Introduction
Streptococcus pneumoniae, en fælles kolonisator af polymikrobiale samfund af nasopharynx, er i stand til at konkurrere med andre pneumokokker og nært beslægtede arter gennem produktion af bakterielt produceret antimikrobielle peptider (bakteriociner). Hvert fuldt sekventeret pneumokok-stamme undersøgt til dato indeholder en version af b acteriocin- l ike p eptide locus BLP. Bakteriocinproduktion af pneumokokker har vist sig at være vigtig i resultatet af både in vitro og in vivo konkurrence 1-4. Konkurrencedynamik påvirkes af ekspressionen af diverse bakteriociner sammen med beslægtede om immunitet proteiner som svar på et specifikt peptid feromon. Induktion af BLP locus styres af et quorum sensing system, i hvilket et peptid feromon, BlpC binder til sensoren kinase, BlpH og initierer en signaleringskaskade resulterer itransskription af BLP locus 5,6. Der er fire allelle variationer af BlpC at hver binder til dets beslægtede BlpH 6. For cellen at overleve virkningerne af sin egen bakteriocin, er de gener, der koder beslægtede immunitet proteiner transkriberet på samme operon som hver af bakteriocin gener. Killing opstår, hvis en konkurrent stamme er ikke i stand til at opregulere BLP locus reaktion på exogent feromon eller, hvis stammen mangler specifik immunitet gen nødvendig for beskyttelsen. Transportøren kompleks er BlpAB kræves til sekretion og behandling af peptidet feromon og bakteriocin peptiderne 2,4. For nylig er det blevet vist, at en betydelig del af pneumokokstammer er "snydere", som betyder at de har en bevaret mutation i blpA gen, som gør dem ude af stand til at udskille feromoner og bakteriociner 1,2. Disse stammer er i stand til at reagere på eksogen BlpC 2 udskilt af vrinskekedelige stammer muliggør produktion med immunitet proteiner.
Selv rå præparater af bakteriociner fra supernatanter kan fremstilles ud fra producentpriserne stammer hjælp biokemiske metoder skridt for at opnå renhed, denne tilgang er ikke nyttigt til screening af store samlinger af isolater, og hvis niveauet af bakteriocinet udtryk er lav i bouillon dyrket kulturer 2,7- 9. Overlapningskonturen analysen bruges som en hurtig måde til at undersøge de konkurrencemæssige dynamik mellem stammer, der kan findes in vitro. For at gøre dette, en pneumokok-stamme er pre-podet på en agarplade og lov til at vokse til at opnå lokale bakterielle koncentrationer er tilstrækkelige til induktion af BLP locus. En anden stamme podes derefter i en smeltet blød agar opløsning, som påføres derefter over præ-inokuleret stamme til at teste for sensitivitet. For at vurdere om aktiviteten af BLP locus (uafhængigt af inhiberende aktivitet), kan stammer overlejres med en række three tidligere beskrevne BlpC reporter stammer. Disse stammer blev konstrueret til at indeholde en af tre forskellige blpH alleler, der reagerer på de tre mest almindelige BlpC feromoner udskilles af pneumokokker. De reporter stammer har en integreret lacZ-gen, der er under kontrol af en BlpH promotor og bære en deletion i blpC gen, der forhindrer selv-stimulering 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Producer Strain
- Træk en pneumokok-stamme, der skal testes for bakteriocinproduktion på en 5% fåreblod tryptisk soja agarplade fra -80 ° C fryseanlæg bestande.
BEMÆRK: Brugen af blodplader til den indledende vækst af stammen, der skal testes for hæmning øger reproducerbarheden af assayet. Derudover kan andre ikke-pneumokok-stammer, der producerer bakteriociner anvendes selv om der kan være nødvendigt at ændre til en specifik organisme vækstbetingelser. Vi har brugt Streptococcus mitis og Lactococcus lactis i overlay-analyse med succes. - Inkubér pladen natten over (O / N) ved 37 ° C med 5% CO2.
- Efter inkubation af producenten stamme, forberede tryptisk soja-agar (TSA) plade ved pipettering 3.000 til 4.000 enheder af katalase på plader, der indeholder 25 ml TSA og sprede katalase løsning med sterile glasperler. Lad pladen tørre i omkring 10 minutter underet biologisk sikkerhedsskab.
- Saml en synlig mængde af bakterier på en pipettespids. Stikke pipettespidsen i den tørrede TSA plade.
BEMÆRK: Mere end én producent stamme kan stukket i en enkelt TSA plade. Det er vigtigt at rummet de stiksår, så følger glorier ikke overlapper hinanden.- Hvis det er muligt, omfatter kendte bakteriocin producent som en positiv kontrol, og stammen, der skal anvendes i overlejringen som en negativ kontrol.
BEMÆRK: Positive og negative kontroller er tidligere er blevet offentliggjort, og er tilgængelige efter anmodning 10.
- Hvis det er muligt, omfatter kendte bakteriocin producent som en positiv kontrol, og stammen, der skal anvendes i overlejringen som en negativ kontrol.
- Inkuber TSA-plade indeholdende flere stiksår ved 37 ° C med 5% CO2 i 6 timer.
2. Gør glycerolstamopløsninger af Overlay Strain
- Forbered glycerolstamopløsninger (dyrket til midt-eksponentielle fase, og derefter lagret ved -80 ° C efter tilsætning af glycerol) forud for dagen for overlay assay. Indpodes 5-10 kolonier af pneumokok strain skal testes for følsomhed eller feromon sekretion i Todd-Hewitt-medium med 0,5% gærekstrakt (THY).
BEMÆRK: Konstruktion af BlpC inducerbare journalister er tidligere blevet beskrevet 2 og stammer er tilgængelige efter anmodning. - Inkubér 5-10 kolonier i glasrør med 5 ml THY med tætsluttende låg i et 37 ° C vandbad uden at ryste.
- Inkuberes kulturerne ved 37 ° C, indtil de når en OD620 på 0,3 til 0,5.
BEMÆRK: Det vil tage ca 4-5 timer afhængigt af den anvendte stamme.- Vend forsigtigt røret et par gange forud for måling af OD.
- Hvis forsøget ikke kan udføres samme dag eller stammen vil blive anvendt flere gange i fremtiden, gør glycerolstamopløsninger og genoptage forsøget på et senere tidspunkt. Til glycerolstamopløsninger tilsættes glycerol til kulturer til en slutkoncentration på 20%. Alikvote kulturer i 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -80 ° C. BEMÆRK: Prøver kan være stored måneder ved -80 ° C. Hvis ikke gør glycerolstamopløsninger, anvende prøverne direkte til overlay analyse.
3. Overlay Assay
- Lige før overlay ansøgning, blande overlay komponenter. I en 15 ml konisk rør, tilsættes 5 ml af Thy 3.000-4.000 U katalase, og 200 pi af overlay stammen bouillon kultur, der enten var dyrket denne dag eller en glycerolstamopløsning af kulturen, som blev optøet ved stuetemperatur. Hvis der anvendes reporter stamme, tilsættes 50 pi X-gal (40 mg / ml) til overlay blanding. Brug en konisk rør pr plade.
- Ækvilibrer overlay blandingen ved stuetemperatur før tilsætning af smeltet TSA.
- Fjern TSA plade med dolket stamme fra inkubatoren. Smelt solid TSA i mikrobølge og holde ved 55 ° C vandbad, indtil klar til brug. Tilsæt 3 ml smeltet TSA med 1,5% agar blev afkølet til 55 ° C til overlay blanding.
- Forbered overlay blanding umiddelbart før pipettering, vil blandingen begynde at størkne megethurtigt. BEMÆRK: Hvis overlæg begynder at størkne før plating, vil resultaterne være at tolke.
- Bland overlay blanding ved pipettering op og ned flere gange med en 5 ml pipette være omhyggelig med ikke at indføre bobler i blandingen. Langsomt pipette overlay blanding direkte på stukket TSA plade. Hold pladen på den stationære for få minutter tillader agar hærde.
- Må ikke rotere pladen til at distribuere overlay blanding, vil dette trække vækst fra stukket af kultur i overlay.
- Forsigtigt TSA plade med overlæg i 37 ° C inkubator indeholdende 5% CO 2 O / N (ca. 16-18 timer).
- Overhold pladerne efter vækst natten. Pladerne skal vises uigennemsigtig fra væksten af overlay stammen undtagen på områder, hvor hæmning eller feromon signalering er opstået. Disse vil fremstå som enten klare eller blå zoner omkring stukket stamme, hhv.
BEMÆRK: Selvom measurements af diameteren af blå eller rydning kan bestemmes for en kvalitativ vurdering, forskelle i diameter kan også variere afhængigt af mængden af bakterier, der blev stukket ned i pladen. Overlay-analysen er en kvalitativ analyse, enhver kvantitativ vurdering bør fortolkes med forsigtighed. Enhver synlig clearing sammenlignet med den negative kontrol betragtes som aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der er to mulige udfald i overlay-analysen. Det bør være muligt at se væksten i stukket stamme efter inkubering natten. I figur 1A, overlay-stammen er følsom over for bakteriociner, der produceres. En frie område kan visualiseres omgiver stukket stamme. Derudover hvirvlende af stukket stamme i overlay blanding er mulig og kan ses i figur 1A. I figur 1B, overlay stammen er immune over for bakteriocinerne bliver udskilt som bemærket af et fravær af en glorie omkring stab. Det er også muligt, at stukket stamme ikke secernerende bakteriociner. For signalering assay er to mulige forskellige resultater. Den stukket stamme er i stand til at udskille feromon der interagerer med histidin kinase overlay stamme, som set gennem nedbrydning af X-gal, som vist i figur 2A. Hvis feromon ikke aktivere transkription afBLP locus reporter stamme, eller hvis stukket stamme ikke udskiller feromon, nedbrydning af X-gal ikke vil forekomme som vist i figur 2B.
Figur 1. Udseende af BLP medieret hæmning og immunitet i en overlay analyse. (A) Stamme P133 blev en bakteriocin producent tilsat til en TSA plade og fik lov til at vokse i 6 timer. Stamme P250, en bakteriocin negativ stamme, blev podet i overlay. Pladerne blev fotograferet efter O / N-inkubation. En frie område er angivet med pilen. (B) Stamme P133 blev tilsat til en TSA plade og inkuberet i 6 timer. Stamme 130 indeholdende en rammeskift mutation i blpA blev inokuleret i overlay. Efter O / N-inkubation blev pladerne fotograferet.
Figur 2. Pheromone medieret aktivering af BLP locus i signalering assay. (A) Stamme P133, en BlpC typen R6 secretor blev tilsat til en TSA plade og inkuberet i 6 timer. Stamme P981, en BlpC typen R6 reporter med en deletion i BlpC, blev podet ind i overlay. Fotografierne blev taget, efter at O / N-inkubation. (B) P133 blev tilsat til en TSA plade. Efter inkubation i 6 timer, P845, en BlpC typen P164 reporter med en deletion i BlpC, blev podet ind i overlay. Fotografier blev taget efter O / N-vækst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne overlay-analysen er en hurtig måde at bestemme området for aktivitet for bakteriocin producenter og demonstrere konkurrencedygtige interaktioner, der kan opstå blandt pneumokokstammer. Overlay-assay kan tilpasses til brug for screening af flere stammer til bakteriocinproduktion på en enkelt plade. Vi har med succes screenet store strain samlinger med dette assay ved anvendelse af en 48-polet replikator at pode SBA plader fra den ene halvdel af en 96-brønds plade. Efter inkubation natten over væksten overføres til TSA pladen ved hjælp af Replicator og piercing agaroverfladen af pladen med stifter af replikator.
Andre bakterielt udskilles antimikrobielle peptider, der er reguleret i en tæthed afhængig måde ligesom lantibiotika kan også undersøges ved hjælp af overlay teknik 7,12,13. Dette er især nyttigt, når rensning af et bakteriocin eller lantibiotikum er vanskelig. Selvom supernatanter kan testes for antimikrobielaktivitet, ekspression af BLP afledte bacteriociner i bouillon er meget begrænset eller ikke-eksisterende (data ikke vist). Overlay-analysen giver mulighed for vækst på et højere tæthed, som ikke opnås, når organismer dyrkes i væske. Vækst på et fast medium måske også bedre afspejler de betingelser in vivo af nasopharynx vækst.
Overlay-analyse kan også anvendes til at undersøge evnen af stukket stamme til at udskille bakteriocin signalering feromon. Dette kræver konstruktion af en reporter stamme, som udtrykker feromon-receptor-proteinet, og hvor en feromon responsiv promotor er placeret opstrøms for lacZ-genet. Vurdering af feromon sekretion af et stukket stamme er særligt anvendelige som en udlæsning af BLP locus aktivitet, hvis den stukket stamme ikke hæmmer overlay stamme. Den manglende evne til at inhibere overlay stammen kunne være resultatet af en ikke-funktionel BLP locus (såsom i etstamme med en transportør mutation) eller fordi bakteriocinerne udskilte ikke er aktive mod den pågældende overlay stamme testet. Journalisten stammen overlay giver yderligere oplysninger, som det locus i producenten har et fuldt funktionelt to-komponent system, og BlpA transportør giver mulighed for opregulering og udskillelse af feromon. Dette indebærer, at alle kodede bakteriociner også udskilles.
Der er visse begrænsninger i dette assay. Overlay-analysen er en kvalitativ analyse, så sammenligninger mellem den inhibitoriske aktivitet eller feromon sekretion af forskellige stammer skal foretages omhyggeligt. Vækstrater og betingelser bør overvejes, når man sammenligner forskellige stammer, fordi resultatet af analysen er stærkt afhængig af vækstraten for overlay og stak stammer. Tilsætning af katalase til både pladen og overlay er vigtig for at fjerne de inhiberende virkninger af pneumokok H2O 2-produktion påvækst i overlay-stammen, især når du bruger katalase negativ organisme i overlay. Da den kendte mangfoldighed af genomisk indhold i pneumokok befolkning enhver inhiberende aktivitet set med denne analyse ikke automatisk kan tilskrives BLP locus uden deletionelle analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH2O autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH2O autoclave |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
- Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
- Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
- Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
- Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
- Saizieu, A., et al. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide. J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).
- Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10. PLoS One. 8 (10), 77751 (2013).
- Wladyka, B., et al. Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).
- Shea, E. F., et al. Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity. 4 (6), 00498-00413 (2013).
- Son, M. R., et al. Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters. MBio. 2 (5), (2011).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).
- Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
- Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).
