溶液中，然后施加在预接种菌株来测试灵敏度。以评估为BLP轨迹（独立抑制活性）的活性，菌株可与一系列日来覆盖稀土前面所述BLPC记者株。这些菌株被构造成包含三个不同blpH等位基因是由肺炎链球菌分泌的三种最常见的BLPC信息素响应之一。记者菌株具有一个集成的lacZ基因，该基因是一个BlpH依赖的启动子的控制下，并携带的缺失在BLPC基因，防止自励10,11。
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Protocol
1，准备生产菌株的
- 连胜肺炎球菌菌株对细菌生产的5％羊血的胰蛋白酶大豆琼脂从-80°C冰箱个股板块进行测试。
注：该菌株的抑制作用被测试的初期生长，使用血板大大增加了实验的可重复性。此外，其他能产生细菌素的非肺炎球菌菌株可使用虽然生长条件可能需要修改为特定的有机体。我们已经用缓症链球菌和乳酸乳球菌中的覆盖试验成功。 - 在37℃下孵育平板过夜（O / N），用5％的CO 2。
- 该生产菌株的培养后，吹打过氧化氢酶的3000至4000台准备胰酶大豆琼脂（TSA）平板上有25ml的TSA板，并使用无菌玻璃珠流传过氧化氢酶的解决方案。让板干燥下约10分钟生物安全柜。
- 收集细菌的数量明显到一个枪头。刺枪头到TSA的干板。
注：不止一个的生产菌株可捅成一个单一的TSA板。它使得得到的光晕不重叠是很重要的，以空间出来的刺伤。- 如果可能的话，包括已知的细菌素生产的，作为阳性对照，并在覆盖作为阴性对照使用的菌株。
注：阳性和阴性对照是此前已公布，并根据要求提供10。
- 如果可能的话，包括已知的细菌素生产的，作为阳性对照，并在覆盖作为阴性对照使用的菌株。
- 孵育TSA板包含多个刺，在37℃，5％CO 2中6小时。
叠加应变2制作甘油股票
- 备之前，覆盖测定当天甘油原液（培养物中加入甘油后生长至中期指数期，然后保存于-80℃）。接种肺炎球菌的海峡殖民地5-10AIN为敏感或信息素的分泌托德休伊特中有0.5％的酵母提取物（THY）进行测试。
注：BLPC诱导记者，施工已如前所述2株可根据要求提供。 - 孵育5-10殖民地玻璃管用5毫升THY与盖紧盖子在37℃水浴中，不晃动。
- 孵育培养物在37℃，直到它们达到的OD 0.3 620〜0.5。
注意：这将需要大约4-5小时，具体取决于所使用的菌株。- 轻轻翻转试管前测量外径几次。
- 如果实验不能在同一天进行，或者在将来的应变会被多次使用，使甘油原液和恢复试验在稍后的日期。甘油股，加甘油文化的20％的最终浓度。分装到培养的1.5 ml离心管中，并储存在-80℃。注：样品可为stored几个月在-80℃。如果不是在甘油的股票，直接利用样本进行叠加分析。
3，叠加分析
- 之前叠加应用，混合叠加组成部分。在15 mL锥形管，加入5 ml祢，过氧化氢酶3,000-4,000 U和200微升这是不是长大的那一天，或者是在室温下解冻文化的甘油覆盖应变肉汤培养物。如果使用报告菌株，添加50μl的第X-gal的（40毫克/毫升），以覆盖混合物。用一个锥形管，每盘。
- 在室温下平衡，然后加入熔融的TSA的覆盖混合物。
- 从孵化器刺伤应变删除TSA板。熔化的固体TSA微波炉，并保持在55℃水浴中待用。加入熔融TSA 3毫升与1.5％琼脂冷却至55℃以叠加混合物。
- 立即移液之前，请准备叠加混合，混合物会开始凝固很快。注：如果叠加电镀开始之前固化，其结果将是无法解释的。
- 移液器向上和向下几次了500毫升吸管小心不要引入气泡到混合物混合叠加混合物。慢慢的吸液管直接覆盖混合到捅TSA板。保持在台式数分钟使琼脂变硬的板。
- 不要旋转盘来分发叠加混合，这将拉动从被刺的文化发展到覆盖。
- 小心地TSA板覆盖到含有5％的CO 2 O 2 / N（约16-18小时）37℃培养箱中培养。
- 过夜生长后观察平板上。该板块应该会出现在覆盖株生长不透明的，除非发生抑制或信息素信号的地方的地方。这些将分别出现在左右应变刺伤清除或蓝色区域。
注：虽然测量电的蓝色或结算的直径对此语句可以用于定量评估来确定，在直径不同也可取决于细菌的被刺到板的量。覆盖法是一种定性分析，任何定量评估应谨慎解释。任何可见的结算相比于阴性对照被视为活性。
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Representative Results
中有重叠测定两种可能的结果。它应当能够看到被刺菌株生长过夜孵育后。在图1A中，覆盖层的应变是敏感的正在生产的细菌素。间隙的区域可以显现周边刺伤应变。此外，被刺应变到覆盖混合物的旋涡是可能的，并且可以在图1A中可以看出。在图1B中，覆盖应变都难被分泌所指出的不存在包围短截卤代的细菌素。它也有可能是在被刺应变不分泌细菌素。对于信令测定中，两个不同的结果是可能的。该刺伤菌株能够分泌素，与覆盖菌株的组氨酸激酶相互作用，通过第X-gal的击穿看去， 如图2A所示 。如果信息素未激活的转录在报告菌株BLP轨迹，或者如果被刺应变不分泌素，不会发生第X-gal的击穿， 如图2B所示 。
图1，外观BLP介导的抑制与免疫的叠加分析。 （一）应变P133，细菌素生产中掺入到TSA板并使其生长6小时。菌株P250中，细菌素阴性菌株，接种到覆盖。 O 2 / N孵化后板拍照。间隙的区域箭头指示（B）应变P133中掺入到TSA板和保温6小时。菌株130，包含在blpA移码突变，接种到覆盖。 O 2 / N培养后，将板拍照。
图2：信息素介导的激活BLP轨迹的信号检测。 （一）应变P133中，BLPC型R6分泌，被掺入到TSA板和保温6小时。株P981中，BLPC型R6记者与缺失BLPC，接种于覆盖。 O 2 / N孵化后的照片是（B）P133中掺入到TSA的板。培养6小时后，P845中，BLPC型P164记者与缺失BLPC，接种到覆盖。 O 2 / N的增长后的照片拍摄。
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Discussion
这个覆盖测定法是一种快速的方式来确定用于细菌素生产活动的范围，并表明肺炎球菌菌株之间可能出现的竞争性相互作用。覆盖测定法可适于用于筛选多株为细菌素生产上的单个板。我们已通过使用一个48针复制器从一个半到96孔板的接种SBA板成功筛选大应变的集合与该测定。隔夜培养后，成长正在使用的复制和穿孔板与复制的引脚的琼脂表面转移到TSA的板块。
被调节在像羊毛硫抗生素的浓度依赖性其他细菌分泌抗微生物肽也可以使用覆盖技术7,12,13检查。这是当细菌或羊毛硫抗生素的纯化是困难的特别有用的。虽然上清液可用于抗菌测试活性，在培养液的BLP衍生细菌素的表达是非常有限的或不存在（数据未示出）。覆盖测定法允许生长到较高密度未达到时，生物体生长在液体中。在固体培养基上的生长也可能更密切地反映鼻咽的体内生长条件。
覆盖测定法也可用于检查被刺菌株分泌的细菌素的特定信令信息素的能力。这需要结构的报告菌株其表达的信息素受体 蛋白质，并且其中的信息素反应性启动子被放置在lacZ基因的上游。信息素的分泌被刺伤应变升值作为BLP轨迹活性的读出是特别有用的，如果被刺应变不抑制叠加应变。抑制叠加应变无力可能是一个非功能性的BLP轨迹（例如在结果与转运突变株），或者因为分泌的细菌素不积极反对特定的叠加压力测试。记者张力叠加规定，生产者的轨迹有一个全功能的双组分体系和BlpA转运允许上调的信息素分泌更多的信息。这意味着，任何编码细菌素也被分泌出来。
有一些限制该测定。叠加分析是定性的分析中，以便抑制活性或不同品系的信息素的分泌之间的比较，必须小心进行。增长率和条件应比较不同毒株的时候，因为实验的结果在很大程度上依赖于覆盖和刺伤菌株的生长速度加以考虑。在加入过氧化氢 酶以两个板和所述覆盖是重要的，以便消除肺炎球菌H 2 O 2生产上的抑制作用覆盖菌株的生长，特别是当在覆盖使用过氧化氢酶阴性的有机体。定的，在肺炎球菌人口的基因组内容已知的多样性，看到与此测定法的任何抑制活性不能自动归因于BLP轨迹而不缺失分析。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH2O autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH2O autoclave |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
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