Introduction
Streptococcus pneumoniae, eine gemeinsame Kolonisator des polymikrobiellen Gemeinschaft des Nasenrachenraums, ist in der Lage, mit anderen Pneumokokken und eng verwandten Arten durch die Produktion von bakteriell produzierten antimikrobiellen Peptide (Bacteriocine) konkurrieren. Jeder vollständig sequenzierten Pneumokokken-Stamm bis heute untersucht enthält eine Version des b acteriocin- l ike p eptide Ort, BLP. Bacteriocin-Produktion durch Pneumokokken nachgewiesen wurde im Ergebnis der in vitro und in vivo Konkurrenz 1-4 wichtig. Wettbewerbsdynamik werden durch die Expression von verschiedenen Bakteriozine zusammen mit verwandten Proteinen Immunität in Reaktion auf eine spezifische Peptid-Pheromon beeinflusst. Induktion der BLP-Locus durch ein Quorum Sensing System, bei dem ein Peptid-Pheromon, BLPC, bindet an das Sensorkinase, BlpH gesteuert und löst eine Signalkaskade, was zu derTranskription des BLP Locus 5,6. Es gibt vier allelische Variationen BLPC dass jede Bindung an seinen zugehörigen BlpH 6. Für die Zelle, die Auswirkungen seiner eigenen Bakteriocin überleben, werden die Gene, die Proteine kodieren verwandten Immunität auf der gleichen Operon wie jede der Bakteriocin-Genen transkribiert. Tötung tritt auf, wenn ein Teilnehmer-Stamm ist nicht in der Lage, die BLP-Locus in Antwort auf exogene Pheromon hochregulieren oder, wenn der Stamm fehlt die spezifische Immunität Gen zum Schutz benötigt. Der Transporter-Komplex, BlpAB ist für die Sekretion und Prozessierung des Peptids Pheromon und Bakteriocin-Peptide 2,4 erforderlich. Kürzlich wurde gezeigt, dass ein signifikanter Anteil der Pneumokokken-Stämme "Betrüger" bedeutet, dass sie eine Mutation im konservierten blpA Gen, das sie nicht in der Lage Pheromone und Bakteriozine 1,2 sezer macht haben. Diese Stämme sind in der Lage, auf exogene BLPC 2 durch Wiehern sezerniert reagierenBohren Stämme so dass für die Herstellung von Proteinen Immunität.
Obwohl rohe Zubereitungen von Bakteriozine aus Überständen aus Produktionsstämme mit biochemischen Methoden vor, um Reinheit zu erzielen, hergestellt werden, ist dieser Ansatz nicht nützlich für das Screening von großen Sammlungen von Isolaten und wenn der Pegel des Bakteriocin Expression niedrig in Brühe gewachsenen Kulturen 2,7 9. Die Overlay-Assay ist als schnelle Möglichkeit, die Wettbewerbsdynamik zwischen den Stämmen, die in vitro zu untersuchen existieren können verwendet. Um dies zu tun, ist eine Pneumokokken-Stamm vorgeimpft auf einer Agar-Platte und erlaubt, zu wachsen, um lokale Bakterienkonzentrationen ausreichend für die Induktion des BLP Ort zu erreichen. Ein zweiter Stamm wird dann in einem geschmolzenen weichen Agar-Lösung, die dann über die vorgeimpft Stamm zur Empfindlichkeitstest wird angewendet, inokuliert. Um die Aktivität der BLP-Locus (unabhängig von der Inhibitoraktivität) zu bewerten, können Stämme mit einer Reihe von th lagert werdenree zuvor beschriebenen BLPC Reporter-Stämme. Diese Stämme wurden konstruiert, um eine von drei verschiedenen blpH Allele, die zu den drei häufigsten BLPC Pheromone vom Pneumokokken sezerniert antworten enthalten. Die Reporterstämme haben einen integrierten lacZ-Gen, das unter der Kontrolle eines BlpH abhängigen Promotor ist und tragen eine Deletion im Gen, das BLPC Selbststimulation 10,11 verhindert.
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Protocol
1. Vorbereitung der Produzentenstammes
- Streak eine Pneumokokken-Stamm für Bakteriozin Produktion auf einem 5% Schafblut CASO-Agar Platte von -80 ° C Gefrierschrank Aktien getestet werden.
HINWEIS: Die Verwendung von Blut-Platten für das anfängliche Wachstum des Stammes zu Inhibitionstest erhöht die Reproduzierbarkeit des Tests. Zusätzlich können andere nicht-Pneumokokken-Stämme, die Bakteriozine verwendet werden, obwohl die Wachstumsbedingungen müssen für einen bestimmten Organismus verändert werden. Wir haben Streptococcus mitis und Lactococcus lactis in der Overlay-Assay erfolgreich eingesetzt. - Inkubieren der Platte über Nacht (O / N) bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Nach der Inkubation des Produzentenstammes, bereiten Sie die CASO-Agar (TSA) Platte durch Pipettieren von 3.000 bis 4.000 Einheiten Katalase auf Platten mit 25 ml TSA und die Ausbreitung der Katalase-Lösung mit sterilen Glasperlen. Lassen Sie die Platte trocken für etwa 10 min untereinem biologischen Sicherheitsschrank.
- Sammeln Sie eine sichtbare Menge von Bakterien auf einer Pipettenspitze. Stechen die Pipettenspitze in die getrocknet TSA Platte.
HINWEIS: Mehr als ein Produktionsstamm können in einem einzigen TSA Platte erstochen werden. Es ist wichtig, Raum aus, so dass die Stichverletzungen resultierenden Halos nicht überlappen.- Wenn möglich, Bakteriozin Produzent bekannt als eine positive Kontrolle und der Stamm in der Überlagerung als Negativkontrolle verwendet werden.
HINWEIS: Positive und negative Kontrollen sind zuvor veröffentlicht und sind auf Anfrage erhältlich 10.
- Wenn möglich, Bakteriozin Produzent bekannt als eine positive Kontrolle und der Stamm in der Überlagerung als Negativkontrolle verwendet werden.
- Inkubieren TSA-Platte, die mehrere Stichverletzungen bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 6 Stunden.
2. Erstellen Glycerol Stocks des Overlay Dehnungs
- Glycerin-Stammlösungen herzustellen (Kulturen mittleren exponentiellen Phase nach Zugabe von Glycerin gezüchtet und dann bei -80 ° C gelagert) vor dem Tag des Overlay-Assay. Impfen 5-10 Kolonien von Pneumokokken-strain für Empfindlichkeit oder Pheromon-Sekretion in Todd-Hewitt-Medium mit 0,5% Hefeextrakt (THY) getestet werden.
HINWEIS: Der Bau der BLPC induzierbaren Reporter ist bereits beschrieben worden und 2 Stämme sind auf Anfrage erhältlich. - Mit 5 ml THY mit fest geschlossenen Deckel in einem 37 ° C Wasserbad inkubieren 5-10 Kolonien in Glasröhrchen ohne Schütteln.
- Kulturen bei 37 ° C inkubieren, bis sie eine OD 620 zu erreichen von 0,3 bis 0,5.
HINWEIS: Diese wird ca. 4-5 Stunden dauern, abhängig von der Belastung eingesetzt.- Invertieren Sie das Röhrchen vorsichtig ein paar Mal vor der Messung der OD.
- Wenn das Experiment kann nicht am selben Tag durchgeführt werden, oder die Belastung wird mehrfach in der Zukunft genutzt werden, stellen Glycerin Aktien und wieder den Versuch zu einem späteren Zeitpunkt. Für Glycerinstamm Fügen Glycerin Kulturen bis zu einer Endkonzentration von 20%. Aliquoten Kulturen in 1,5 ml Reaktionsgefäße und bei -80 ° C. HINWEIS: Die Proben können sMonate bei -80 ° C überwacht. Wenn nicht machen Glycerin Aktien, verwenden Proben direkt für Overlay-Assay.
3. Overlay Assay
- Kurz vor der Anwendung zu überlagern, mischen Sie die Overlay-Komponenten. In einem 15 ml konischen Röhrchen, 5 ml THY, 3.000-4.000 U Katalase und 200 ul der Overlay-Stamm Bouillonkultur, die entweder gewachsen war, wurde an diesem Tag oder ein Glycerin Lager der Kultur, die bei Raumtemperatur aufgetaut wurde. Bei Verwendung der Reporter-Stamm, werden 50 ul X-Gal (40 mg / ml) zu dem Überlagerungsmischung. Verwenden Sie eine konische Röhrchen pro Platte.
- Äquilibrieren Overlay Mischung bei Raumtemperatur vor der Zugabe des geschmolzenen TSA.
- Entfernen TSA-Platte mit erstochen Belastung von Inkubator. Schmelzen festen TSA in Mikrowelle und halten bei 55 ° C Wasserbad bis zur Verwendung. 3 ml geschmolzenem TSA mit 1,5% Agar und 55 ° C abgekühlt, um Mischung zu überlagern.
- Bereiten Sie die Overlay-Gemisch unmittelbar vor dem Pipettieren wird die Mischung beginnt zu sehr verfestigenschnell. HINWEIS: Wenn die Überlagerung beginnt vor Beschichtung verfestigt, werden die Ergebnisse nicht interpretierbar sein.
- Mischen Sie die Mischung durch Overlay-und Abpipettieren mehrmals mit einer 5 ml Pipette man aufpassen, nicht zu Blasen in die Mischung einführen. Langsam pipettieren Overlay Mischung direkt auf die Platte TSA erstochen. Halten Sie die Platte auf dem Labortisch für wenige Minuten und ermöglicht es der Agar zu verhärten.
- Die Platte, um die Overlay-Mischung verteilen nicht drehen, wird dieses Wachstum von der erstochen Kultur in den Überlagerungs ziehen.
- Vorsichtig TSA-Platte mit Overlay in 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2 O / N (ca. 16-18 h).
- Beachten Sie die Platten nach Wachstum über Nacht. Die Platten sollten nur in Bereichen, in denen die Hemmung oder Pheromonsignal aufgetreten undurchsichtig vom Wachstum des Overlay-Belastung angezeigt. Diese werden als entweder klar oder blau Zonen rund um den Stamm erscheinen erstochen auf.
HINWEIS: Obwohl Messements der Durchmesser der blau oder Clearing zur quantitativen Beurteilung bestimmt werden kann, Unterschiede in der Durchmesser kann auch in Abhängigkeit von der Menge der Bakterien, die in die Platte gestochen wurde, abhängig. Die Overlay-Assay ist ein qualitativer Test, jede quantitative Bewertung sollte mit Vorsicht interpretiert werden. Jede sichtbare Lichtung im Vergleich zur Negativkontrolle wird als Aktivität angesehen.
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Representative Results
Es gibt zwei mögliche Ergebnisse in der Overlay-Assay. Es sollte möglich sein, das Wachstum des Stammes erstochen nach Inkubation über Nacht zu sehen. In 1A ist die Overlay-Stamm empfindlich für die Bakteriocine produziert. Ein Freiraum visualisiert die Belastung erstochen Umgebung werden. Zusätzlich ist Verwirbelung der gestochen Belastung in den Überlagerungsmischung möglich ist und in der Figur 1A zu sehen ist. In 1B ist die Overlay-Stamm immun gegen die Bakteriozine sezerniert, wie durch das Fehlen von einem Halo um das stab angegeben. Es ist auch möglich, dass der Stamm nicht stachen sezer Bakteriozine. Für die Signalisierung Assay zwei verschiedene Ergebnisse möglich. Die gestochen Stamm in der Lage ist, das Pheromon mit der Histidin-Kinase des Overlay-Stamm zusammenwirkt, wie durch den Abbau von X-gal zu sehen, wie in 2A gezeigt, zu sezernieren. Wenn das Pheromon nicht die Transkription aktivierenBLP-Locus in dem Reporter-Stamm, oder wenn die Belastung nicht stachen sezer Pheromon, Ausfall von X-gal nicht auftreten wird, wie in 2B gezeigt.
Abbildung 1. Aussehen von BLP vermittelte Hemmung und Immunität in einem Overlay-Assay. (A) Der Stamm P133, ein Bakteriozin Produzent wurde in ein TSA Platte versetzt und für 6 Stunden wachsen. Stamm P250, ein Bakteriozin negativen Stamm wurde in den Überlagerungs geimpft. Platten wurden nach O / N Inkubation fotografiert. Ein Freiraum wird durch den Pfeil angezeigt. (B) Dehnungs P133 wurde in ein TSA Platte versetzt und für 6 Stunden inkubiert. Stamm 130, enthält eine Frameshift-Mutation in blpA, wurde in das Overlay eingeimpft. Nach O / N Inkubation wurden die Platten fotografiert.
Abbildung 2. Pheromone vermittelte Aktivierung von BLP Locus in Signalisierungstest. (A) Der Stamm P133, ein BLPC Typ R6 Sekretor, wurde in ein TSA Platte versetzt und für 6 Stunden inkubiert. Stamm P981, ein BLPC Typ R6-Reporter mit einer Deletion in BLPC, wurde in das Overlay eingeimpft. Fotografien wurden nach O / N Inkubation genommen. (B) P133 wurde in ein TSA Platte versetzt. Nach einer Inkubationszeit von 6 Stunden, P845, P164 ein BLPC Typ Reporter mit einer Deletion in BLPC, wurde in das Overlay eingeimpft. Fotografien wurden nach O / N Wachstum gemacht.
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Discussion
Das Overlay-Assay ist ein schneller Weg, um den Bereich der Tätigkeit für Bakteriozin Hersteller zu ermitteln und Wettbewerbs Wechselwirkungen, die unter Pneumokokken-Stämme auftreten können, zu demonstrieren. Die Overlay-Assay lässt sich an für das Screening mehrere Stämme für Bakteriozin Produktion auf einer einzigen Platte zu verwenden. Wir haben erfolgreich große Stammsammlungen mit diesem Test mit Hilfe eines 48-Pin-Replikator an SBA-Platten von einer Hälfte einer 96-Well-Platte zu impfen gescreent. Nach Inkubation über Nacht wird das Wachstum auf der Platte mit der TSA-Replikator und Durchstechen der Agar-Oberfläche der Platte mit den Stiften der Replikator übertragen.
Andere bakteriell sezernierte antimikrobielle Peptide, die in einer Dichte abhängigen Weise wie Lantibiotica geregelt werden, können auch mit Hilfe der Overlay-Technik 7,12,13 untersucht werden. Dies ist besonders nützlich, wenn die Reinigung eines Bakteriocin oder Lantibiotika ist schwierig. Obwohl die Überstände können für antimikrobielle getestet werdenAktivität, ist Ausdruck der BLP abgeleitet Bacteriocine in Brühe sehr begrenzt oder gar nicht vorhanden (Daten nicht gezeigt). Die Overlay-Assay ermöglicht Wachstum zu einer höheren Dichte, die nicht erreicht wird, wenn Organismen in flüssiger gewachsen. Wachstum auf einem festen Medium kann auch genauer die in vivo-Wachstumsbedingungen des Nasopharynx reflektieren.
Die Overlay-Assay kann auch verwendet werden, um die Fähigkeit des Stammes, die gestochen Bakteriocin spezifischen Signalisierungs Pheromon sezer untersuchen. Dies erfordert Konstruktion eines Reporter-Stamm, der die Pheromonrezeptor-Protein exprimiert und in der ein Pheromon ansprechenden Promotor stromaufwärts des lacZ-Gens angeordnet. Würdigung Pheromon-Sekretion durch ein gestochen Stamm ist besonders nützlich als eine Auslese von BLP-Locus-Aktivität, wenn die Belastung nicht stachen das Overlay Stammes zu hemmen. Die Unfähigkeit, die Overlay-Stamm hemmen könnte das Ergebnis eines nicht-funktionellen BLP-Locus (wie in einem Be-Stamm mit einem Transporter-Mutation), oder weil die Bacteriocine sezerniert sind nicht gegen die insbesondere Overlay-Stamm getestet aktiv. Die Reporterstamm Overlay bietet zusätzliche Informationen, dass der Ort in der Hersteller hat eine voll funktionsfähige Zwei-Komponenten-System und BlpA Transporter so dass für die Hochregulation und Sekretion des Pheromons. Dies bedeutet, dass alle codierten Bakteriozine auch sezerniert.
Es gibt einige Einschränkungen bei diesem Assay. Die Overlay-Assay ist ein qualitativer Test, so Vergleiche zwischen der inhibitorische Aktivität oder Pheromon-Sekretion verschiedener Stämme müssen sorgfältig vorgenommen werden. Wachstumsraten und Bedingungen sollten beim Vergleich verschiedener Stämme, weil das Ergebnis des Tests stützt sich stark auf die Wachstumsrate des Overlay und stach Stämme werden. Die Zugabe von Katalase sowohl der Platte und der Überlagerung ist wichtig, um die hemmende Wirkung der Pneumokokken-H 2 O 2-Produktion auf die entfernenWachstum der Overlay-Stamm, insbesondere bei Verwendung von Katalase negativ Organismus in der Überlagerung. Angesichts der bekannten Vielfalt von genomischer Gehalt in der Pneumokokken-Population, einem inhibitorischen Aktivität diesen Test gesehen nicht automatisch in die BLP-Locus ohne Deletions-Analyse zurückzuführen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH2O autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH2O autoclave |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
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